Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Autofluorescence Imaging for å evaluere cellulær metabolisme

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

Denne protokollen beskriver fluorescensavbildning og analyse av endogene metabolske koenzymer, redusert nikotinamid adenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) og oksidert flavin adenin dinukleotid (FAD). Autofluorescence imaging av NAD (P)H og FAD gir en etikettfri, ikke-ødeleggende metode for å vurdere cellulær metabolisme.

Abstract

Cellulær metabolisme er prosessen der celler genererer energi, og mange sykdommer, inkludert kreft, er preget av unormal metabolisme. Redusert nikotinamid adenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) og oksidert flavin adenin dinukleotid (FAD) er koenzymer av metabolske reaksjoner. NAD(P)H og FAD utviser autofluorescens og kan isoleres av eksitasjons- og utslippsbølgelengder. Både koenzymer, NAD (P)H og FAD, kan eksistere i enten en fri eller proteinbundet konfigurasjon, som hver har en tydelig fluorescens levetid - tiden som fluoroforen forblir i spent tilstand. Fluorescens livstidsavbildning (FLIM) tillater kvantifisering av fluorescensintensiteten og levetiden til NAD (P)H og FAD for etikettfri analyse av cellulær metabolisme. Fluorescensintensitet og livstidsmikroskop kan optimaliseres for avbildning av NAD(P)H og FAD ved å velge passende eksitasjons- og utslippsbølgelengder. Metabolske perturbasjoner ved cyanid verifiserer autofluorescence imaging protokoller for å oppdage metabolske endringer i celler. Denne artikkelen vil demonstrere teknikken for autofluorescence imaging av NAD (P)H og FAD for måling av cellulær metabolisme.

Introduction

Metabolisme er den cellulære prosessen med å produsere energi. Cellulær metabolisme omfatter flere veier, inkludert glykolyse, oksidativ fosforylering og glutaminolyse. Sunn celler bruker disse metabolske veiene for å generere energi til spredning og funksjon, for eksempel produksjon av cytokiner av immunceller. Mange sykdommer, inkludert metabolske forstyrrelser, kreft og nevrodegenerasjon, er preget av endret cellulær metabolisme1. For eksempel har noen kreftcelletyper forhøyede glykolysehastigheter, selv i nærvær av oksygen, for å generere molekyler for syntese av nukleinsyrer, proteiner og lipider2,3. Dette fenomenet, kjent som Warburg-effekten, er et kjennetegn på mange krefttyper, inkludert brystkreft, lungekreft og glioblastomer4. På grunn av endringene i cellulær metabolisme forbundet med kreftprogresjon, kan cellulær metabolisme være en surrogatbiomarkør for legemiddelrespons5,6. Videre er det avgjørende å forstå legemiddeleffekten på cellenivå, da celle heterogenitet kan føre til forskjellige legemiddelresponser hos personer7,8.

Teknologier som identifiserer og kvantifiserer endringer i cellulær metabolisme er avgjørende for studier av kreft og legemiddelrespons. Kjemiske og proteinanalyser brukes til å evaluere metabolismen av celler eller vev, men mangler encellet oppløsning og romlig informasjon. Metabolske plateleserbaserte analyser kan måle pH- og oksygenforbruk i prøven over tid og den påfølgende metabolske perturbasjonen av kjemikalier. pH kan brukes til å beregne den ekstracellulære forsuringshastigheten (ECAR), som gir et innblikk i cellenes glykolytiske aktivitet9. Avbildningsmetoder for hele kroppen, inkludert 2-[fluor-18] fluor-D-glukose positronutslippstomografi (FDG PET) og magnetisk resonansspektroskopi (MRS), er ikke-invasive avbildningsmodaliteter som brukes klinisk for å identifisere tumor gjentakelse og legemiddeleffekt gjennom metabolske målinger10,11,12,13,14.

FDG-PET tar bilder av vevsopptaket til FDG, en radiomerket glukoseanalog. Økt opptak av FDG-PET av svulster i forhold til omkringliggende vev skyldes Warburg-effekten12,13. MRS-bilder vanlige kjerner av molekyler som brukes til metabolisme, for eksempel 13C og 31P, og kan få dynamisk informasjon om hvordan metabolisme endres som respons på stimuli, for eksempel trening eller spising14. Selv om FDG-PET og MRS kan brukes klinisk, mangler disse teknologiene den romlige oppløsningen for å løse intratumoral heterogenitet. På samme måte gjøres oksygenforbruksmålinger på en bulkpopulasjon av celler. Autofluorescence imaging overvinner den romlige oppløsningen hinderet for disse teknologiene og gir en ikke-invasiv metode for kvantifisering av cellulær metabolisme.

Figure 1
Figur 1: NADH og FAD i vanlige metabolske veier. NADH og FAD er koenzymer som brukes i glykolyse, Krebs-syklusen og elektrontransportkjeden. Autofluorescence avbildning av disse molekylene gir informasjon om cellulær metabolisme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Redusert nikotinamid adenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) og oksidert flavin adenin dinukleotid (FAD) er koenzymer av metabolske reaksjoner, inkludert glykolyse, oksidativ fosforylering og glutaminolyse (figur 1). Både NAD(P)H og FAD er autofluorescerende og gir endogen kontrast for fluorescensavbildning1,15. NADPH har lignende fluorescerende egenskaper som NADH. På grunn av dette brukes NAD(P)H ofte til å representere det kombinerte signalet til NADH og NADPH2,16.

Fluorescens livstidsavbildning (FLIM) kvantifiserer fluorescenslevetiden eller tiden som en fluorofor er i spent tilstand. Fluorescenslevetidene reagerer på mikromiljøet i fluoroforene og gir informasjon om cellulær metabolisme17. NAD(P)H og FAD kan eksistere i celler i enten proteinbundne eller frie konformasjoner, som hver har forskjellig levetid. Gratis NAD(P)H har kortere levetid enn proteinbundet NAD(P)H; på den annen side har fri FAD lengre levetid enn bundet FAD18,19. Levetids- og levetidskomponentvektene kan kvantifiseres fra fluorescenslevetidsforfallsdata gjennom Eq. (1)20:

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) representerer den normaliserte fluorescensintensiteten som en tidsfunksjon. Den α 1 og α 2 i denne ligningen representerer de proporsjonale komponentene i kort og lang levetid (henholdsvis α 1+ α 2 = 1), henholdsvis τ1 og τ2 representerer henholdsvis korte og lange levetider, og C står for bakgrunnslys7,20. Den amplitudevektede levetiden, representert her som τm, beregnes ved hjelp av Eq. (2).

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

En gjennomsnittlig levetid kan beregnes ved å beregne "t" over fluoroforens intensitetsforfall, som for et to eksponentielt forfall er vist av Eq. (3)17,21.

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

Et fluorescensintensitetsbilde kan beregnes fra levetidsbildet ved å integrere fluorescenslevetidens forfall. Autofluorescence avbildning er en ikke-ødeleggende og etikettfri metode som kan brukes til å karakterisere metabolismen av levende celler med en subcellulær oppløsning. Det optiske redoksforholdet gir en optisk analog beregning av cellens kjemiske redokstilstand og beregnes som forholdet mellom NAD(P)H- og FAD-intensiteter. Selv om formelen for beregning av det optiske redoksforholdet ikke er standardisert22,23,24,25, er det her definert som intensiteten av FAD over de kombinerte intensitetene til NAD (P)H og FAD. Denne definisjonen brukes fordi den summerte intensiteten i nevneren normaliserer metrikkverdien mellom 0 og 1, og det forventede resultatet av cyanidinhiberingen er en reduksjon i redoksforholdet. Fluorescenslevetidene til fri NAD(P)H og FAD gir innsikt i endringer i det metabolske løsningsmiddelmikromiljøet, inkludert pH, temperatur, nærhet til oksygen og osmolaritet17.

Endringer i fluorescenslevetiden for de bundne fraksjonene av NAD(P)H og FAD kan indikere metabolsk baneutnyttelse og substratspesifikk metabolisme26. Komponentvekter kan tolkes for endringer i fri til den bundne brøkdelen av koenzymene18,19. Til sammen tillater disse kvantitative autofluorescence levetidsmålingene analysen av cellulær metabolisme, og autofluorescence imaging har blitt brukt til å identifisere neoplasmer fra normale vev27,28, karakterisere stamceller29,30, evaluere immuncellefunksjon31,32,33,34,35, måle nevrologisk aktivitet36, 37,38, og forstå legemiddeleffekt i krefttyper som brystkreft og hode- og nakkekreft21,39,40,41,42. Høyoppløselig autofluorescence-avbildning kan kombineres med bildesegmentering for encellet analyse og kvantifisering av intrapopulerings heterogenitet43,44,45,46,47.

NAD(P)H og FAD kan avbildes på enkeltfoton- eller multifotonfluorescensmikroskoper som er konfigurert for intensitet eller livstidsavbildning. For enkeltfotonmikroskoper er NAD(P)H og FAD vanligvis begeistret for bølgelengder på henholdsvis 375-405 nm og 488 nm på grunn av vanlige laserkilder ved disse bølgelengdene48. I to-foton fluorescens excitation, NAD (P)H og FAD vil begeistre ved bølgelengder på ca 700 til 750 nm og 700 til 900 nm, henholdsvis15,49. Når fluoroforene er begeistret, avgir NAD(P)H og FAD fotoner ved bølgelengder mellom ~ 410 nm til ~ 490 nm og ~ 510 nm til ~ 640 nm, henholdsvis15. NAD(P)H og FAD maxima utslipp bølgelengder er ca 450 nm og 535 nm, henholdsvis48.

På grunn av deres forskjellige eksitasjons- og utslippsbølgelengder, kan fluorescensen til de to metabolske koenzymene isoleres spektralt. En forståelse av spektralkarakteristikkene til NAD(P)H og FAD er nødvendig for design og optimalisering av autofluorescence imaging protokoller. Cyanid er en elektrontransportkjede (ETC) kompleks IV-hemmer. Effektene av cyanid på cellulær metabolisme og autofluorescensintensiteter og levetider for NAD(P)H og FAD i celler er godt karakterisert27,40. Derfor er et cyanidperturbasjonseksperiment et effektivt middel for å validere NAD(P)H- og FAD-bildebehandlingsprotokoller. Et vellykket cyanideksperiment gir tillit til at NAD(P)H- og FAD-bildebehandlingsprotokollen kan brukes til å vurdere metabolismen av ukjente grupper eller perturbasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellebelegg for avbildning

  1. Aspirer mediet fra en 80-90% konfluent T-75 kolbe av MCF-7 celler, skyll cellene med 10 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett 2 ml 0,25% trypsin (1x) for å løsne cellene fra kolbebunnen.
  2. Inkuber kolben ved 37 °C i ~4 min. Kontroller cellene under mikroskopet for å bekrefte løsrivelse.
  3. Tilsett umiddelbart 8 ml kulturmedium for å deaktivere trypsin.
  4. Samle cellene i et konisk rør (15 ml eller 50 ml). Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
  5. Sentrifuger cellene 200 × g i 5 min.
  6. Når sentrifugert, aspirerer du supernatanten. Resuspend pellet av celler i 1 ml kulturmedium, og frø 4 × 105 celler på en 35 mm glassbunn bilderett (eller riktig prøveholder for mikroskopet som brukes).
  7. Tilsett 2 ml kulturmedium til bildebehandlingsfatet for å opprettholde cellemetabolismen.
  8. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 24–48 timer før avbildning for at cellene skal feste seg og nå den logaritmiske vekstfasen.
    MERK: Vekstfasen ble bestemt av tidligere erfaring med disse cellene og bekreftet med celledataarket.

2. Multifoton FLIM-avbildning av NAD(P)H og FAD

  1. Slå på alle komponenter i multifoton fluorescensensmikroskopet, inkludert mikroskopet, laserkilden og detektorene som brukes.
  2. Eksempel på plassering
    1. Slå på brightfield-lampen. Pass på at lyset kommer inn i okularet. Velg et mål, vanligvis 20x, 40x eller 100x for celleavbildning. Påfør 1 dråpe av riktig nedsenkingsmedium på toppen av målet [hopp over hvis du bruker et luftmål].
    2. Flytt målet ned for å plassere prøven riktig uten å berøre målet. Plasser glassbunnsfatet på prøveholderen på mikroskopstadiet. Påse at prøven er sikker og ikke beveger seg under avbildning.
    3. Midtstill prøven med målet ved hjelp av X-Y-trinnkontrollen. Når dette er gjort, se inn i okularet og flytt målet opp for å fokusere på cellene.
    4. Hvis mikroskopet er innenfor et kabinett, lukker du lysboksdøren. Åpne programvaren for bildeanskaffelse, klikk kategorien Multiphoton Imaging og angi følgende flerfotonavbildningsparametere: bildestørrelse = 256 x 256 piksler; piksel oppholdstid = 4-25 μs; total tid for bildeanskaffelse = ~60 s; optimalisert detektorforsterkning for enkeltfotontelling = 85% (spesifikk for systemet som brukes).
  3. Bildebehandling av instrumentresponsfunksjon (IRF) og fluorescerende levetidsstandard
    1. Legg ureakrystaller på en glassbunnsfat og fest parabollokket med tape eller parafilm.
      MERK: Urea-krystaller holder seg stabile ved romtemperatur i flere måneder.
    2. Se for deg ureakrystallene.
      1. Plasser urearetten på mikroskopstadiet og fokuser på en ureakrystall.
      2. Sett bølgelengden på eksitasjonslaseren til 900 nm.
      3. Bruk et utslippsfilter som fanger opp 450 nm bølgelengder.
      4. Få et fluorescenslevetidsbilde av ureakrystallen med lasereffekt ved prøven <1 mW og bruk de anbefalte bildeparametrene som er nevnt i trinn 2.2.4.
    3. Bilde de gulgrønne (YG) perlene som en fluorescens levetid standard.
      1. Lag en YG perle lysbilde ved å fortynne YG perle løsning 1:1,000 i sterilt vann. Legg et lite volum (~30 μL) på en glide- eller glassbunnsfat. Dekk med en dekslelip og forsegle kantene på dekslenelip med klar neglelakk.
      2. Plasser YG-perleskuffen på mikroskopstadiet med dekslene på siden av gliden mot målet.
      3. Sett bølgelengden til eksitasjonslaseren til 890 nm
      4. Bruk et utslippsfilter som fanger opp ~500-600 nm bølgelengder.
      5. Få et fluorescenslevetidsbilde av YG-perlen ved hjelp av en lasereffekt ved prøven <1 mW og de anbefalte bildeparametrene [trinn 2.2.4].
      6. Kontroller levetiden til perlen ved hjelp av IRF av urea. Hvis levetiden ikke er ~ 2,1 ns, sjekk om perlen er i kontakt med en annen perle som bidrar til fluorescensslukking, perleløsningen har tørket, perlen er ute av fokus, IRF er ikke nøyaktig, eller skiftet mellom IRF og fluorescensrå er ikke optimalisert [se trinn 4.2.4].
        MERK: Levetiden på ~2,1 ns er stabil over tid.
  4. NAD(P)H-bildebehandling
    1. Plasser glassbunnsfatet med cellene på mikroskopstadiet og fokuser på cellene.
      MERK: Det anbefales at cellene plasseres i et miljøkammer for å opprettholde varme-, fuktighets- og CO2-nivåer under bildeanskaffelse, da disse parametrene kan påvirke cellulær metabolisme.
    2. Juster forsterkningen av detektoren til den optimale verdien for FLIM. I tillegg, endre til ønsket opphold tid-en parameter som indikerer tiden laseren tilbringer på hver piksel av prøven.
      MERK: Disse parametrene skal forbli de samme gjennom resten av prosedyren. Dette er for å sikre konsistens i laserbelysning og detektorinnstillinger for å sikre gyldigheten av de intensitetsbaserte målingene, som er avhengige av laserkraft, skanneparametere og detektorforsterkning. Det er en optimalisert detektorforsterkning for driftsdetektorer i enkeltfotontellingsmodus; Verdien er 85 % for systemet det refereres til.
    3. Sett multifotonlaseren til 750 nm. Kontroller at strømkontrollen for laseren er satt til null i utgangspunktet, slik at cellene ikke blir skadet når lukkeren åpnes på laseren.
      MERK: Eksitasjon ved 750 nm anbefales for NAD(P)H, selv om den har bred absorpsjon ved 700-750 nm. Eksitasjon ved 890 nm anbefales for FAD, selv om den har bred absorpsjon ved 700-900 nm.
    4. Still inn eller velg et utslippsfilter for å samle utslippsbølgelengder ved ~400-500 nm.
    5. Begynn å se på en fokuserings- eller live-visning for å optimalisere bildeinnstillingene.
      MERK: Laseren er nå i drift. Ikke åpne mikroskopkabinettet på dette tidspunktet. Bruk egnet personlig verneutstyr.
    6. Øk laserkraften sakte til ~ 3-8 mW ved prøven, samtidig som du sikrer at cellene er i fokus. Når den er justert, registrerer du den maksimale effekten som brukes. Bruk denne strøminnstillingen for avbildning på andre segmenter av Petri-parabolen for NAD(P)H-bildebehandling.
      MERK: Det er viktig å måle lasereffekten ved prøven eller et avtakningsvindu og ikke stole på pockels cellespenning, da pockelscellene ikke er stabile. Ofte overvåkes laserkraft under bildebehandling med et avvalgsvindu i stedet for ved prøven. Ved hjelp av en annen kraftmåler på målet kan forholdet mellom kraften ved pick-off-vinduet og strømmen ved prøven brukes til å estimere omtrentlig effekt ved prøven fra målinger av avplukkingsvinduet.
    7. Samle et NAD(P)H FLIM-bilde med en bildeintegreringstid på 60 s.
    8. Kontroller at bildet har tilstrekkelige fotoner (topp på ~ 100 fotoner for en cytoplasma piksel) innenfor fluorescensens levetid forfallskurve. Hvis antallet fotoner er for lavt, øker du lasereffekten eller varigheten av bildeanskaffelsen.
      MERK: Minimum topp antall fotoner innenfor fluorescens eksponentiell forfall er avhengig av systemparametere, inkludert temporal oppløsning, IRF og bakgrunnsstøy.
  5. FAD-avbildning
    1. Sett multifotonlaseren til 890 nm og vent til den er i moduslås ved den nye bølgelengden. Kontroller at strømkontrollen for laseren er satt til null i utgangspunktet, slik at cellene ikke blir skadet når lukkeren åpnes på laseren.
      MERK: Ikke flytt scenen eller objektivt fokus når du utfører dette trinnet. FAD-synsfeltet (FOV) skal samsvare direkte med NAD(P)H FOV for dette bildet.
    2. Still inn eller velg et utslippsfilter for å samle utslippsbølgelengder ved ~500-600 nm.
    3. Begynn å se på en fokuserings- eller live-visning for å optimalisere bildeinnstillingene.
      MERK: Laseren er nå i drift. Ikke åpne mikroskopkabinettet på dette tidspunktet.
    4. Øk laserstrømmen sakte til ~ 5-10 mW ved prøven og registrer maksimal effekt som brukes. Bruk dette som strøminnstilling for avbildningen på andre segmenter av Petri-parabolen for FAD-bildebehandling.
    5. Samle et FAD FLIM-bilde med en bildeintegreringstid på 60 s.
    6. Kontroller at bildet har tilstrekkelige fotoner (topp på ~ 100 fotoner for en cytoplasma piksel) innenfor fluorescensens levetid forfallskurve. Hvis antallet fotoner er for lavt, øker du lasereffekten eller varigheten av bildeanskaffelsen.
      MERK: Minimum topp antall fotoner innenfor fluorescens eksponentiell forfall er avhengig av systemparametere, inkludert temporal oppløsning, IRF og bakgrunnsstøy.
  6. Gjenta trinn 2.4-2.5 med ytterligere fire til fem FOVer. Kontroller at hvert bilde har plass til minst to FOVer unna de avbildede plasseringene.

3. Forberedelse av cyanideksperiment

  1. Løs opp 130,24 mg natriumcyanid i 25 ml PBS for å lage en 80 mM (20x) natriumcyanidoppløsning.
    MERK: Cyanid er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr.
  2. Aspirer 100 μL kulturmedium fra parabolen. Erstatt dette med 100 μL natriumcyanidoppløsning for å oppnå en 4 mM konsentrasjon av cyanid i parabolen.
  3. Sett cellene i en inkubator i 5 min for å la cellene reagere med cyanidoppløsningen.
  4. Gjenta trinn 2.4-2.6 for å hente NAD(P)H- og FAD-bilder av cellene etter cyanideksponering.
    MERK: Langvarig eksponering for cyanid vil drepe cellene. Postcyanidbilder er anskaffet innen 30 minutter etter cyanidtilskuddet.

4. FLIM-bildeanalyse

  1. Åpne FLIM-programvaren for levetidsanalyse.
    1. Åpne ureabildet for å hente den målte IRF.
    2. Importer urea-bildet. Velg et punkt på bildet av ureakrystallen som skal brukes til bildeanalyse. Øk den romlige bin-verdien for å integrere FLIM-data fra flere piksler til 1 eller høyere for en forfallstopp > 100 fotoner ved å endre Bin-variabelen som ligger på hovedprogramvaregrensesnittet.
    3. Lagre dataene som en IRF.
      1. I programvaren det refereres til, klikker du på rullegardinmenyen med tittelen IRF, og velger Kopier fra Decay Data. Etter dette klikker du kopier til utklippstavlen for å bli brukt i bildeanalysen av bildet som ble tatt under eksperimentet.
  2. Bildeanalyse av NAD(P)H og FAD livstidsbilder
    1. Importer bildefilen til programvare for fluorescenslevetidsanalyse.
    2. Forbedre bildevisualiseringen for å se cellene og subcellulære rom ved å endre intensiteten og kontrasten om nødvendig.
      1. Klikk rullegardinmenyen Alternativer , og velg Intensitet. Her endrer du intensiteten og kontrasten etter ønske og klikker ok.
    3. Importer IRF fra urea-bildet.
      1. Klikk rullegardinmenyen IRF , og velg Lim inn fra utklippstavlen.
    4. Angi multieksponentielle forfallsparametere50.
      1. Angi en terskelverdi for å evaluere forfall for cytoplasma piksler.
        MERK: Her ble det brukt en verdi på 50. Verdien ble valgt ved å sammenligne fluorescenstoppverdiene for flere representative bakgrunns- og kjernepiksler med toppverdien til flere cytoplasma piksler. En verdi mellom kjernebildepunktene og cytoplasmabildepunktene ble valgt for terskelen.
    5. Kontroller at Skift-verdien justerer IRF i forhold til den stigende kanten av fluorescensen. Juster skiftet om nødvendig til en verdi som minimerer den kjikvadrerte verdien.
    6. Øk romskuffen slik at cytoplasma piksler har fluorescens toppverdier på eller over 100.
      MERK: Hvis du øker romskuffen, vil det føre til redusert romlig oppløsning.
    7. Beregn fluorescenslevetider for alle bildepunkter i bildet.
      1. I programmet det refereres til, klikker du på rullegardinmenyen Beregn | Forfallsmatrise.
        MERK: Suksess er indikert med et bilde som er falskt farget til den amplitudevektede fluorescenslevetiden.
    8. Lagre levetidsdataene for fluorescens.
      1. Klikk rullegardinmenyen Fil | Eksporter. Velg de ønskede parametrene for analyse, og klikk OK. Lagre bildet.
      2. Velg Farge-knappen på rullegardinmenyen Alternativer for å justere lysstoffrørsverdien for levetid som vises, fargekonfigurasjonen til B-G-R, og angi de spesifikke minimums- og maksimumsverdiene for fargelinjen for å justere fargeskalaen til bildet for fluorescenslevetid.

Figure 2
Figur 2: Målt IRF av ureakrystall. (A) Intensitetsbilde hentet fra urea. En representativ piksel ble valgt for å lage IRF-forfallskurven (B) for etterfølgende analyse av fluorescenslevetidsbilder av celler. Forkortelse: IRF = instrumentresponsfunksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Segmentering av celler
    MERK: Protokollen som er beskrevet her, bruker en programvare for bildeanalyse51. Representative MCF-7 bilder og dataanalysekode er gitt52.
    1. Last ned filen MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. Importer MCF7_Segmentation Pipeline ved å klikke på Fil | Importere | Pipeline fra fil, velg filen MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. Klikk på Bilder-modulen og legg til NAD(P)H-intensitetsbildene som skal segmenteres.
      MERK: Bilder må være i.tif-, .png- eller .jpg-format.
    4. Trykk på Analyser bilder-knappen nederst til venstre.
      MERK: Rørledning kan trenge optimalisering for bilder som er anskaffet på forskjellige systemer. Hvis du vil feilsøke, kan du prøve følgende deltrinn
      1. Bruk testmodusen til å teste forskjellige parametere: Klikk på Start testmodus og kjør hver modul ved å klikke på avspillingsknappen ved siden av modulnavnet.
      2. Klikk den første IdentifyPrimaryObjects-modulen, og juster vanlig diameter for objekter i pikselenheter (Min, Maks) slik at de samsvarer med diameteren på cellene.
        MERK: For MCF-7-celler ble henholdsvis 10 og 40 piksler brukt for henholdsvis minimum og maksimum.
      3. Klikk enhanceOrSuppressFeatures-modulen , og juster funksjonsstørrelsen for å forbedre identifikasjonen av den valgte funksjonstypen.
        MERK: En funksjonsstørrelse på 10 piksler ble brukt for MCF-7-celler.
      4. Klikk på den andre EnhanceOrSuppressFeatures-modulen og juster området for hullstørrelser for å optimalisere forbedringen av atomområdene.
        MERK: Et område på 5-20 ble brukt for MCF-7 celler.
      5. Klikk den andre IdentifyPrimaryObjects-modulen, og juster parameterne (Terskelstrategi, Terskelverdi-metoden, Terskelutjevningsskala og Terskelkorrigeringsfaktor) for å optimalisere identifiseringen av kjerner. Klikk på ? av hver parameter for å identifisere optimale innstillinger og bruke på IdentifySecondaryObjects -modulen.
      6. Klikk FilterObjects -modulen, og juster områdefiguren. Velg en minimums- og maksimumspiksel for områdefiguren som skal identifiseres.
        MERK: For MCF-7-cellene ble henholdsvis 100 og 500 brukt til henholdsvis maksimum og minimum. Prosessen med cellesegmentering ved å identifisere kjernen og forplantningen til cellegrensene forklares i detalj av Walsh og Skala47.
    5. Bruk cellecytoplasmamaskene til å beregne gjennomsnittlig levetid for hver celle i bildet.

Figure 3
Figur 3: Identifisering og segmentering av enkeltceller. NAD(P)H-intensitetsbildet av MCF7-celler (A) oppnådd ved å integrere et fluorescenslevetidsbilde. Celler ble avbildet ved hjelp av 750 nm eksitasjon ved 5 mW i 60 s. X- og y-aksene representerer pikselplasseringen til bildet. (A) Individuelle celler ble identifisert. Cellene ble maskert (B) for å eliminere bakgrunnsstøy fra datasettet. Kjernen ble deretter identifisert (C) og projisert på cellemasken (D). Cellene ble deretter filtrert (E) for å fjerne maskerte områder som ikke passer til størrelsen på vanlige celler. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Alternativ metode: Fluorescensintensitetsavbildning

  1. Slå på utstyret som skal brukes under eksperimentet.
    MERK: Fluorescensintensitetsbilder kan anskaffes med bredfelts fluorescensmikroskoper, konfiske fluorescensmikroskoper eller multifotonmikroskoper.
    1. Forsikre deg om at mikroskopet som skal brukes har en passende eksitasjonskilde for NAD (P)H (enkeltfotonbølgelengde ~ 370-405 nm: to-foton bølgelengde ~ 700-750 nm) og FAD (enkeltfotonbølgelengde ~ 488 nm, to-foton bølgelengde ~ 890 nm).
    2. Påse at mikroskopet har et filter for isolering av NAD(P)H-utslipp (~400-500 nm).
      MERK: 4',6-Diamidino-2-fenylindole (DAPI) innstillinger fungerer ofte for NAD (P)H.
    3. Påse at mikroskopet har et filter for isolering av FAD-utslipp (~500-600 nm).
      MERK: Grønne fluorescerende proteininnstillinger (GFP) fungerer ofte for FAD.
  2. Forbered mikroskopet.
    1. Slå på brightfield-lampen. Pass på at lyset kommer inn i okularet. Påfør 1 dråpe av riktig nedsenkingsmedium på toppen av det tilsvarende målet om nødvendig.
    2. Flytt målet ned for å plassere prøvene riktig uten forstyrrelser. Plasser Petri-retten riktig på scenen. Påse at prøven er sikker og ikke beveger seg under avbildning.
      MERK: Det anbefales at cellene plasseres i et miljøkammer for å opprettholde varme-, fuktighets- og CO2-nivåer under bildeanskaffelse, da disse parametrene kan påvirke cellulær metabolisme.
    3. Sentrer prøven med målet. Når dette er gjort, se inn i okularet og flytt målet til cellene ser ut til å være i fokus.
  3. Start intensitetsavbildning.
    1. Åpne bildebehandlingsprogramvaren og sett eksitasjons- og utslippskonfigurasjonen for å fange NAD (P)H ved å klikke på Capture-fanen i bildeanskaffelsesprogramvaren og plassere NAD (P)H-eksitasjons- og utslippsfilteret i mikroskoptårnet.
      MERK: Et 357/44 eksitasjonsfilter, 409 longpass dikroic og 447/60 utslippsfilter ble brukt til NAD(P)H-avbildning.
    2. Optimaliser eksitasjonsbelysningen og detektorparametrene. Hvis bleking er et problem, reduserer du belysningsintensiteten og øker bildeintegreringstiden.
      MERK: NAD(P)H er et svakt signal; vær oppmerksom på bleking hvis det brukes for mye strøm.
    3. Skaff deg et NAD(P)H-bilde av ønsket bildestørrelse. Kontroller at bildet er lagret.
    4. Angi eksitasjons- og utslippskonfigurasjonen for å fange OPP FAD. Optimaliser eksitasjonsbelysningen og detektorparametrene.
      MERK: Et 458/64 eksitasjonsfilter, 495 longpass dikroisk og 550/88 utslippsfilter ble brukt til FAD-avbildning.
    5. Skaff deg et FAD-bilde. Kontroller at bildet er lagret.
      MERK: NAD(P)H og FAD bildeanskaffelsesparametere (belysningsintensitet, bildestørrelse, detektorforsterkning) bør forbli de samme gjennom bildebehandlingseksperimentet.
    6. Gjenta prosessen på ytterligere fem steder, med plass til minst to FOVer unna de avbildede stedene.
  4. Dataanalyse for redoksforhold på bildenivå
    1. Åpne NAD(P)H- og FAD-intensitetsbildene i et bildebehandlingsprogram.
    2. Angi en terskel på NAD(P)H for å beholde cytoplasma piksler og sette bakgrunns- og kjernepiksler til 0.
    3. Beregn bildet av redoksforholdet ved å evaluere ligningen FAD/(NAD(P)H+FAD) ved hvert bilde ved hjelp av bildet for terskelverdier for NAD(P)H.
    4. Beregn gjennomsnittsverdien for ikke-0 bildepunkter.
      MERK: Disse trinnene kan utføres i bildeanalyseprogramvare eller kodes direkte med skript.
  5. Analyse av redoksforhold på cellenivå
    1. Følg trinn 4.3.1-4.3.5 for å få et maskebilde av cellene i hvert NAD(P)H-bilde.
    2. Beregn bildet av redoksforholdet ved å evaluere ligningen FAD/(NAD(P)H+FAD) ved hvert bildepunkt.
    3. Bruk cellecytoplasmamasken til å beregne gjennomsnittet av redoksforholdet for alle bildepunkter for hver celle i bildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den epiteliale brystkreftcellelinjen, MCF-7, ble dyrket i DMEM supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. For fluorescensavbildning ble cellene sådd med en tetthet på 4 × 105 celler per 35 mm glassbunnavbildningsfat 48 timer før avbildning. Cellene ble avbildet før og etter cyanidbehandling ved hjelp av protokollene nevnt ovenfor. Målet med cyanideksperimentet er å bekrefte spektral isolering av NAD(P)H og FAD fluorescens og validere bildesystemet og analyseprotokollen for å oppdage metabolske endringer i celler. Parrede NAD(P)H- og FAD-fluorescenslevetidsbilder ble tatt på fem forskjellige steder før cyanid og fem forskjellige steder etter tilsetning av cyanid til mediet. Fluorescens levetidsparametere (optisk redoksforhold, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1, FAD τ2 og FAD τm) ble beregnet ved hjelp av det målte IRF fra urea (figur 2) og gjennomsnittet på tvers av pikslene i cytoplasma i hver celle som brukes til segmentering (figur 3).

Multifoton fluorescens livstidsavbildning av NAD(P)H og FAD tillater visualisering av cellemorfologi og metabolisme (figur 4). Den høye oppløsningen oppnådd med multifotonmikroskopi gjør det mulig å identifisere enkeltceller. NAD(P)H og FAD ligger hovedsakelig i mitokondriene og cytoplasma, mens kjernen, som mangler metabolsk NAD(P)H og FAD, er mørk i sammenligning23,53. Livstidsbildene gir visualisering av de amplitudevektede levetidene til NAD(P)H og FAD i hele cellen og som følge av cyanideksponering (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Representative fluorescens livstidsbilder av MCF7-celler før og etter cyanidbehandling. (A) NAD(P)H amplitudevektet fluorescenslevetidsbilde og (B) FAD amplitudevektet fluorescenslevetidsbilde før cyanidbehandling. (C) NAD(P)H amplitudevektet fluorescenslevetidsbilde og (D) FAD amplitudevektet fluorescenslevetidsbilde etter cyanidbehandling. Den amplitudevektede fluorescenslevetiden (indikert av fargestangen) måler tiden som en fluorofor, i disse tilfellene NAD (P)H og FAD, er i en spent tilstand. NAD(P)H levetid reduseres med cyanidbehandling, mens FAD-levetiden øker etter cyanidbehandling. NADH-signalet ble avbildet ved hjelp av 750 nm eksitasjon ved 5 mW i 60 s, og FAD-signalet ble avbildet ved hjelp av 890 nm eksitasjon ved 7 mW i 60 s. Bilder ervervet med et 40x vann-nedsenkingsmål, numerisk blenderåpning = 1,1. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Cyanid hemmer kompleks IV i elektrontransportkjeden, som hemmer oksidativ fosforylering2,15. Etter cyanideksponering og før celledød akkumuleres NAD(P)H i mitokondriene, og FAD reduseres 1,15. På grunn av disse veldefinerte endringene i NAD(P)H og FAD-intensiteten på grunn av cyanidhemming av metabolisme, er perturbasjonen en standardtest for å verifisere autofluorescence imaging og analyseprotokoller2,54. Som forventet ble det optiske redoksforholdet (FAD/(FAD+NAD(P)H)) av MCF-7-celler redusert etter cyanidbehandling (figur 5, p = 0,044, Welchs t-test). Det optiske redoksforholdet er ikke en standardisert formel, men alle intensitetsformler har vist seg å være ekvivalente20. FAD/(NAD(P)H+FAD) ble valgt for å definere det optiske redoksforholdet fordi den kombinerte summen av NAD(P)H og FAD i nevneren gir en normalisert verdi mellom 0 og 120,55. Den motsatte effekten - en økning i optisk redoksforhold - forventes for cyanidperturbasjoner med optiske redoksforhold beregnet med NAD (P) H i telleren.

Figure 5
Figur 5: Optisk redoksforhold for MCF7-celler reduseres med cyanidbehandling. Boxplots viser medianen og den første og tredje kvartilen beregnet fra celledataene. Gjennomsnittet representeres av det svarte prikksymbolet, og medianen representeres av den svarte linjen inne i boksen. De grå datapunktene som legges over hver boksplott, representerer gjennomsnittsverdien for alle cytoplasmabildepunktene i hver celle. Kontrollgruppen besto av 91 celler fra fem forskjellige bilder, og cyanidgruppen besto av 95 celler fra fem forskjellige bilder. p < 0,01, Welchs t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den amplitudevektede levetiden til NAF7-cellene (P)H ble redusert med cyanideksponering (figur 6A, p < 2,2 × 10-16, Welchs t-test). Både kort og lang levetid gikk ned for NAD(P)H (figur 6B,C), men økte for NAD(P)H α 1 (figur 6D). Disse endringene i NAD(P)H fluorescenslevetid, reduksjon i τm, økning i α 1 og reduksjon i τ2 samsvarte med publiserte verdier av cyanidperturbasjoner40,56. Nedgangen i NAD(P)H amplitudevektet fluorescenslevetid med cyanideksponering indikerer økt slukking i mikromiljøet til NAD(P)H. En økning i α 1 indikerer mer gratis NAD (P)H, som forventet fra økningen av NAD (P)H på grunn av effekten av cyanid på cellulær metabolisme21.

Figure 6
Figur 6: NAD(P)H fluorescenslevetid for MCF7-celler før og etter cyanidbehandling. Boksplotene i panelene A-D viser medianen og den første og tredje kvartilen beregnet fra cellenivådataene. Gjennomsnittet representeres av det svarte prikksymbolet, og medianen representeres av den svarte linjen inne i boksen. De grå datapunktene som legges over hver boksplott, representerer gjennomsnittsverdien for alle cytoplasmabildepunktene i en celle. Kontrollgruppen besto av 91 celler fra fem forskjellige bilder, og cyanidgruppen besto av 95 celler fra fem forskjellige bilder. (A-D) viser endringene i NAD(P)H amplitudevektet levetid (τm), NAD(P)H kort levetid (τ1), NAD(P)H lang levetid (τ2) og NAD(P)H-proporsjonal komponent i kort levetid (α 1) på grunn av cyanidbehandling. p-verdier ble beregnet ved hjelp av Welchs t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den amplitudevektede FAD-levetiden (τm) til MCF7-celler økte etter cyanideksponering (figur 7A, p = 3,688 × 10-12, Welchs t-test). Både kort og lang levetid økte for FAD (figur 7B,C), men gikk ned for FAL α 1 (figur 7D). Endringer i fad fluorescens levetid, en økning i τm og τ2, og en nedgang i α 1 er i samsvar med publiserte FAD fluorescens levetidsdata for cyanid perturbation57. Endringen i levetidsverdier og α 1 antyder metabolske endringer i cellene, inkludert en økt mengde gratis FAD21.

Figure 7
Figur 7: FAD fluorescenslevetid før og etter cyanidbehandling. Boxplots i A-D viser median, første og tredje kvartiler, og gjennomsnitt beregnet fra cellenivådataene. Gjennomsnittet representeres av det svarte prikksymbolet, og medianen representeres av den svarte linjen inne i boksen. De grå datapunktene som legges over hver boksplott, representerer gjennomsnittsverdien for alle cytoplasmabildepunktene i en celle. Kontrollgruppen besto av 91 celler fra fem forskjellige bilder, og cyanidgruppen besto av 95 celler fra fem forskjellige bilder. (A-D) viser endringene i FAD amplitudevektet levetid (τm), FAD kort levetid (τ1), FAD lang levetid (τ2) og FAD-proporsjonal komponent i kort levetid (α 1) fra cyanidbehandling. p-verdier ble beregnet ved hjelp av Welchs t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Autofluorescence intensitet og livstidsavbildning har blitt mye brukt til å vurdere metabolisme i celler21,55. FLIM er høyoppløselig og løser derfor enkeltceller, noe som er viktig for kreftstudier fordi cellulær heterogenitet bidrar til tumor aggresjon og narkotikaresistens7,39,41,44,45,46,58. På samme måte er autofluorescence avbildning av cellulær metabolisme nyttig for å avbilde immunceller, da immuncellefunksjon er knyttet til cellulær metabolisme, og immuncellepopulasjoner er ofte heterogene20,31. Standard biokjemiske analyser evaluerer vanligvis immunceller på populasjonsnivå eller krever intracellulær merking etter cellepermeabilisering34,59,60. Autofluorescence imaging er også velegnet for høyoppløselig in vivo og dynamiske målinger av metabolisme på grunn av lysets ikke-destruktive natur og mangel på kjemiske eller genetisk kodede etiketter36,37,38,41,48,55 . Kritiske trinn for avbildning av NAD(P)H og FAD fluorescensintensitet og levetid inkluderer valg av passende bølgelengder for eksitasjon og utslipp, verifisering av at cellene ikke inneholder syntetiske eller ekstra endogene fluoroforer som vil bidra til overlappende fluorescens, og bruk av nondamaging laserkrefter.

Autofluorescence imaging av NAD (P)H og FAD fyller en unik nisje som en etikettfri, høyoppløselig, kvantitativ metabolsk bildeteknologi. Andre avbildningsmetoder, som FDG-PET og MRS, bildevevsmetabolisme, men mangler cellulær nivåoppløsning og kan dermed ikke evaluere cellulær heterogenitet. Andre biokjemiske teknikker, som oksygenforbruksanalyser, målinger av metabolitter i media, eller proteinanalyse, krever dyre engangsreagenser, oppnår målinger fra samlede celler og krever celledestruktive protokoller, forhindrer tidskursstudier eller in vivoanalyse61,62.

Mens autofluorescence imaging av NAD (P)H og FAD gir høyoppløselige bilder på en etikettfri og ikke-ødeleggende måte, må noen begrensninger for autofluorescence-avbildning vurderes ved utforming og tolkning av eksperimenter. FLIM krever spesialisert og dyrt utstyr som ikke er allment tilgjengelig. FLIM-eksitasjonen krever en pulserende eksitasjonskilde med picosecond- eller femtosecond-pulser med repetisjonshastighet mellom 40 og 100 MHz med utgangseffekt > 50 mW63. I tillegg er bildeanskaffelsen relativt treg, med en avveining mellom antall piksler eller bildeoppløsning og bildeanskaffelsestid. Parametrene som anbefales i denne protokollen på 256 x 256 piksler og 60 s integrasjonstid, gir et bilde med rimelig oppløsning innen ca. 1 mi. Brukeren kan velge å ta bilde av mindre områder med færre piksler eller utføre linjeskanninger for å forbedre bildehastigheten.

Alternativt kan bilder med høyere bildepunkt skaffes med økte bildeintegrasjonstider. Dataanalysen og tolkningen av autofluorescence livstidsbilder kan være utfordrende ettersom FLIM gir spesifikk biofysisk informasjon om metabolske koenzymer og deres molekylære miljø i stedet for spesifikke metabolske veier. Optisk mikroskopi er også begrenset av dybden av lysgjennomtrengning i vev på grunn av lysspredning og absorpsjon. In vivo-studier kan gjøres, på dybder på ~ 0,5 mm med multifotonavbildningssystemer, overflatevev eller gjennom vinduskamre2,20,21,64,65.

Mens NAD(P)H og FAD er de primære endogene fluoroforene i isolerte celler, kan ytterligere molekyler, inkludert kollagen og elastin, bidra med autofluorescenssignaler i vev. Høyoppløselige bilder av multifotonmikroskopi tillater visualisering av cellulære og ikke-cellulære rom for segmentering av NAD(P)H- og FAD-piksler fra de ekstracellulære proteinene40. Noen celler inneholder endogene molekyler med overlappende fluorescens, som lipofuscin, retinol, tryptofan og melanin66. Derfor kan autofluorescence bilder av NAD (P)H og FAD inneholde bakgrunnsbidrag fra andre endogene molekyler.

På samme måte, mens NAD (P)H og FAD kan multiplekses med eksogene fluoroforer som avgir ved bølgelengder over 600 nm, eksogene etiketter, for eksempel DAPI eller genetisk kodede proteiner som GFP, overlapper spektralt med autofluorescence imaging. Cyanidperturbasjonseksperturbasjonseksperimentet som er beskrevet her, bidrar til å bekrefte at eksitasjons- og utslippsbølgelengdene isolerer NAD (P)H og FAD tilstrekkelig til å fange metabolske endringer i celler. Andre celletyper kan brukes på denne protokollen. Brukeren bør imidlertid optimalisere bildeparametere, inkludert laserkraft og bildeintegreringstid for hver celletype, og eksperimentere for å forhindre fotobleaching. Photobleaching kan minimeres ved å overvåke antall foton eller gjennomsnittlig fluorescensintensitet under bildebehandling så lenge livstidsskanningen varer. En økning eller reduksjon i fluorescensintensiteten indikerer at lasereffekten er for høy. Hvis laserkrefter induserer fotobleaching, kan strømmen reduseres, og det totale bildeanskaffelsen økte for å oppnå tilstrekkelig fotonsamling for levetidsanalyse.

Selv om fluorescenslevetiden er uavhengig av bildeparametere, inkludert laserkraft og detektorforsterkning, er fluorescensintensiteten avhengig av disse parametrene20. Derfor, når du utfører autofluorescence-avbildning for å kvantifisere det optiske redoksforholdet, er det viktig å bruke konsistente bildeparametere. Protokollen anbefaler at 5-6 bilder av ulike FOVer anskaffes fra hver eksperimentelle gruppe. Denne utvalgsstørrelsen gir tilstrekkelige data både på bilde- og cellenivå for å løse de forventede forskjellene i fluorescenslevetidsparametere for sammenfavnende MCF7-celler på grunn av cyanidperturbasjonen. Det optimale antallet bilder som er anskaffet per gruppe, avhenger av eksperimentell design og effektstørrelse. Når du bytter mellom NAD(P)H- og FAD-bilder, skal fokusplanet forbli det samme på hvert sted for konsistens. Selv om livstidsbilder vanligvis ikke har et mettende antall fotoner, kan intensitetsbilder som er anskaffet med kameraer eller fotomultiplierrør, bli mettet. Pikselmetning bør unngås for å sikre at hele spekteret av fysiologiske intensiteter fanges opp i bildene.

Ved analyse av fluorescenslevetidsbilder kan enten en målt IRF eller en simulert IRF brukes. Den simulerte IRF er estimert fra oppskytingen av fluorescerende levetidskurve; Imidlertid kan den virkelige IRF oppnådd fra systemet være bredere avhengig av systemet og dermed resultere i mer nøyaktige levetidsverdier. Selv om IRF vanligvis bare endres med maskinvare- eller programvareendringer, er en daglig IRF-måling en god praksis for å sikre at fluorescenssystemet fungerer som forventet.

Totalt sett gir autofluorescence imaging av NAD (P)H og FAD en etikettfri, ikke-ødeleggende metode for å avbilde og analysere cellulær metabolisme på encellet nivå. Denne metoden gir en trinnvis tilnærming for å validere avbildningen av NAD(P)H og FAD ved hjelp av cyanid for å indusere en godt karakterisert metabolsk perturbasjon i celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Finansieringskilder inkluderer Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) og Texas A&M University. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532 (2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500 (2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271 (2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456 (2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014 (2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068 (2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008 (2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104 (2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792 (2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Tags

Bioingeniør Utgave 177 FLIM Metabolisme NAD(P)H FAD Fluorescens Mikroskopi
Autofluorescence Imaging for å evaluere cellulær metabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N.,… More

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter