Summary
Мы разработали единую платформу для отслеживания поведения животных во время двух альпинистских ассоциативных учебных задач. Недорогая конструкция позволяет интегрироваться с оптогенетическими или визуальными экспериментами, направленными на восхождение на волокнистую мозжечковую активность.
Abstract
Подъем волоконных входов в клетки Пуркинье обеспечивает поучительные сигналы, критически важные для ассоциативного обучения, зависящего от мозжечка. Изучение этих сигналов у мышей с фиксированной головой облегчает использование методов визуализации, электрофизиологических и оптогенетических методов. Здесь была разработана недорогая поведенческая платформа (~$1000), которая позволяет отслеживать ассоциативное обучение у мышей с фиксированной головой, которые свободно перемещаются на ходовом колесе. Платформа включает в себя две общие ассоциативные парадигмы обучения: кондиционирование моргания глаз и отсроченное тактильное обусловливание испуга. Поведение отслеживается с помощью камеры, а движение колеса - детектором. Мы описываем компоненты и настройку, а также предоставляем подробный протокол для обучения и анализа данных. Эта платформа позволяет включать оптогенетическую стимуляцию и флуоресцентную визуализацию. Конструкция позволяет одному хост-компьютеру управлять несколькими платформами для обучения нескольких животных одновременно.
Introduction
Павловское обусловливание субсекундной связи между стимулами для получения условного ответа уже давно используется для зондирования мозжечково-зависимого обучения. Например, при классическом обусловливании задержки моргания глаз (DEC) животные учатся делать своевременное защитное моргание в ответ на нейтральный условный стимул (CS; например, вспышка света или слуховой тон), когда он многократно сочетается с безусловным стимулом (США; например, затяжка воздуха, приложенная к роговице), которая всегда вызывает рефлекторное моргание, и который приходит в конце или ближе к концу CS. Выученный ответ называется условным ответом (CR), в то время как рефлекторный ответ называется безусловным ответом (UR). У кроликов мозжечкоспецифические поражения нарушают эту форму обучения 1,2,3,4. Кроме того, шипы клеточного комплекса Пуркинье, приводимые в движение их подъемными волоконными входами5, обеспечивают необходимый сигнал 6,7 и достаточныйсигнал 8,9 для получения правильно синхронизированных CR.
Совсем недавно для мышей с фиксированной головой были разработаны парадигмы ассоциативного обучения, зависящие от волокон. DEC была первой ассоциативной парадигмой обучения, адаптированной к этой конфигурации10,11. DEC у мышей с фиксированной головой была использована для идентификации мозжечковыхобластей 11,12,13,14,15,16,17 и элементов цепи11,1 2,13,14,15,18,19 которые необходимы для приобретения и уничтожения задач. Этот подход также был использован для демонстрации того, как физиологическое представление параметров задачи на клеточном уровне развивается с обучением 13,15,16.
В дополнение к морганию глаз, парадигма отсроченного тактильного кондиционирования испуга (DTSC) была недавно разработана в качестве новой ассоциативной учебной задачи для мышей с фиксированной головой20. Концептуально похожий на DEC, DTSC включает в себя представление нейтрального CS с США, нажатие на лицо, достаточное по интенсивности, чтобы задействовать рефлекс испуга21,22 в качестве UR. В парадигме DTSC и UR, и CR считываются как обратная локомоция на колесе. В настоящее время DTSC используется для раскрытия того, как ассоциативное обучение изменяет мозжечковую активность и паттерны экспрессии генов20.
В этой работе был разработан метод гибкого применения DEC или DTSC в единой платформе. Атрибуты стимула и платформы схематизированы на рисунке 1. Конструкция включает в себя возможность отслеживать поведение животных с помощью камеры, а также поворотный энкодер для отслеживания передвижения мыши на колесе. Все аспекты регистрации данных и структуры испытаний контролируются парными микроконтроллерами (Arduino) и одноплатным компьютером (SBC; Малина Пи). Доступ к этим устройствам можно получить через предоставленный графический интерфейс пользователя. Здесь мы представляем рабочий процесс для настройки, подготовки и выполнения эксперимента, а также настраиваемый конвейер анализа для визуализации данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протоколы для животных, описанные здесь, были одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Принстонского университета.
1. Настройка SBC
- Подключите кабель последовательного интерфейса камеры (CSI) к камере Raspberry NoIR V2 и порту камеры на SBC.
- Загрузите операционную систему для SBC на хост-компьютер. Запишите образ операционной системы на микрозащищенную цифровую карту (microSD).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по этим процедурам для Raspberry Pi SBC можно найти в другом месте23. Система была протестирована с использованием следующих операционных систем: Stretch, Buster, Bullseye. - Чтобы обеспечить безопасную связь оболочки, создайте файл без расширения под названием «ssh» в загрузочном разделе карты microSD. Как только это будет сделано, извлеките карту microSD из хост-машины и вставьте ее в слот для картЫ SBC microSD. Включите SBC, подключив его блок питания.
- Подготовьте SBC для принятия проводного подключения к узлу.
- Подключите монитор соответствующим кабелем к SBC. Откройте терминал, введите команду ifconfig и запишите IP-адрес Ethernet SBC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Raspberry Pi модель 3B + имеет порт дисплея HDMI, в то время как модель 4B имеет порт micro-HDMI. - Перейдите на вкладку Интерфейс параметра конфигурации Raspberry Pi и включите параметры Камера, протокол SSH и Виртуальные сетевые вычисления (VNC).
- Подключите монитор соответствующим кабелем к SBC. Откройте терминал, введите команду ifconfig и запишите IP-адрес Ethernet SBC.
- Установите проводное соединение между главным компьютером и SBC.
- Подключите кабель Ethernet к порту Ethernet на SBC и главном компьютере. Подключите другой конец этих кабелей к коммутатору Ethernet.
- Используйте вычислительный клиент виртуальной сети, такой как VNC viewer24 , и получите доступ к рабочему столу, используя IP-адрес SBC и аутентификацию по умолчанию (пользователь = "pi", пароль = "raspberry").
- Загрузите необходимое программное обеспечение, включенное в шаги протокола.
ВНИМАНИЕ: Измените имя пользователя и пароль по умолчанию, чтобы предотвратить несанкционированный доступ к SBC.- Введите следующую команду в терминале SBC, чтобы загрузить программное обеспечение буровой установки:
git clone --depth=1 https://github.com/gerardjb/assocLearnRig - Введите следующие команды, чтобы загрузить необходимые библиотеки python.
cd assocLearnRig
python3 setup.py - Чтобы обеспечить прямой контроль над микроконтроллером, подключитесь к SBC и загрузите интегрированную среду разработки микроконтроллера (IDE), выполнив шаги 1.6.4-1.6.7.
- Откройте веб-браузер на рабочем столе SBC и перейдите к https://arduino.cc/en/software. Загрузите последнюю версию 32-разрядной версии интегрированной среды разработки Linux ARM.
- Откройте окно терминала на рабочем столе SBC и перейдите в каталог загрузок, набрав cd Downloads/
- Чтобы установить среду IDE, введите в терминале следующие команды:
tar -xf arduino--linuxarm.tar.xz
sudo mv arduino-/opt
sudo /opt/arduino-/install.sh
(здесь <версия> — это версия загруженной среды IDE) - Откройте экземпляр среды IDE микроконтроллера на рабочем столе SBC. Выберите пункт меню Инструменты > Управление библиотеками. Установите библиотеку "Encoder" от Пола Стоффрегена.
- Введите следующую команду в терминале SBC, чтобы загрузить программное обеспечение буровой установки:
- Разверните узел встроенной памяти SBC с помощью флэш-накопителя USB.
- Вставьте флэш-накопитель в USB-порт на SBC. Используйте порт USB 3.0, если таковой имеется.
- Введите в терминал ls -l /dev/disk/by-uuid/ , чтобы найти флэш-накопитель и его уникальный справочник (UUID). Запишите UUID.
- Чтобы разрешить пользователю pi выполнять запись на USB-устройство, введите в терминал одну за другой следующие команды:
sudo mkdir /media/usb
sudo chown -R pi:pi /media/usb
sudo mount /dev/sda1 /media/usb -o uid=pi,gid=pi
ПРИМЕЧАНИЕ: Флэш-накопитель можно добавить в качестве устройства, которое будет автоматически монтироваться при перезапуске SBC, добавив следующую строку в конец файла fstab в /etc/fstab:
UUID=/media/usb vfat auto,nofail,noatime,users,rw,uid=pi,gid=pi 0 0
2. Проводка стимулирующего оборудования и этап сборки
- Подключите и подготовьте микроконтроллеры.
- Подключите SBC к программному порту микроконтроллера (Arduino Due) с помощью микрокабеля USB2 типа A к USB2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте высококачественный кабель, такой как продукт в таблице материалов, чтобы обеспечить надлежащую работу. - Найдите "dueAssocLearn.ino" в загруженном репозитории проекта. Откройте эскиз с помощью среды IDE микроконтроллера и загрузите его в микроконтроллер, подключенный к SBC.
- Загрузите и установите соответствующую версию arduino IDE на главном компьютере.
- Подключите хост-компьютер к микроконтроллеру (Arduino Uno) с помощью кабеля USB2 типа B к USB2 типа A.
- Перейдите в репозиторий GitHub (https://github.com/gerardjb/assocLearnRig) и загрузите эскиз "DTSC_US.ino" на главный компьютер.
- На главном компьютере запустите среду IDE микроконтроллера и откройте эскиз «DTSC_US.ino», а затем загрузите его в микроконтроллер.
- Подключите SBC к программному порту микроконтроллера (Arduino Due) с помощью микрокабеля USB2 типа A к USB2.
- Прикрепите провода к микроконтроллерам, макетной плате, светодиодам, поворотному энкодеру, шаговому двигателю с драйвером и электромагнитному клапану с драйвером, как показано на диаграмме Фритцинга на рисунке 2.
- Питание шагового двигателя и электромагнитного клапана.
- Правильно подключите один канал питания к контактам +V и GND драйвера шагового двигателя.
- Включите блок питания и установите напряжение подключенного канала на 25 В.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если соединения между шаговым двигателем, драйвером и блоком питания настроены правильно, зеленый индикатор на драйвере шагового двигателя включится. - Правильно подключите положительный провод блока питания к контакту напряжения драйвера электромагнитного клапана, а другой положительный провод к контакту напряжения всплеска.
- Прикрепите отрицательные провода к земле, разделяемой с управляющим сигналом.
- Включите источник питания и установите канал, подключенный к удержающему напряжению, примерно на 2,5 В, а канал, подключенный к пиковому напряжению, составит около 12 В.
- Подключите источник воздуха, регулируемый давлением ~20 PSI, к электромагнитному клапану с помощью адаптера luer.
- Проверьте, что все стимулирующие компоненты и камера функционируют должным образом.
- Откройте терминал на SBC и введите cd ~/assocLearnRig , чтобы перейти к клонированному репозиторию GitHub.
- В терминале введите python3 assocLearnRig_app.py для запуска графического интерфейса пользователя элемента управления.
- Запустите трансляцию с камеры, нажав кнопку Поток .
- Выберите переключатель DEC , загрузите его в микроконтроллер и запустите сеанс с параметрами по умолчанию, нажав кнопку Начать сеанс .
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага в терминале должна появиться распечатка журнала данных, сообщение о потоке камеры должно исчезнуть, а светодиодный CS и электромагнитный клапан US должны включаться и выключаться в соответствующее время во время каждого испытания. - После завершения сеанса повторите предыдущие шаги с выбранным переключателем DTSC .
ПРИМЕЧАНИЕ: Эскизы в репозитории GitHub ("testStepper.ino", "testRotary.ino" и "testSolenoid.ino") можно использовать для тестирования отдельных компонентов, если описанные выше шаги не дают удовлетворительных результатов.
- Сделайте ходовое колесо.
- Вырежьте 3-дюймовое колесо из поролонового ролика. Просверлите отверстие 1/4 дюйма в точном центре колеса, чтобы колесо не колебалось при повороте от движения мыши.
- Вставьте вал 1/4" в колесо и закрепите его на месте с помощью зажимных ступиц, расположенных с каждой стороны колеса.
- Прикрепите поворотный энкодер к 4,5-дюймовому алюминиевому каналу с помощью болта M3. Стабилизируйте алюминиевый канал на алюминиевой макетной плате с помощью прямоугольного кронштейна с болтом 1/4 дюйма, гайкой и шайбой, как показано на рисунке.
- Прикрепите колесо и поворотный энкодер с помощью втулки муфты вала.
- Стабилизируйте свободную сторону вала колеса с помощью подшипника, вставленного в прямоугольный торцевой зажим, установленный на макетном оптическом столбе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что колесо вращается свободно, не колеблясь при вращении вручную. - Расположите стимулирующее оборудование, подголовник, инфракрасную световую решетку и пикамеры вокруг собранного колеса.
- Расположите подголовники с помощью оптических стоек и зажимов прямого угла наклона таким образом, чтобы головные упоры находились на расстоянии 1,5 см перед осью колеса и на 2 см над поверхностью колеса. (Значения указаны для мыши весом 20 г).
- Расположите светодиод CS и выпускное отверстие электромагнитного клапана, используемое для DEC US, менее чем на 1 см от глаза, используемого для DEC.
- Установите шаговый двигатель, используемый для DTSC US
- Установите пикамеру на оптический столб ~ 10 см от того места, где будет находиться животное.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн для крепления picamera может быть сделан на 3D-принтере из файла в "RaspPiCamMount1_1.stl" в репозитории GitHub. - Поместите инфракрасный световой массив немного выше и непосредственно лицом к положению лица на той же стороне, что и пикамеры.
- Сделайте тактильный стимул для DTSC, приклеив пену к краю куска акрила, установленного на валу 1/4 дюйма с помощью зажимной ступицы. Прикрепите тактильный стимул к валу шагового двигателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн для акрилового изделия может быть вырезан лазером по шаблону в "TactileStimDesign.pdf" в репозитории GitHub.
3. Подготовка и проведение экспериментов по поведению
- Имплантация головной пластины мыши.
- Обезболить мышь с помощью 2% изофлурана и зафиксировать голову в стереотаксическом кадре.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза.
- Побрейте кожу головы мыльной водой и стерильным скальпелем. Вводят лидокаин непосредственно под кожу места разреза и очищают хирургический участок повидоном.
- Сделайте разрез скальпелем вдоль средней линии волосистой части головы от заднего края глаз до заднего края черепа, стараясь не надавить слишком сильно на череп.
- Разложите разрез и зажмите обе стороны стерильными гемостатами, чтобы держать его открытым. Аккуратно удалите надкостницу с помощью ватного тампона, смоченного в этаноле, и дайте поверхности обнаженного черепа высохнуть.
- Расположите головную пластину на уровне черепа, убедившись, что передняя часть головной пластины расположена сзади от глаз. Используйте цианоакрилатный клей, чтобы прикрепить головную пластину к черепу и дать клею полностью высохнуть.
- Смешайте зубной цементный порошок (1 мерная ложка), растворитель (2 капли) и катализатор (1 капля) в смесительной посуде и нанесите на все участки открытой кости. Добавляйте слои до тех пор, пока поверхность не станет заподлицо с верхним краем головной пластины, убедившись, что головная пластина надежно прикреплена к черепу.
- При необходимости зашить кожу, закрытую сзади и перед головной пластиной.
- Инъекционная послеоперационная анальгезия, такая как карпрофен в соответствии с институциональными рекомендациями, позволяя животному восстановиться в течение не менее 5 дней.
- Подготовка к сеансам поведения.
- Позвольте подопытным животным привыкнуть к платформе, установив их в подголовник в течение 30-минутных сеансов в течение 5 дней, предшествующих экспериментам.
ПРИМЕЧАНИЕ: К концу сеансов привыкания животные должны комфортно бегать за рулем. - (только DEC) Перед сеансами убедитесь, что выпускное отверстие электромагнитного клапана сосредоточено на целевом глазу, расположенном на расстоянии >1 см.
- (только DEC) Вручную приведите в действие воздушную затяжку с помощью кнопки. Убедитесь, что мышь быстро производит моргание, не проявляя явных признаков стресса, таких как принятие сгорбленной позы или захват пораженной периокулярной области ипсилатеральной передней лапой.
- (только DTSC) Перед сеансами убедитесь, что тактильный стимул сосредоточен на носу животного, расположенном на расстоянии ~ 1,5 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда поведенческий сеанс DTSC не запущен, шаговый двигатель автоматически активируется, чтобы обеспечить ручное изменение положения. - (только DTSC) В терминале SBC введите python3 assocLearnRig_app.py, чтобы запустить графический интерфейс.
- (только DTSC) Запустите тестовый сеанс из трех пробных версий с параметрами по умолчанию, нажав кнопку Начать сеанс в графическом интерфейсе.
- (только DTSC) Убедитесь, что зарегистрированные данные, которые печатаются на терминале, показывают отклонение более 20, но менее 100 шагов, зарегистрированных на поворотном энкодере после США в каждом испытании.
ВНИМАНИЕ: Чтобы избежать вреда и уменьшить стресс для животного, запустите стимул дальше от животного и переместите его ближе, пока не будут выполнены необходимые условия.
- Позвольте подопытным животным привыкнуть к платформе, установив их в подголовник в течение 30-минутных сеансов в течение 5 дней, предшествующих экспериментам.
- Запуск поведенческих сеансов с регистрацией данных.
- Прикрепите мышь к подголовнику.
- В терминале SBC введите python3 assocLearnRig_app.py для запуска графического интерфейса.
- Чтобы разрешить запись с камеры во время поведенческих испытаний, нажмите кнопку «Поток ».
ПРИМЕЧАНИЕ: Сеансы можно запускать без камеры. В этом случае регистрируются только данные с ротационного энкодера и метки времени представления стимула. - Введите идентифицирующую информацию о животном в поле Идентификатор животного и нажмите кнопку Установить .
- Выберите DEC или DTSC в переключателе под заголовком Тип сеанса в зависимости от того, какая поведенческая парадигма требуется.
- Введите нужные параметры эксперимента в поля под полем Animal ID и нажмите кнопку Загрузить в Arduino .
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о параметрах эксперимента можно найти в разделе README репозитория GitHub. - Нажмите кнопку Начать сеанс , чтобы начать сеанс.
- При инициализации сеанса данные начнут регистрироваться в новом каталоге, созданном в "/media/usb" в точке монтирования флэш-накопителя SBC.
4. Экспорт и анализ данных
- Чтобы экспортировать все записанные сеансы на главный компьютер, откройте командную строку и введите команду pscp -r pi@Pi_IP_address:/media/usb* host_computer_destination, затем выполните проверку подлинности с помощью пароля SBC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенная выше команда предназначена для компьютера с Windows. На компьютерах Mac и Linux используйте терминал и замените "pscp" на "scp". - Установите Anaconda25 или другой менеджер пакетов Python (PPM) на главном компьютере.
- Зайдите в репозиторий GitHub и загрузите "analyzeSession.py", "summarizeSessions.py", "session2mp4s.py" и "requirementsHost.txt".
- Откройте запрос PPM и введите conda install --file directory_containing_requirementsHostrequirements Host.txt чтобы убедиться, что установка пакета Python имеет необходимые библиотеки python.
- В командной строке введите cd directory_containing_analyzeData , чтобы перейти в каталог, содержащий "analyzeData.py" и "session2mp4s.py". Запустите программу анализа, введя python analyzeSession.py
ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщение об ошибке будет сгенерировано при использовании версии Python 2 как python. Чтобы проверить версию, введите в командной строке python -V . - При появлении запроса выберите каталог, содержащий данные. Каталоги с несколькими подкаталогами будут анализироваться последовательно.
- Для сеансов DEC для каждого анализируемого каталога сеансов выберите интересующую область (ROI), содержащую глаз мыши, из пробного среднего изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы данных окончательного анализа и сводные графики будут заполняться в подкаталоге каждого анализируемого каталога сеанса. - Введите python summarizeSessions.py для создания сводных данных в нескольких сеансах.
- Введите запрос python session2mp4s.py для преобразования файлов данных изображений в видимые файлы .mp4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочий процесс для экспериментов и анализа DEC
Правильный выбор экспериментальных параметров важен для успешного обучения кондиционированию моргания (DEC). Для данных, представленных здесь, графический интерфейс использовался для выбора длительности CS 350 мс и длительности США 50 мс. Это сопряжение приводит к межстимульному интервалу в 300 мс: достаточно длинному, чтобы предотвратить низкоамплитудную выработку CR10 , и достаточно короткому, чтобы избежать попадания в режим плохого обучения или кондиционирования следов, процесс, который задействует дополнительные области мозга11. Время между испытаниями было установлено с использованием низких и высоких полей ITI, которые были случайным образом выбраны равномерно из диапазона 5-15 с. Рандомизация интервалов между испытаниями делает невозможным для животных использовать временные сигналы, отличные от CS и самих США, для выполнения задач.
Включение испытаний, в которых опущены либо CS, либо US, позволяет оценить кинематику CR и UR даже у дрессированных животных. Пользователь может определить долю испытаний, в которых CS и US сопряжены или представлены изолированно. В данных, представленных здесь, мы провели все сеансы в 10% испытаниях только для CS с парными испытаниями, составляющими остальные, и без испытаний только в США. Обратите внимание, что включение чрезмерного количества непарных испытаний может негативно повлиять на обучение. Например, сеансы с более чем 50% испытаний непарными обычно используются для того, чтобы привести к вымиранию CR у дрессированных животных19,26.
Подготовка камеры и условия освещения также имеют решающее значение для получения высококачественных данных. Частоту кадров при сборе данных можно настроить в программном обеспечении Picamera для сбора данных. В представленных здесь данных мы установили частоту кадров 120 Гц для экспериментов DEC. Сам модуль Picamera допускает частоту кадров до ~ 200 Гц, но мы обнаружили, что более низкие скорости предотвращают потерю кадров и дают адекватное временное разрешение для отслеживания век. Инфракрасный свет должен быть размещен, чтобы равномерно освещать периокулярный мех, не создавая чрезмерного отражения от роговицы, когда глаз открыт. На рисунке 3A показан образец изображения из сеанса записи с приемлемым освещением. Программное обеспечение для сбора picamera (picameraStream.py) предназначено для обеспечения согласованных настроек в течение сеанса путем настройки и удержания баланса белого и усиления камеры в зависимости от условий освещения при инициализации камеры.
После инициализации поведенческого сеанса данные с камеры и других аппаратных компонентов платформы будут автоматически регистрироваться. Журналы данных создаются в каталоге, названном по дате и значению, введенному в поле идентификатора животного в графическом интерфейсе. Кадры камеры и отметки времени для каждого испытания хранятся в отдельных файлах, которые называются с использованием идентификатора животного, даты эксперимента и номера испытания. События платформы для каждого сеанса, включая скорость вращения колес, запуск пробной версии, пробные остановки, а также время CS и US, сохраняются в виде одного файла .txt.
Данные, передаваемые на хост-машину, затем могут быть проанализированы, как описано в разделе 4 протокола. Запуск analyzeData.py в целевом каталоге создаст контейнер .npy для положения век по сравнению со временем для всех испытаний в массиве на основе анализа файлов камеры. Этот файл контейнера создается в анализируемом каталоге. После того, как все сеансы были проанализированы для данного животного, все сеансы могут быть выровнены и объединены с использованием summarizeSessions.py. Результаты обучения животного в течение 8 сеансов DEC показаны на рисунке 3B. Кроме того, отдельные пробные версии могут быть отображены как видимые файлы .mp4 с помощью утилиты session2mp4s.py. Эта утилита отпечатывает квадрат в верхнем левом углу фильма, чтобы указать, когда применяются CS и US. Образцы испытаний DEC, подготовленные таким образом, представлены бок о бок в виде дополнительного видео 1. Левая панель показывает испытание, в котором животное успешно закрывает глаз в ответ на светодиодный CS. На правой панели животное не моргает, пока не начнутся США.
Животные, обученные на DEC в соответствии с протоколами в разделе 3 и зарегистрированные с учетом предыдущих соображений, должны демонстрировать четкие доказательства своевременного получения CR постепенно в течение нескольких дней обучения. Примеры поведенческих следов без CR у необученного животного и следов, содержащих надежные CR от обученного животного, представлены на рисунке 3B. Как показывают эти следы, наивные животные не должны демонстрировать никакой реакции на CS, но быть надежным ответом НА США. CR должны постепенно увеличиваться как по размеру, так и по частоте через поведенческие сеансы, выполняемые в течение нескольких дней (рисунок 3B-D). Напротив, условия неоптимального освещения серьезно ограничивают качество получаемых данных. Когда контраст между глазом и окружающим мехом низкий (рисунок 3E), незначительные изменения в изображении могут значительно изменить записанную форму UR за один сеанс и уменьшить отношение сигнал/шум для определения положения века (рисунок 3F-G).
Для обеспечения высокой точности записи век решающее значение имеет оптимальное размещение источника света. Светодиод освещения должен быть обучен непосредственно на записанном глазу. Если размещение приводит к чрезмерному блику на поверхности роговицы, диффузор может быть размещен над светодиодным массивом, чтобы уменьшить этот эффект.
Рабочий процесс для экспериментов и анализа DTSC
Многие из соображений для экспериментального выбора параметров схожи между тактильным обусловливанием задержки (DTSC) и DEC. Здесь мы укажем на те, которые отличаются. В примере данных длительность DTSC CS была установлена на 250 мс с длительностью US 50 мс. Этот более короткий интервал между стимулами был выбран для тесного согласования с более короткой продолжительностью, описанной как оптимальная для обучения DTSC20. Другие параметры платформы, заданные с помощью графического интерфейса, были идентичны тем, которые использовались для DEC.
Правильное размещение тактильного стимула имеет решающее значение для обучения в DTSC. Мы монтируем тактильный раздражитель таким образом, чтобы конец пены был центрирован немного выше носа животного на расстоянии примерно 1,5 см в нейтральном положении. После установки стимул можно повернуть вручную, когда сеанс не запущен. Во время сеансов шаговый двигатель удерживает стимул в точном месте до тех пор, пока не сработает УЗИ. Чтобы убедиться в правильности позиционирования, мы проводим подготовительную сессию, состоящую примерно из трех испытаний. События, зарегистрированные на ротационном энкодере, печатаются на экране терминала, и эту распечатку можно использовать для мониторинга амплитуды UR животных в режиме реального времени. В то время как максимальная амплитуда будет варьироваться от испытания к испытанию, животные со средним максимумом ~ 40 на энкодере в течение короткого сеанса должны хорошо выполнять задачу DTSC. Исходя из настроек управления поворотным энкодером, это значение соответствует 24 см/с, при этом отрицательное значение указывает на то, что животное движется назад на колесе.
Организация и именование файлов, созданных в ходе сеансов DTSC, такие же, как и в DEC. Запуск analyzeSession.py создаст контейнер .npy для скорости колеса по сравнению со временем для всех испытаний в массиве из анализа данных, зарегистрированных в .csv файле. После того, как все сеансы были проанализированы для данного животного, все сеансы могут быть выровнены и объединены с использованием summarizeSession.py. Результаты обучения животного в течение 5 сеансов DEC представлены на рисунке 4A. Что касается DEC, то снимки камеры с DTSC могут быть преобразованы в видимые .mp4 файлы. Образцы испытаний DTSC показаны рядом в дополнительном видео 2. Левая панель показывает испытание, в котором животное успешно поддерживает колесо в ответ на светодиодный CS. На правой панели животное не может переместить колесо до тех пор, пока не будет применен тактильный стимул US.
Временной ход и амплитуда относительно UR ответов у животных, обученных по парадигме DTSC, показывают качественное сходство с теми, кто обучался на DEC. Наивные животные должны не проявлять никакой реакции на CS, и научиться перемещать колесо назад в ответ на CS только после повторных воздействий парных CS и US. Частота и амплитуда КР увеличиваются по мере прохождения обучения (рисунок 4A,B). В случае DTSC мы обнаружили, что амплитуда UR в начале обучения является хорошим предиктором успеха обучения. В когорте животных, обученных с США, которые производили низкоамплитудные UR (<20 см / с), ни одно животное не научилось последовательно производить CR после 4 дней обучения (рисунок 4C, D).
Различия между обучением DEC и DTSC
DEC и DTSC существенно отличаются друг от друга. Во-первых, обучение DTSC на этой платформе происходит быстрее, причем большинство животных достигают высокой степени мастерства выполнения задач к третьему дню обучения и асимптотической производительности к пятому дню. Обучение DEC происходит медленнее для большинства животных, по крайней мере, на 3 дня. Во-вторых, система DTSC включает в себя автоматическое обнаружение успешных CR, которые служат сигналом обратной связи к аппарату для уменьшения амплитуды тактильного раздражителя. Эта тренировочная процедура имитирует кондиционирование моргания глаз, в котором улучшенная производительность CR обеспечивает частичную защиту от отвратительной затяжки воздуха роговицы. Напротив, животные с фиксированной головой в парадигме DTSC не могут защитить себя от тактильного стимула только своей двигательной реакцией. Основывая амплитуду США на наличии CR, животные имеют возможность оградить себя от аверсивного стимула.
Рисунок 1: Атрибуты платформы и дизайн. (A) Элементы платформы для регистрации поведения животных в условиях, зафиксированных головой. Мышь была адаптирована из изображения Biorender. (B) Сроки и стимулы для кондиционирования DEC и DTSC. Определяемый пользователем межстимульный интервал (ISI) определяет, как долго длится только эпоха CS. Эпохи CS и США предназначены для совместного завершения. (C) Изображение, демонстрирующее размещение ключевых элементов платформы. 1) Шаговый двигатель для управления DTSC US. 2) Ходовое колесо для животного. 3) Поворотный энкодер для отслеживания движения колес. 4) Пена, наклеенная на акриловую руку, которая служит тактильным стимулом DTSC. 5) LED CS. 6) Электромагнитный клапан и выпускное отверстие, которое обеспечивает DEC US. 7) Пикамера для регистрации поведения животных. 8) Инфракрасный светодиод для освещения сцены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Проводка аппаратных элементов платформы. (A) Схема подключения фритцинга аппаратного обеспечения платформы при полной сборке. Провода окрашены модулями с оранжевым = модуль камеры; желтый = модуль DEC США; синий = светодиодный модуль CS; фиолетовый = модуль DTSC США; зеленый = модуль поворотного энкодера. Пикамера исключена, но крепится к последовательному интерфейсу камеры, расположенному на поверхности Raspberry Pi. Батареи указывают на источники питания постоянного тока при заданном напряжении. (Б-Ф) Эквивалентная схема проводки для изолированных модулей. Провода были перекрашены, так что красный и черный всегда указывают на положительную шину питания и заземление соответственно, в то время как другие провода окрашены, чтобы обеспечить легкое следование за схемой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты обучения DEC. (A) Пример кадра камеры из сеанса с приемлемыми условиями освещения. Обратите внимание на высокий контраст между глазом и периокулярным мехом. (B) Производительность одного животного во время сеансов, выполняемых в течение дней в парадигме DEC. Горизонтальные линии указывают на производительность в каждом испытании, а теплые цвета указывают на большее закрытие век. Крайняя левая красная черная вертикальная линия указывает на начало CS, в то время как пунктирная линия указывает на инициацию США. Вторая сплошная линия указывает на прекращение CS и США. Обратите внимание, что количество испытаний с успешными ответами во время CS увеличивается во время учебных занятий. (C) Производительность животных от (B) с индивидуальными следами, полученными из испытательного среднего показателя за сеанс каждый день. Насыщенность оттенка указывает на номер сеанса с более высокой насыщенностью для последующих сеансов. (D) Производительность для всех животных в группе DEC (n = 7). Тонкие линии указывают процент испытаний с обнаруживаемым CR от каждого сеанса для каждого животного. Толстые линии указывают на сеансовые средства у всех животных. (E) Пример кадра камеры из сеанса с неоптимальными условиями освещения. (F) Количественная оценка одиночных испытаний, зарегистрированных при плохом освещении. UR обнаруживается, но с более низкой контрастностью и более высокой изменчивостью, чем при оптимальных условиях освещения. (G) Средние следы сессий от испытаний, представленные в (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты обучения DTSC. (A) Производительность одного животного во время сеансов, выполняемых в течение нескольких дней в парадигме DTSC. Горизонтальные линии указывают на производительность в каждом испытании, а теплые цвета указывают на движение колеса назад. Крайняя черная черная вертикальная линия указывает на начало CS, в то время как пунктирная линия указывает на инициацию США. Вторая сплошная линия указывает на прекращение CS и США. (B) Производительность животных от (A) с индивидуальными следами, полученными из испытательного среднего значения за сеанс каждый день. Насыщенность оттенка указывает на номер сеанса с более высокой насыщенностью для последующих сеансов. (C) Производительность для всех животных в группе DTSC (n = 6). Тонкие линии указывают процент испытаний с обнаруживаемым CR от каждого сеанса для каждого животного. Толстые линии указывают на сеансовые средства у всех животных. (D) Одиночные испытания, как в (А) из когорты, где интенсивность в США вызвала низкую амплитуду UR. (E) Средние следы сеанса представлены как в (B) для животных, подвергшихся воздействию слабых США. (F) Показатели для всех животных в DTSC со слабым УЗИ (n = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео 1: Пример испытаний DEC по попаданию и промаху. Испытания DEC сравниваются в видео 1. Каждое видео показывает испытания, в которых субъект делает (слева) или не делает (справа) целевую CR синхронизированной и воспроизводимой бок о бок для сравнения. Светодиодный CS загорается, когда синий квадрат появляется в левом верхнем углу каждого видео. Управляющий сигнал США активен, когда белый квадрат заменяет синий квадрат. Управляющие сигналы CS и US прекращаются, когда квадрат исчезает. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительное видео 2: Образцы испытаний DTSC. Видео 2 показывает сравнение испытаний DTSC. Каждое видео показывает испытания, в которых субъект делает (слева) или не делает (справа) целевую CR синхронизированной и воспроизводимой бок о бок для сравнения. Светодиодный CS загорается, когда синий квадрат появляется в левом верхнем углу каждого видео. Управляющий сигнал США активен, когда белый квадрат заменяет синий квадрат. Управляющие сигналы CS и US прекращаются, когда квадрат исчезает. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Платформа с соответствующими протоколами, описанными здесь, может быть использована для надежного отслеживания поведения животных в двух сенсорных ассоциативных учебных задачах. Каждая задача зависит от неповрежденной связи через альпинистский волоконный путь. В дизайн, описанный здесь, мы включаем элементы для облегчения обучения и записи / возмущения мозжечковой реакции. К ним относятся колесо, обеспечивающее свободное передвижение11,18, а также фиксацию головы. Колесо позволяет мышам свободно перемещаться, что, как было замечено, имеет решающее значение для приобретения DEC18. Фиксация головы у мышей позволяет исследователям воспользоваться генетическими, электрофизиологическими, визуальными и оптогенетическими подходами, которые труднее использовать у других модельных видов или в свободно движущихся условиях12. Мы использовали наш дизайн для каждого из этих приложений. Программное обеспечение, работающее на микроконтроллерах, может быть легко адаптировано для управления сигналами синхронизации для многофотонного сбора или синхронизации с оптогенетической стимуляцией, как с точностью до миллисекунды. Необходимо позаботиться о том, чтобы свести к минимуму восприятие животными оптогенетического и визуализационного оборудования, когда оно сочетается с поведенческими экспериментами. Например, многие многофотонные системы издают слышимый звук от своих гальванометрических сканеров или жалюзи, когда начинаются сборы изображений. Если приобретения вызваны началом испытаний, такие звуки могут служить непреднамеренным сигналом для животных, что приближается стимул.
Управление поведенческим аппаратом построено вокруг SBC, который используется для генерации графического пользовательского интерфейса для управления экспериментом, камерой и экспортом данных. SBC также отправляет команды двум микроконтроллерам, которые обрабатывают время испытаний и непосредственно управляют аппаратными компонентами, такими как представление стимулов и поворотный энкодер. Протоколы, подробно описанные здесь, были протестированы с использованием Raspberry Pi 3B + или 4B, прикрепленного к Arduino Из-за контрольного времени эксперимента, и Arduino Uno для управления презентацией DTSC US. Другие реализации аппаратного обеспечения возможны, но не были протестированы с предоставленным программным обеспечением.
Чтобы облегчить параллельное использование нескольких буровых установок, мы рекомендуем эксплуатировать SBC в «безголовом» режиме. В этой конфигурации для взаимодействия с SBC используется главный компьютер. Коммутатор Ethernet обеспечивает одновременное подключение к Интернету как к хост-компьютеру, так и к SBC. Коммутатор также обеспечивает прямую связь между хостом и SBC с быстрой передачей данных. В результате коммутатор обеспечивает легкую передачу данных и обслуживание пакета SBC.
Для параллельной работы нескольких буровых установок каждая буровая установка должна быть размещена в собственном специализированном корпусе. Эти корпуса должны иметь звукоизоляцию, если они расположены в непосредственной близости друг от друга. Подавление звука между соседними установками может помочь избежать непреднамеренных слуховых сигналов от стимулов, производимых в соседних корпусах.
Использование единой платформы для DEC и DTSC позволяет исследователям гибко ориентироваться в сильных и слабых сторонах каждой парадигмы. DEC обладает пониманием, полученным из десятилетий исследований того, какие области мозга и конкретные элементы мозжечковой цепи участвуют в обучении и выполнении задач 1,4,11,13,14,15,19. Тем не менее, у мышей область коры мозжечка, чаще всего связанная с кондиционированием11,12 моргания, расположена глубоко внутри первичной мозжечковой трещины (хотя см. 15,17,27, которые демонстрируют DEC-ассоциированную область поверхностной дольки VI). Глубокий локус для обучения усложняет доступ к оптическим экспериментам, в частности многофотонной визуализации активности клеток и экспериментам с оптогенетическими возмущениями. Напротив, мозжечковые субстраты DTSC расположены частично в поверхностном аспекте долек IV/V20. Таким образом, DTSC представляет оптический доступ, сопоставимый с доступом к дорсальной неокортексе, популярному сайту для исследований системной неврологии.
В нашей конструкции поведение животных отслеживается с помощью поворотного энкодера, прикрепленного к колесу, и камеры. Мы выбрали эти методы для низкой стоимости и простоты реализации. В некоторых случаях другие методы отслеживания могут обеспечить большую пространственную и временную точность. Например, положение век в DEC обычно отслеживалось с помощью датчиков эффекта Холла28,29 или записей электромиограммы периорбитальной области musculus orbicularis oculi 30,31. Аналогичным образом, отслеживание локомоции путем обнаружения движения колеса дает менее подробную картину поведения животных, чем алгоритмы отслеживания поз на основе изображений, такие как SLEAP32 и DeepLabCut33. Записи на основе камер позволяют добавлять такие подходы.
Здесь мы представили платформу для отслеживания поведения животных во время двух парадигм ассоциативного обучения, зависящих от волокон. Наша платформа предназначена для повышения доступности этих методов как с точки зрения стоимости, так и простоты внедрения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается грантами Национальных институтов психического здоровья NRSA F32 MH120887-03 (для G.J.B.) и R01 NS045193 и R01 MH115750 (для S.S-H.W.). Мы благодарим докторов Баса Куккука и Хенка-Яна Боле за полезные обсуждения по оптимизации настройки DEC, а также докторов Юэ Вана и Сяоина Чена за полезные обсуждения по оптимизации настройки DTSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "B" Quick Base For C&B METABOND - 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst - 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable - M/M - 2 m Micro HDMI to DVI Cable - 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male - 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor - 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C - 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires - 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND - 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 - 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable - A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
- McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
- McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), New York, N.Y. 296-299 (1984).
- Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), New York, N.Y. 989-991 (1993).
- Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
- Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
- Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
- Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
- Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), New York, N.Y. 225-233 (1989).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
- Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
- Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
- Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
- Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
- Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
- Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
- Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
- Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
- Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
- Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
- Raspberry Pi Operating system images. , Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021).
- VNC Server. VNC® Connect. , Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021).
- Anaconda: The world's most popular data science platform. , Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021).
- De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M.
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
- Boele, H. -J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
- Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
