Summary
我们开发了一个单一的平台来跟踪动物在两个攀爬纤维依赖性联想学习任务中的行为。低成本设计允许与光遗传学或成像实验集成，旨在攀登纤维相关的小脑活动。
Abstract
攀爬浦肯野细胞的纤维输入为小脑依赖性联想学习提供了至关重要的指导性信号。在头部固定小鼠中研究这些信号有助于使用成像，电生理学和光遗传学方法。在这里，开发了一个低成本的行为平台（约1000美元），可以跟踪头部固定的小鼠的联想学习，这些小鼠在跑步轮上自由运动。该平台结合了两种常见的联想学习范式：眨眼调节和延迟触觉惊吓调节。使用摄像头跟踪行为，并由检测器跟踪车轮运动。我们描述了组件和设置，并为训练和数据分析提供了详细的协议。该平台允许结合光遗传学刺激和荧光成像。该设计允许一台主机控制多个平台，以同时训练多只动物。
Introduction
巴甫洛夫条件反射刺激之间的亚秒级关联以引发条件反应长期以来一直用于探究小脑依赖性学习。例如，在经典的延迟眨眼调节（DEC）中，动物学会在响应中性条件刺激（CS;例如，闪光或听觉音调）时，当它与无条件刺激（美国;例如，施加在角膜上的空气）反复配对时，做出适时的保护性眨眼，这总是引起反射性眨眼， 并且出现在 CS 的末尾或接近末尾。习得的反应被称为条件反应（CR），而反射反应被称为无条件反应（UR）。在兔子中，小脑特异性病变破坏了这种形式的学习1，2，3，4。此外，浦肯野细胞复合物尖峰，由其爬升光纤输入5驱动，提供必要的6，7 和足够的8，9 信号，用于采集适当定时的CR。
最近，已经为头部固定的小鼠开发了攀爬纤维依赖性联想学习范式。DEC是第一个适应这种配置的关联学习范式10，11。头固定小鼠中的DEC已被用于识别小脑区域11，12，13，14，15，16，17 和电路元件11，12，13，14，15，18，19 任务获取和消亡所必需的。这种方法也被用来证明任务参数的细胞水平生理表示如何随着学习13，15，16而进化。
除了眨眼之外，延迟惊吓触觉调节（DTSC）范式最近被开发为一种用于头部固定小鼠的新型联想学习任务20。在概念上与DEC类似，DTSC涉及用US呈现中性CS，轻敲面部的强度足以使惊吓反射21，22 作为UR。在DTSC范式中，UR和CR都被读出为车轮上的向后运动。DTSC现在已被用于揭示联想学习如何改变小脑活动和基因表达模式20。
在这项工作中，开发了一种在单个平台中灵活应用DEC或DTSC的方法。激励和平台属性在 图 1 中进行了架构化。该设计结合了使用摄像头跟踪动物行为的能力，以及用于跟踪鼠标在轮子上的运动的旋转编码器。数据记录和试验结构的所有方面都由配对的微控制器（Arduino）和单板计算机（SBC;树莓派）。可以通过提供的图形用户界面访问这些设备。在这里，我们介绍了用于设置、实验准备和执行的工作流程，以及用于数据可视化的自定义分析管道。
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Protocol
这里描述的动物协议已获得普林斯顿大学动物护理和使用委员会的批准。
1. 设置 SBC
- 将相机串行接口 （CSI） 电缆连接到 Raspberry NoIR V2 相机和 SBC 上的相机端口。
- 将 SBC 的操作系统下载到主机上。将操作系统映像写入微型安全数字 （microSD） 卡。
注意：有关树莓派SBC的这些程序的详细说明，可以在别处找到23。该系统已使用以下操作系统进行了测试：拉伸，巴斯特，靶心。 - 要启用安全的 shell 通信，请在 microSD 卡的引导分区中创建一个名为“ssh”的无扩展名文件。完成此操作后，从主机中弹出microSD卡并将其插入SBC microSD卡插槽。通过插入 SBC 的电源为其供电。
- 准备 SBC 以接受与主机的有线连接。
- 使用适当的电缆将显示器连接到 SBC。打开终端，键入命令 ifconfig 并记录 SBC 的以太网 IP 地址。
注意：Raspberry Pi 型号 3B+ 具有 HDMI 显示端口，而型号 4B 具有微型 HDMI 端口。 - 转到树莓派配置设置 的接口选项卡 ，并启用相机、安全外壳网络协议 （SSH） 和虚拟网络计算 （VNC） 的选项。
- 使用适当的电缆将显示器连接到 SBC。打开终端，键入命令 ifconfig 并记录 SBC 的以太网 IP 地址。
- 在主机和 SBC 之间建立有线连接。
- 将以太网电缆连接到 SBC 和主机上的以太网端口。将这些电缆的另一端连接到以太网交换机。
- 使用虚拟网络计算客户端（如 VNC 查看器24 ）并使用 SBC IP 地址和默认身份验证（用户 = “pi”，密码 = “raspberry”）访问桌面。
- 下载协议步骤中包含的所需软件。
警告： 更改默认用户名和密码以防止对 SBC 进行未经授权的访问。- 在 SBC 终端中输入以下命令以下载远程测试仪 （Rig） 软件：
git 克隆 --深度 = 1 https://github.com/gerardjb/assocLearnRig - 输入以下命令以下载必要的 python 库。
cd assocLearnRig
python3 setup.py - 要允许直接控制微控制器，请按照步骤 1.6.4-1.6.7 连接到 SBC 并下载微控制器集成开发环境 （IDE）。
- 在 SBC 桌面上打开 Web 浏览器并导航到 https://arduino.cc/en/software。下载最新的 Linux ARM 32 位版本的 IDE。
- 在 SBC 桌面上打开终端窗口，然后键入 cd Downloads/ 导航到下载目录
- 要安装 IDE，请在终端中键入以下命令：
tar -xf arduino--linuxarm.tar.xz
sudo mv arduino-/opt
sudo /opt/arduino-/install.sh
（此处<版本>是下载的 IDE 的版本） - 在 SBC 桌面上打开微控制器 IDE 的实例。选择菜单选项 “工具”>“管理库”。安装 Paul Stoffregen 的“Encoder”库。
- 在 SBC 终端中输入以下命令以下载远程测试仪 （Rig） 软件：
- 使用 USB 拇指驱动器扩展 SBC 板载内存。
- 将拇指驱动器插入 SBC 上的 USB 端口。使用 USB 3.0 端口（如果可用）。
- 键入终端 ls -l /dev/disk/by-uuid/ 以查找拇指驱动器及其唯一引用 （UUID）。记录 UUID。
- 要允许 pi 用户写入 USB 设备，请在终端中逐个键入以下命令：
sudo mkdir /media/usb
sudo chown -R pi：pi /media/usb
sudo mount /dev/sda1 /media/usb -o uid=pi，gid=pi
注意：拇指驱动器可以添加为在 SBC 重新启动时自动装载的设备，方法是将以下行添加到 fstab 文件末尾的 /etc/fstab：
UUID=/media/usb vfat auto，nofail，noatime，users，rw，uid=pi，gid=pi 0 0
2. 布线刺激硬件和组装阶段
- 连接并准备微控制器。
- 使用USB2 A型至USB2微型电缆将SBC连接到微控制器（Arduino Due）的编程端口。
注：使用高质量电缆，如 材料表中的产品 ，以确保正确操作。 - 在下载的项目存储库中找到“dueAssocLearn.ino”。使用微控制器 IDE 打开草图，并将其上传到连接到 SBC 的微控制器。
- 在主机上下载并安装相应版本的 Arduino IDE。
- 使用USB2 B型到USB2型A型电缆将主机连接到微控制器（Arduino Uno）。
- 转到 GitHub 存储库（https://github.com/gerardjb/assocLearnRig），并将“DTSC_US.ino”草图下载到主机。
- 在主机上，运行微控制器 IDE 并打开“DTSC_US.ino”草图，然后将其上载到微控制器。
- 使用USB2 A型至USB2微型电缆将SBC连接到微控制器（Arduino Due）的编程端口。
- 将电线连接到微控制器、试验板、LED、旋转编码器、带驱动器的步进电机和带驱动器的电磁阀，如图 2中的Fritzing图所示。
- 为步进电机和电磁阀供电。
- 将电源的一个通道正确连接到步进电机驱动器的+V和GND引脚。
- 打开电源并将连接的通道电压设置为 25 V。
注：如果步进电机、驱动器和电源之间的连接配置正确，则步进电机驱动器上的绿色指示灯 LED 将亮起。 - 将电源的正极引线正确连接到电磁阀驱动器保持电压引脚，将另一个正极引线连接到尖峰电压引脚。
- 将负极引线连接到与控制信号共用的接地。
- 打开电源，将连接到保持电压的通道设置为约2.5 V，将连接到尖峰电压的通道设置为约12 V。
- 使用鲁尔适配器将压力调节至 ~20 PSI 的空气源连接到电磁阀。
- 测试所有激励组件和相机是否正常工作。
- 在 SBC 上打开一个终端，然后键入 cd ~/assocLearnRig 以导航到克隆的 GitHub 存储库。
- 在终端中，键入 python3 assocLearnRig_app.py 以启动控件图形用户界面。
- 通过点击“流”按钮启动相机 流 。
- 选择 DEC 单选 按钮，上传到微控制器，然后通过点击“启动会话”按钮使用默认参数 启动会话 。
注意：完成此步骤后，终端中应显示数据记录的打印输出，相机流上的消息应消失，并且在每次试用期间，LED CS 和电磁阀 US 应在适当时间打开和关闭。 - 会话结束后，在选中 DTSC 单选 按钮的情况下重复上述步骤。
注意：如果上述步骤不能提供令人满意的结果，GitHub 存储库中的草图（“testStepper.ino”、“testRotary.ino”和“testSolenoid.ino”）可用于测试各个组件。
- 制作跑轮。
- 从泡沫辊上切割一个3英寸的车轮。在精确的车轮中心钻一个1/4“的孔，这样当鼠标的运动转动时，车轮不会晃动。
- 将1/4“轴插入车轮，并使用放置在车轮两侧的夹紧轮毂将其固定到位。
- 使用 M3 螺栓将旋转编码器固定到 4.5“ 铝制通道上。使用带有 1/4“ 螺栓、螺母和垫圈的右角支架稳定铝制试验板上的铝制通道，如图所示。
- 使用联轴器套筒连接车轮和旋转编码器。
- 通过将轴承插入安装在试验板安装光学柱上的直角端夹中，稳定车轮轴的自由侧。
注：确保车轮在手动旋转时自由旋转而不会晃动。 - 将激励硬件、头枕、红外灯阵列和 picamera 放置在组装好的车轮周围。
- 使用光学立柱和直角柱夹具定位头枕，使头柱位于轮轴前方 1.5 cm 处，距车轮表面 2 cm。（值适用于 20 g 鼠标）。
- 将用于 DEC US 的 CS LED 和电磁阀出口放置在距用于 DEC 的眼睛不到 1 cm 的位置。
- 安装用于DTSC US的步进电机
- 将皮卡梅拉安装在距离动物约10厘米的光学柱上。
注意：picamera 支架的设计可以在 3D 打印机上从 GitHub 存储库中“RaspPiCamMount1_1.stl”中的文件进行。 - 将红外光阵列略微放在上方，并直接面向与picamera同一侧的人脸位置。
- 通过使用夹紧轮毂将泡沫贴在安装在1/4“轴上的丙烯酸片的边缘，为DTSC制作触觉刺激。将触觉刺激连接到步进电机轴上。
注意：亚克力作品的设计可以按照GitHub存储库中“TactileStimDesign.pdf”中的图案进行激光切割。
3. 准备和运行行为实验
- 植入鼠标头板。
- 使用2%异氟醚麻醉小鼠，并在立体定向框架中固定头部。
- 将眼药膏涂抹在眼睛上。
- 用肥皂水和无菌手术刀剃须头皮。直接在切口部位的皮肤下注射利多卡因，并用聚维酮清洁手术部位。
- 用手术刀沿着头皮的中线从眼睛的后缘到颅骨的后缘做一个切口，小心不要用力按压头骨。
- 将切口张开，并用无菌止血器夹住两侧以将其保持打开。使用浸有乙醇的棉签轻轻去除骨膜，让暴露的颅骨表面干燥。
- 将头板水平放置在颅骨上，确保将头板的前部定位在眼睛后方。使用氰基丙烯酸酯胶将头板连接到头骨上，让胶水完全干燥。
- 将牙科水泥粉（1勺），溶剂（2滴）和催化剂（1滴）混合在混合皿中，并涂抹在暴露的骨骼的所有区域。添加图层，直到表面与头板的顶部边缘齐平，确保头板牢固地连接到头骨上。
- 如有必要，将皮肤缝合在头板后面和前面。
- 根据机构指南注射术后镇痛药，如卡洛芬，同时允许动物恢复至少5天。
- 为行为会话做准备。
- 在实验前5天，让试验动物习惯于在平台上，将它们安装在头枕中30分钟。
注意：在习惯性训练结束时，动物应该在轮子上舒适地奔跑。 - （仅限12月）在治疗之前，确保电磁阀出口位于>1厘米外的目标眼部的中心。
- （仅限12月）使用按钮手动启动空气泡芙。确保鼠标迅速眨眼，而不会出现明显的压力迹象，例如采取驼背姿势或用同侧前爪抓住受影响的眼周区域。
- （仅限 DTSC）在训练之前，确保触觉刺激集中在距离约1.5厘米的动物鼻子上。
注意：当DTSC行为会话未运行时，步进电机将自动停用以允许手动重新定位。 - （仅限 DTSC）在 SBC 终端中，键入 python3 assocLearnRig_app.py以 启动 GUI。
- （仅限 DTSC）通过点击 GUI 中的 “启动会话 ”按钮，使用默认参数运行包含三个试验的测试会话。
- （仅限 DTSC）确保打印到终端的记录数据在每次试验后，在旋转编码器上记录的偏转大于 20 但小于 100 步。
注意：为避免伤害并减少对动物的压力，请从远离动物的地方开始刺激，并将其移近，直到满足所需条件。
- 在实验前5天，让试验动物习惯于在平台上，将它们安装在头枕中30分钟。
- 运行具有数据记录的行为会话。
- 将鼠标安装到头枕上。
- 在 SBC 的终端中，键入 python3 assocLearnRig_app.py 以启动 GUI。
- 要允许在行为试用期间录制相机，请点击“ 流 ”按钮。
注意：会话可以在没有摄像头的情况下运行。在这种情况下，仅记录来自旋转编码器和激励表示时间戳的数据。 - 在动物 ID 字段中输入动物的识别信息，然后点击 设置 按钮。
- 从会话类型标题下的单选按钮中选择 DEC 或 DTSC，具体取决于所需的行为范例。
- 将所需的实验参数输入到 “动物ID ”字段下方的字段中，然后点击“ 上传到Arduino ”按钮。
注意：实验参数的详细信息可以在 GitHub 存储库自述部分找到。 - 点击 开始会话 按钮开始会话。
- 初始化会话后，数据将开始记录在 SBC 拇指驱动器装入点的“/media/usb”中创建的新目录中。
4. 导出和分析数据
- 要将所有录制的会话导出到主机，请打开命令提示符并输入命令 pscp -r pi@Pi_IP_address：/media/usb* host_computer_destination，然后使用 SBC 密码进行身份验证。
注意：上述命令适用于 Windows 计算机。在 Mac 和 Linux 计算机上，使用终端并将“pscp”替换为“scp”。 - 在主机上安装 Anaconda25 或其他 python 包管理器 （PPM）。
- 转到 GitHub 存储库并下载“analyzeSession.py”、“summarizeSessions.py”、“session2mp4s.py”和“requirementsHost.txt”。
- 打开 PPM 提示符并键入 conda install --file directory_containing_requirementsHostrequirements Host.txt 以确保 Python 包安装具有所需的 python 库。
- 在提示符中，键入 cd directory_containing_analyzeData导航到包含“analyzeData.py”和“session2mp4s.py”的目录。通过键入 python analyzeSession.py 来运行分析程序
注意：如果将 Python 2 版本用作 python，将生成一条错误消息。要检查版本，请在提示符中键入 python -V 。 - 出现提示时，选择包含数据的目录。将按顺序分析具有多个子目录的目录。
- 对于 DEC 会话，对于分析的每个会话目录，从试验平均图像中选择包含鼠标眼睛的感兴趣区域 （ROI）。
注意：最终分析数据文件和汇总图将填充到每个分析会话目录的子目录中。 - 键入 python summarizeSessions.py 以跨多个会话生成摘要数据。
- 键入提示 python session2mp4s.py ，将映像数据文件转换为可查看的.mp4文件。
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Representative Results
DEC实验和分析的工作流程
正确的实验参数选择对于成功进行延迟眨眼调节 （DEC） 训练非常重要。对于此处提供的数据，GUI 用于选择 350 ms 的 CS 持续时间和 50 ms 的美国持续时间。这种配对导致300毫秒的刺激间间隔：足够长以防止低振幅CR产生10 ，足够短以避免进入不良学习或痕量条件调节的制度，这一过程涉及额外的大脑区域11。试验之间的时间是使用ITI低场和高场设置的，从5-15秒的范围内随机均匀地选择。试验间间隔的随机化使得动物受试者无法使用CS和美国本身以外的时间线索来执行任务。
包括省略CS或US的试验，即使在训练有素的动物中也可以评估CR和UR运动学。用户可以定义 CS 和 US 单独配对或呈现的试验比例。在这里提供的数据中，我们在10%的仅CS试验中运行了所有会话，配对试验构成了其余部分，而没有仅美国试验。请注意，包含过多的未配对试验可能会对训练产生负面影响。例如，超过50%的试验未配对的会话通常用于推动训练动物中CR的灭绝19，26。
相机准备和照明条件对于获取高质量数据也至关重要。采集的帧速率可以在Picamera采集软件中进行调整。在这里提供的数据中，我们为DEC实验设置了120 Hz的帧速率。Picamera模块本身允许高达约200 Hz的帧速率，但我们发现较低的速率可以防止帧丢失，并为眼睑跟踪提供足够的时间分辨率。必须放置红外光以均匀地照亮眼周皮毛，而不会在眼睛睁开时从角膜产生过度反射。 图3A 显示了具有可接受照明的记录会话的样本图像。picamera 采集软件 （picameraStream.py） 旨在通过根据摄像机初始化时的照明条件设置和保持摄像机的白平衡和增益，在整个会话中提供一致的设置。
初始化行为会话后，将自动记录来自相机和其他平台硬件组件的数据。数据日志是在由 GUI 中动物 ID 字段的日期和值输入的目录中创建的。每个试验的相机帧和时间戳都存储在单独的文件中，这些文件使用动物ID，实验日期和试验编号命名。每个会话的平台事件（包括车轮速度、试用启动、试用停止以及 CS 和美国计时）都保存为单个.txt文件。
然后可以按照协议第4节所述分析传输到主机的数据。在目标目录上运行 analyzeData.py 将创建一个 .npy 容器，用于基于相机文件分析的数组中所有试验的眼睑位置与时间的关系。此容器文件是在分析的目录中创建的。一旦对给定动物的所有会话进行了分析，就可以使用 summarizeSessions.py 对齐和连接所有会话。来自训练了8次DEC疗程的动物的结果如图 3B所示。此外，可以使用 session2mp4s.py 实用程序将单个试验呈现为可查看的.mp4文件。此实用程序会在影片的左上角印上一个正方形，以指示何时应用 CS 和 US。以这种方式制备的DEC试验样本作为 补充视频1并排呈现。左图显示了一个试验，其中动物成功闭上眼睛以响应LED CS。在右侧面板中，动物在美国开始之前不会眨眼。
按照第3节中的协议在DEC上训练并记录上述考虑因素的动物应显示明确的证据表明，在多次训练日内逐渐获得适时的CR。图3B显示了未经训练的动物中没有CR的行为痕迹以及包含来自训练动物的健壮CR的痕迹的示例。正如这些痕迹所显示的那样，幼稚的动物应该对CS没有反应，而是对美国做出强有力的反应。CR的大小和频率应通过几天的行为会话逐渐增加（图3B-D）。相比之下，次优的照明条件严重限制了采集数据的质量。当眼睛与周围皮毛之间的对比度较低时（图3E），图像中的微小变化可以在单个会话中显着改变UR的记录形状，并降低用于检测眼睑位置的信噪比（图3F-G）。
为了确保高保真度的眼睑记录，最佳的光源放置至关重要。照明 LED 应直接在记录的眼睛上进行训练。如果放置导致角膜表面过度眩光，可以在LED阵列上放置扩散器以减少这种影响。
DTSC实验和分析的工作流程
实验参数选择的许多考虑因素在延迟触觉惊吓调节（DTSC）和DEC之间是相似的。在这里，我们将指出那些不同的。在示例数据中，DTSC CS 持续时间设置为 250 毫秒，美国持续时间为 50 毫秒。选择这种较短的刺激间间隔是为了与描述为DTSC学习20最佳的较短持续时间紧密结合。通过 GUI 设置的其他平台参数与用于 DEC 的参数相同。
触觉刺激的正确放置对于DTSC的学习至关重要。我们安装触觉刺激，使得泡沫末端在动物鼻子上方稍微居中，在中性位置时，距离约为1.5厘米。安装后，当会话未运行时，可以手动转动刺激。在会话期间，步进电机将刺激保持在精确位置，直到触发美国。为了确保定位正确，我们举行了大约三次试验的预备会议。记录在旋转编码器上的事件被打印到终端屏幕上，并且该打印输出可用于实时监控动物UR的振幅。虽然最大振幅因试验而异，但在整个短时间内，编码器上平均最多计数约40次的动物在DTSC任务中应该表现良好。根据旋转编码器控制设置，该值对应于 24 cm/s，负值表示动物在轮子上向后移动。
在DTSC会话过程中生成的文件的组织和命名与12月生成的文件相同，运行 analyzeSession.py 将创建一个.npy容器，用于通过分析.csv文件中记录的数据，在数组中为所有试验的车轮速度与时间。一旦对给定动物的所有会话进行了分析，就可以使用 summarizeSession.py 对齐和连接所有会话。 图4A中显示了经过5次DEC训练的动物的结果。至于DEC，从DTSC捕获的相机可以转换为可查看.mp4文件。示例 DTSC 试验在 补充视频 2 中并排显示。左图显示了一个试验，其中动物成功地支撑了车轮以响应LED CS。在右图中，动物无法移动轮子，直到施加触觉刺激US。
在DTSC范式上训练的动物的反应相对于UR的时间过程和振幅显示出与在DEC上训练的动物的定性相似性。幼稚的动物应该对CS没有反应，并且只有在反复暴露于配对的CS和美国之后，才学会向后移动轮子以响应CS。随着训练的进行，CR的频率和振幅增加（图4A，B）。在DTSC的情况下，我们发现训练早期的UR振幅是学习成功与否的良好预测指标。在与产生低振幅UR（<20 cm / s）的美国训练动物队列中，没有动物在训练4天后学会持续产生CR（图4C，D）。
DEC和DTSC培训之间的差异
DEC和DTSC在重要方面有所不同。首先，DTSC在这个平台上的学习发生得更快，大多数动物在训练的第三天达到高度的任务熟练程度，到第五天达到渐近表现。对于大多数动物来说，DEC学习速度至少慢3天。其次，DTSC系统集成了对成功CR的自动检测，其作为设备的反馈信号，以降低触觉刺激的幅度。该训练程序模仿眨眼调节，其中改进的CR性能提供部分保护，免受令人厌恶的角膜气扑。相比之下，DTSC范式中的头部固定动物无法仅通过运动反应来保护自己免受触觉刺激。通过将美国振幅基于CR的存在，动物有机会保护自己免受令人厌恶的刺激。
图 1：平台属性和设计。 （A） 用于记录头部固定条件下动物行为的平台元素。鼠标改编自Biorender图像。（B）DEC和DTSC条件反射的时序和刺激。用户定义的激励间隔 （ISI） 决定了仅 CS 纪元的持续时间。CS 和美国纪元旨在共同终止。（C） 展示关键平台元素放置的图片。1）步进电机用于控制DTSC US。2）动物的跑轮。3）用于跟踪车轮运动的旋转编码器。4）泡沫贴在丙烯酸臂上，用作DTSC触觉刺激。5） LED CS. 6） 提供 DEC US 的电磁阀和出口。7）Picamera用于记录动物行为。8）用于舞台照明的红外LED。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：平台硬件元件的接线。 （A）完全组装时平台硬件的跳线图。电线由模块着色，橙色=相机模块;黄色 = DEC US 模块;蓝色 = 发光二极管 CS 模块;紫色 = DTSC US 模块;绿色 = 旋转编码器模块。picamera被排除在外，但连接到位于Raspberry Pi表面上的相机串行接口。电池表示指定电压下的直流电源。（B-F）隔离模块的等效布线方案。导线已经过重新着色，因此红色和黑色始终分别表示正电源轨和接地，而其他导线则着色以允许电路易于跟随。请点击此处查看此图的大图。
图 3：DEC 训练的代表性结果。 （A） 具有可接受照明条件的会话的示例相机帧。注意眼睛和眼周皮毛之间的高对比度（B）在DEC范式中几天进行的会议期间，单个动物的表现。水平线表示每次试验的表现，暖色表示眼睑闭合程度更高。最左边的红色黑色垂直线表示 CS 的开始，而虚线表示美国的开始。第二条实线表示 CS 和 US 的停止。请注意，在 CS 期间成功响应的试验数量在各个训练期间会增加。（C）动物表现来自（B）的个体痕迹，从每天的试验平均值中得出。色相饱和度表示会话编号，对于以后的会话，饱和度较高。（D）DEC组所有动物的表现（n = 7）。细线表示每只动物每次会话中可检测到CR的试验百分比。粗线表示所有动物的会话平均值。（E） 来自照明条件欠佳的会话的示例摄像机帧。（F） 对光照较差的单项试验进行量化。UR是可检测的，但与最佳光照条件下相比，对比度更低，变异性更高。（G） （F）中介绍的试验的会话平均痕迹。 请点击此处查看此图的大图。
图4：DTSC训练的代表性结果。 （A）在DTSC范式中几天进行的单只动物在会话期间的表现。水平线表示每次试验的表现，暖色表示车轮向后移动。最左边的黑色垂直线表示 CS 的开始，而虚线表示美国的开始。第二条实线表示 CS 和 US 的停止。（B）动物表现来自（A）的个体痕迹，从每天的试验平均值中得出。色相饱和度表示会话编号，对于以后的会话，饱和度较高。（C）DTSC组所有动物的表现（n = 6）。细线表示每只动物每次会话中可检测到CR的试验百分比。粗线表示所有动物的会话平均值。（D）单项试验，如（A）中来自美国强度引发低振幅UR的队列。（E）（B）中呈现的受弱美国动物的会话平均迹线。（F）DTSC中所有动物的性能，美国弱（n = 6）。 请点击此处查看此图的大图。
补充视频 1：示例 DEC 命中和未命中试验。 在视频1中比较DEC试验。每个视频都显示了受试者制作（左）或未能制作（右）目标CR的试验，并并排播放以进行比较。当每个视频的左上角出现蓝色方块时，LED CS 亮起。当白色方块取代蓝色方块时，美国控制信号处于活动状态。CS 和 US 控制信号在平方消失时同时终止。 请点击此处下载此视频。
补充视频 2：示例 DTSC 命中和未命中试验。 视频 2 显示了 DTSC 试验比较。每个视频都显示了受试者制作（左）或未能制作（右）目标CR的试验，并并排播放以进行比较。当每个视频的左上角出现蓝色方块时，LED CS 亮起。当白色方块取代蓝色方块时，美国控制信号处于活动状态。CS 和 US 控制信号在平方消失时同时终止。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
此处概述的具有相关协议的平台可用于可靠地跟踪两个感官联想学习任务中的动物行为。每个任务都依赖于通过攀爬纤维路径的完整通信。在这里描述的设计中，我们加入了促进小脑反应的学习和记录/扰动的元素。这些包括一个允许自由运动的轮子11，18 以及头部固定。滚轮允许小鼠受试者自由运动，这已被观察到对于DEC采集18至关重要。小鼠的头部固定使研究人员能够利用遗传，电生理学，成像和光遗传学方法，这些方法在其他模型物种中或在自由移动的条件下更难使用12。我们已经将我们的设计用于这些应用中的每一个。在微控制器上运行的软件可以很容易地适应于控制多光子采集或与光遗传学刺激同步的定时信号，两者都具有亚毫秒级的精度。当这些与行为实验相结合时，必须注意尽量减少动物对光遗传学和成像设备的感知。例如，当成像采集开始时，许多多光子系统会从其恒电流扫描仪或快门发出可听见的声音。如果习得是由试验开始触发的，那么这些声音可以作为动物受试者的无意暗示，即刺激即将到来。
行为设备的控制是围绕SBC构建的，SBC用于生成用于管理实验，相机和数据导出的图形用户界面。SBC还向两个微控制器发送命令，这些微控制器处理试验的计时，并直接控制硬件组件，如激励演示和旋转编码器。这里详述的协议是使用连接到Arduino的Raspberry Pi 3B +或4B进行测试的，由于控制实验时间，Arduino Uno控制DTSC US的呈现。其他硬件设计实现是可能的，但尚未使用提供的软件进行测试。
为了便于并行使用多个钻机，我们建议在“无头”模式下操作 SBC。在此配置中，主计算机用于与 SBC 交互。以太网交换机允许同时连接到主机和 SBC 的互联网连接。该交换机还允许主机和 SBC 之间的直接通信，并具有快速数据传输。因此，该交换机允许轻松进行数据传输和 SBC 包维护。
要并行运行多个钻机，每个钻机应放置在其自己的专用外壳中。如果这些外壳彼此靠近放置，则必须包括隔音装置。抑制相邻设备之间的声音有助于避免邻近外壳中产生的刺激的无意听觉线索。
使用DEC和DTSC的单一平台使调查人员能够灵活地驾驭每种范式的优缺点。DEC拥有数十年来对任务学习和执行中涉及哪些大脑区域和特定小脑回路元件的研究的见解1，4，11，13，14，15，19。然而，在小鼠中，最常与眨眼调节相关的小脑皮层区域11，12 位于原发性小脑裂的深处（尽管参见15，17，27 ，其显示浅表小叶VI的DEC相关区域）。用于学习的深层位点使光学实验的获取复杂化，特别是细胞活性的多光子成像和光遗传学扰动实验。相反，DTSC的小脑底物部分位于小叶IV / V20的浅表方面。因此，DTSC提供了与背侧新皮层相当的光学通道，背侧新皮层是系统神经科学研究的热门场所。
在我们的设计中，使用连接到车轮和摄像头的旋转编码器跟踪动物行为。我们选择这些方法是为了降低成本和易于实施。在某些情况下，其他跟踪方法可以提供更高的空间和时间精度。例如，DEC中的眼睑位置通常使用霍尔效应传感器28，29或眶周肌眶周区域的眼睑区域30，31进行跟踪。同样，通过检测车轮运动来跟踪运动，与基于图像的姿势跟踪算法（如SLEAP32和DeepLabCut 33）相比，动物行为的详细情况不那么详细。基于相机的录制允许添加此类方法。
在这里，我们提出了一个平台，用于在两种攀爬纤维依赖性联想学习范式中跟踪动物行为。我们的平台旨在提高这些方法在成本和实施便利性方面的可访问性。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家心理健康研究所NRSA F32 MH120887-03（G.J.B.）和R01 NS045193和R01 MH115750（S.S-H.W.）的资助。我们感谢Bas Koekkoek博士和Henk-Jan Boele博士为优化DEC设置而进行的有益讨论，并感谢Yue Wang博士和Xiaoying Chen博士为优化DTSC设置而进行的有益讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "B" Quick Base For C&B METABOND - 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst - 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable - M/M - 2 m Micro HDMI to DVI Cable - 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male - 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor - 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C - 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires - 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND - 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 - 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable - A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
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