Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Автофлуоресцентная визуализация для оценки клеточного метаболизма

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

Этот протокол описывает флуоресцентную визуализацию и анализ эндогенных метаболических коферментов, восстановленного динуклеотида никотинамидаденина (фосфата) (NAD(P)H) и окисленного флавинадениндинуклеотида (FAD). Автофлуоресцентная визуализация NAD(P)H и FAD обеспечивает безмечаночный, неразрушающий метод оценки клеточного метаболизма.

Abstract

Клеточный метаболизм — это процесс, посредством которого клетки вырабатывают энергию, и многие заболевания, включая рак, характеризуются аномальным метаболизмом. Восстановленный никотинамид аденин (фосфат) динуклеотид (NAD(P)H) и окисленный флавинадениндинуклеотид (FAD) являются коферментами метаболических реакций. NAD(P)H и FAD проявляют автофлуоресценцию и могут быть спектрально изолированы волнами возбуждения и излучения. Оба кофермента, NAD(P)H и FAD, могут существовать либо в свободной, либо в связанной с белком конфигурации, каждая из которых имеет различное время жизни флуоресценции - время, в течение которого флуорофор остается в возбужденном состоянии. Флуоресцентная визуализация времени жизни (FLIM) позволяет количественно оценить интенсивность флуоресценции и время жизни NAD(P)H и FAD для анализа клеточного метаболизма без меток. Микроскопы с интенсивностью флуоресценции и сроком службы могут быть оптимизированы для визуализации NAD(P)H и FAD путем выбора соответствующих длин волн возбуждения и излучения. Метаболические возмущения цианидом проверяют протоколы автофлуоресцентной визуализации для обнаружения метаболических изменений в клетках. В данной статье будет продемонстрирована методика автофлуоресцентной визуализации NAD(P)H и FAD для измерения клеточного метаболизма.

Introduction

Метаболизм – это клеточный процесс производства энергии. Клеточный метаболизм охватывает несколько путей, включая гликолиз, окислительное фосфорилирование и глутаминолиз. Здоровые клетки используют эти метаболические пути для выработки энергии для пролиферации и функционирования, такой как производство цитокинов иммунными клетками. Многие заболевания, включая нарушения обмена веществ, рак и нейродегенерацию, характеризуются измененным клеточным метаболизмом1. Например, некоторые типы раковых клеток имеют повышенные скорости гликолиза, даже в присутствии кислорода, для генерации молекул для синтеза нуклеиновых кислот, белков и липидов2,3. Это явление, известное как эффект Варбурга, является отличительной чертой многих типов рака, включая рак молочной железы, рак легких и глиобластомы4. Из-за изменений клеточного метаболизма, связанных с прогрессированием рака, клеточный метаболизм может быть суррогатным биомаркером лекарственного ответа5,6. Кроме того, понимание эффективности лекарств на клеточном уровне имеет решающее значение, поскольку гетерогенность клеток может привести к различным реакциям на лекарства у людей7,8.

Технологии, которые идентифицируют и количественно оценивают изменения в клеточном метаболизме, необходимы для исследований рака и лекарственного ответа. Химические и белковые анализы используются для оценки метаболизма клеток или тканей, но им не хватает одноклеточного разрешения и пространственной информации. Анализы на основе считывателя метаболических пластин могут измерять рН и потребление кислорода в образце с течением времени и последующее метаболическое возмущение химическими веществами. pH может быть использован для расчета скорости внеклеточного подкисления (ECAR), что дает представление о гликолитической активности клеток9. Методы визуализации всего тела, включая 2-[фтор-18] фтор-D-глюкозо-позитронно-эмиссионную томографию (FDG PET) и магнитно-резонансную спектроскопию (MRS), являются неинвазивными методами визуализации, используемыми клинически для выявления рецидива опухоли и эффективности лекарств с помощью метаболических измерений10,11,12,13,14.

FDG-PET изображает поглощение тканями FDG, радиомаркированного аналога глюкозы. Повышенное поглощение ФДГ-ПЭТ опухолями относительно окружающих тканей обусловлено эффектом Варбурга12,13. MRS изображает общие ядра молекул, используемых для метаболизма, таких как 13C и 31P, и может получать динамическую информацию о том, как метаболизм изменяется в ответ на стимулы, такие как физические упражнения или еда14. Хотя ФДГ-ПЭТ и МРС могут использоваться клинически, этим технологиям не хватает пространственного разрешения для разрешения внутриопухолевой гетерогенности. Аналогичным образом, измерения потребления кислорода производятся на массовой популяции клеток. Автофлуоресцентная визуализация преодолевает препятствие пространственного разрешения этих технологий и обеспечивает неинвазивный метод количественной оценки клеточного метаболизма.

Figure 1
Рисунок 1: NADH и FAD в общих метаболических путях. NADH и FAD являются коферментами, используемыми в гликолизе, цикле Кребса и цепи переноса электронов. Автофлуоресцентная визуализация этих молекул предоставляет информацию о клеточном метаболизме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Восстановленный никотинамид аденин (фосфат) динуклеотид (NAD(P)H) и окисленный флавинадениндинуклеотид (FAD) являются коферментами метаболических реакций, включая гликолиз, окислительное фосфорилирование и глутаминолиз (рисунок 1). Как NAD(P)H, так и FAD являются автофлуоресцентными и обеспечивают эндогенный контраст для флуоресцентной визуализации1,15. NADPH обладает свойствами, аналогичными свойствам NADH. Из-за этого NAD(P)H часто используется для представления комбинированного сигнала NADH и NADPH2,16.

Флуоресцентная визуализация времени жизни (FLIM) количественно определяет время жизни флуоресценции или время, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Время жизни флуоресценции реагирует на микроокружение флуорофоров и предоставляет информацию о клеточном метаболизме17. NAD(P)H и FAD могут существовать в клетках в связанных с белком или свободных конформациях, каждая из которых имеет различное время жизни. Свободный NAD(P)H имеет более короткий срок службы, чем связанный с белком NAD(P)H; и наоборот, свободный FAD имеет более длительный срок службы, чем связанный FAD18,19. Время жизни и вес компонентов в течение срока службы могут быть количественно определены на основе данных о распаде срока службы флуоресценции с помощью экв. (1)20:

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) представляет собой нормализованную интенсивность флуоресценции как функцию времени. Α 1 и α 2 в этом уравнении представляют пропорциональные компоненты короткого и длительного времени жизни (α 1+ α 2 = 1), соответственно, τ1 и τ2 представляют собой короткое и долгое время жизни соответственно, а C учитывает фоновое освещение7,20. Амплитудно-взвешенное время жизни, представленное здесь как τm, вычисляется с использованием Eq. (2).

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

Среднее время жизни может быть вычислено путем усреднения «t» по интенсивности распада флуорофора, что для двухэкспоненциального распада показано экв. (3)17,21.

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

Изображение интенсивности флуоресценции может быть вычислено на основе изображения времени жизни путем интеграции распада времени жизни флуоресценции. Автофлуоресцентная визуализация является неразрушающим и безметочным методом, который может быть использован для характеристики метаболизма живых клеток с субклеточным разрешением. Оптический окислительно-восстановительный коэффициент обеспечивает оптическую аналоговую метрику химического окислительно-восстановительного состояния клетки и рассчитывается как отношение интенсивностей NAD(P)H и FAD. Хотя формула для расчета оптического окислительно-восстановительного соотношения не стандартизирована22,23,24,25, она определяется здесь как интенсивность FAD по комбинированным интенсивностям NAD(P)H и FAD. Это определение используется потому, что суммированная интенсивность в знаменателе нормализует метрику между 0 и 1, а ожидаемым результатом ингибирования цианида является снижение окислительно-восстановительного соотношения. Время жизни флуоресценции свободных NAD(P)H и FAD дает представление об изменениях в микроокружении метаболического растворителя, включая рН, температуру, близость к кислороду и осмолярность17.

Изменения в времени жизни флуоресценции связанных фракций NAD(P)H и FAD могут указывать на использование метаболического пути и субстрат-специфический метаболизм26. Массы компонентов могут быть интерпретированы для изменения свободной до связанной фракции коэнзимов18,19. В целом, эти количественные показатели времени аутофлуоресценции позволяют анализировать клеточный метаболизм, а аутофлуоресцентная визуализация была использована для идентификации новообразований из нормальных тканей27,28, характеризующих стволовые клетки29,30, оценивающих функцию иммунных клеток31,32,33,34,35, измеряющих неврологическую активность36, 37,38, и понимание эффективности лекарств при таких типах рака, как рак молочной железы и рак головы и шеи21,39,40,41,42. Автофлуоресцентная визуализация высокого разрешения может быть объединена с сегментацией изображения для одноклеточного анализа и количественной оценки гетерогенности интрапопуляции43,44,45,46,47.

NAD(P)H и FAD могут быть визуализированы на однофотонных или многофотонных флуоресцентных микроскопах, сконфигурированных для интенсивной или пожизненной визуализации. Для однофотонных микроскопов NAD(P)H и FAD обычно возбуждаются на длинах волн 375-405 нм и 488 нм соответственно из-за общих лазерных источников на этих длинах волн48. При двухфотонном флуоресцентном возбуждении NAD(P)H и FAD будут возбуждаться на длинах волн приблизительно от 700 до 750 нм и от 700 до 900 нм соответственно15,49. Как только флуорофоры возбуждаются, NAD(P)H и FAD испускают фотоны на длинах волн от ~410 нм до ~490 нм и ~510 нм до ~640 нм, соответственно15. Длины волн максимального излучения NAD(P)H и FAD составляют приблизительно 450 нм и 535 нм соответственно48.

Из-за их различных длин волн возбуждения и излучения флуоресценция двух метаболических коферментов может быть спектрально изолирована. Понимание спектральных характеристик NAD(P)H и FAD необходимо для проектирования и оптимизации протоколов автофлуоресцентной визуализации. Цианид является ингибитором комплекса IV цепи переноса электронов (ETC). Влияние цианида на клеточный метаболизм и интенсивность аутофлуоресценции и время жизни NAD(P)H и FAD в клетках хорошо охарактеризованы27,40. Таким образом, эксперимент с возмущением цианида является эффективным средством проверки протоколов визуализации NAD(P)H и FAD. Успешный эксперимент с цианидом дает уверенность в том, что протокол визуализации NAD(P)H и FAD может быть использован для оценки метаболизма неизвестных групп или возмущений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Покрытие клеток для визуализации

  1. Аспирируйте среду из 80-90% сливающейся Т-75 колбы клеток MCF-7, промывайте клетки 10 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и добавляйте 2 мл 0,25% трипсина (1x), чтобы отделить клетки от дна колбы.
  2. Инкубировать колбу при 37 °C в течение ~4 мин. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить отслоение.
  3. Немедленно добавьте 8 мл культуральной среды для деактивации трипсина.
  4. Соберите клетки в коническую трубку (15 мл или 50 мл). Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  5. Центрифугируют ячейки 200 × г в течение 5 мин.
  6. После центрифугирования аспирируйте супернатант. Повторно суспендировать гранулы клеток в 1 мл питательной среды и посеять 4 × 105 клеток на 35-миллиметровую стеклянную камеру для визуализации (или соответствующий держатель образца для используемого микроскопа).
  7. Добавьте 2 мл культуральной среды в форму для визуализации для поддержания клеточного метаболизма.
  8. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO2 в течение 24-48 ч перед визуализацией, чтобы клетки прилипли и достигли логарифмической фазы роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза роста была определена предыдущим опытом работы с этими клетками и подтверждена клеточным техническим описанием.

2. Многофотонная FLIM визуализация NAD(P)H и FAD

  1. Включите все компоненты многофотонного флуоресцентного микроскопа, включая микроскоп, лазерный источник и используемые детекторы.
  2. Размещение образцов
    1. Включите лампу Brightfield. Убедитесь, что свет проникает в окуляр. Выберите цель, обычно 20x, 40x или 100x для визуализации клеток. Нанесите 1 каплю соответствующей погружной среды поверх объектива [пропустите, если используете воздушный объектив].
    2. Переместите объектив вниз, чтобы правильно разместить образец, не касаясь объектива. Поместите стеклянную тарелку на держатель для образцов на ступеньке микроскопа. Убедитесь, что образец безопасен и не будет перемещаться во время визуализации.
    3. Центрируйте образец с целью с помощью управления ступенью X-Y. Как только это будет сделано, загляните в окуляр и переместите цель вверх, чтобы сосредоточиться на клетках.
    4. Если микроскоп находится в корпусе, закройте дверцу лайтбокса. Откройте программное обеспечение для получения изображений, перейдите на вкладку Multiphoton Imaging и задайте следующие параметры многофотонной визуализации: размер изображения = 256 x 256 пикселей; время выдержки пикселя = 4-25 мкс; общее время получения изображения = ~60 с; оптимизированный коэффициент усиления детектора для подсчета одиночных фотонов = 85% (специфично для используемой системы).
  3. Визуализация функции отклика прибора (IRF) и стандарта срока службы флуоресцентных ламп
    1. Поместите кристаллы мочевины на стеклянную посуду и закрепите крышку тарелки скотчем или парапленкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы мочевины остаются стабильными при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
    2. Представьте кристаллы мочевины.
      1. Поместите тарелку с мочевиной на ступень микроскопа и сосредоточьтесь на кристалле мочевины.
      2. Установите длину волны лазера возбуждения на 900 нм.
      3. Используйте эмиссионный фильтр, который захватывает длины волн 450 нм.
      4. Получить флуоресцентное изображение кристалла мочевины с мощностью лазера на образце <1 мВт и использовать рекомендуемые параметры визуализации, упомянутые на этапе 2.2.4.
    3. Представьте желто-зеленые (YG) бусины в качестве стандарта срока службы флуоресценции.
      1. Создайте слайд бусины YG, разбавляя раствор бусин YG 1:1000 в стерильной воде. Поместите небольшой объем (~30 мкл) на горку или стеклянную посуду. Накройте чехлом и запечатайте края чехлового листа прозрачным лаком для ногтей.
      2. Поместите шариковый слайд YG на ступень микроскопа с помощью стороны крышки слайда к цели.
      3. Установите длину волны лазера возбуждения на 890 нм
      4. Используйте эмиссионный фильтр, который захватывает ~ 500-600 нм длин волн.
      5. Получение изображения срока службы флуоресценции шарика YG с использованием мощности лазера на образце <1 мВт и рекомендуемых параметров изображения [шаг 2.2.4].
      6. Проверьте срок службы бусины с помощью IRF мочевины. Если срок службы не составляет ~ 2,1 нс, проверьте, находится ли шарик в контакте с другой бусиной, способствующей закалке флуоресценции, раствор бусин высох, шарик не в фокусе, IRF не точен, или сдвиг между IRF и флуоресцентным распадом не оптимизирован [см. шаг 4.2.4].
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время жизни ~2,1 нс стабильно с течением времени.
  4. Визуализация NAD(P)H
    1. Поместите стеклянную тарелку с клетками на ступень микроскопа и сосредоточьтесь на клетках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы клетки были помещены в камеру окружающей среды для поддержания тепла, влажности и уровня CO2 во время получения изображения, поскольку эти параметры могут влиять на клеточный метаболизм.
    2. Отрегулируйте коэффициент усиления детектора до оптимального значения для FLIM. Кроме того, измените на желаемое время выдержки — параметр, указывающий время, которое лазер проводит на каждом пикселе образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры должны оставаться одинаковыми на протяжении всей оставшейся части процедуры. Это необходимо для обеспечения согласованности настроек лазерного освещения и детектора для обеспечения достоверности измерений на основе интенсивности, которые зависят от мощности лазера, параметров сканирования и усиления детектора. Имеется оптимизированный коэффициент усиления детектора для работы детекторов в режиме однофотонного подсчета; значение составляет 85% для системы, на которую указывает ссылка.
    3. Установите для многофотонного лазера значение 750 нм. Убедитесь, что управление мощностью лазера изначально установлено на нулевом уровне, чтобы ячейки не были повреждены при открытии затвора на лазере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение при 750 нм рекомендуется для NAD(P)H, хотя оно имеет широкое поглощение при 700-750 нм. Возбуждение при 890 нм рекомендуется для FAD, хотя оно имеет широкое поглощение при 700-900 нм.
    4. Установите или выберите эмиссионный фильтр для сбора длин волн излучения ~400-500 нм.
    5. Начните съемку в режиме фокусировки или просмотра в реальном времени , чтобы оптимизировать параметры изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер в настоящее время работает. Не открывайте корпус микроскопа в этот момент. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
    6. Медленно увеличивайте мощность лазера до ~ 3-8 мВт в образце, а также убедитесь, что клетки находятся в фокусе. После настройки запишите максимальную используемую мощность. Используйте эту настройку питания для визуализации на других сегментах чашки Петри для визуализации NAD(P)H.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно измерить мощность лазера в образце или в окне отбора и не полагаться на напряжение ячейки pockels, поскольку ячейки pockels не стабильны. Часто мощность лазера контролируется во время визуализации с помощью окна отбора, а не на образце. Используя второй измеритель мощности на объекте, соотношение между мощностью в окне отбора и мощностью в образце может быть использовано для оценки приблизительной мощности в образце из измерений окна отбора.
    7. Соберите изображение NAD(P)H FLIM со временем интеграции изображения 60 с.
    8. Убедитесь, что изображение имеет достаточное количество фотонов (пик ~ 100 фотонов для пикселя цитоплазмы) в пределах кривой распада времени флуоресценции. Если количество фотонов слишком мало, увеличьте мощность лазера или продолжительность получения изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное пиковое число фотонов в пределах флуоресцентного экспоненциального распада зависит от параметров системы, включая временное разрешение, IRF и фоновый шум.
  5. Визуализация FAD
    1. Установите многофотонный лазер на 890 нм и подождите, пока он зафиксирует режим на новой длине волны. Убедитесь, что управление мощностью лазера изначально установлено на нулевом уровне, чтобы ячейки не были повреждены при открытии затвора на лазере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте сцену или объективный фокус при проведении этого шага. Поле зрения FAD (FOV) должно непосредственно совпадать с NAD(P)H FOV для этого изображения.
    2. Установите или выберите эмиссионный фильтр для сбора длин волн излучения ~500-600 нм.
    3. Начните съемку в режиме фокусировки или просмотра в реальном времени , чтобы оптимизировать параметры изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер в настоящее время работает. Не открывайте корпус микроскопа в этот момент.
    4. Медленно увеличьте мощность лазера до ~5-10 мВт на образце и запишите максимальную используемую мощность. Используйте его в качестве настройки мощности для визуализации на других сегментах чашки Петри для визуализации FAD.
    5. Соберите изображение FAD FLIM со временем интеграции изображения 60 с.
    6. Убедитесь, что изображение имеет достаточное количество фотонов (пик ~ 100 фотонов для пикселя цитоплазмы) в пределах кривой распада времени флуоресценции. Если количество фотонов слишком мало, увеличьте мощность лазера или продолжительность получения изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное пиковое число фотонов в пределах флуоресцентного экспоненциального распада зависит от параметров системы, включая временное разрешение, IRF и фоновый шум.
  6. Повторите шаги 2.4-2.5 на дополнительных четырех-пяти FOV. Убедитесь, что каждое изображение расположено на расстоянии не менее 2 FOV от места, в котором находятся изображения.

3. Подготовка эксперимента с цианидом

  1. Растворите 130,24 мг цианида натрия в 25 мл PBS, чтобы получить раствор цианида натрия 80 мМ (20x).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цианид токсичен. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
  2. Аспират 100 мкл питательной среды из блюда. Замените его 100 мкл раствора цианида натрия для получения концентрации цианида 4 мМ в чашке.
  3. Поместите клетки в инкубатор на 5 минут, чтобы клетки могли вступить в реакцию с раствором цианида.
  4. Повторите шаги 2.4-2.6, чтобы получить изображения NAD(P)H и FAD клеток после воздействия цианида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие цианида убьет клетки. Постцианидные изображения получаются в течение 30 мин после добавления цианида.

4. Анализ изображений FLIM

  1. Откройте программное обеспечение для анализа срока службы FLIM.
    1. Откройте изображение мочевины, чтобы получить измеренный IRF.
    2. Импортируйте изображение мочевины. Выберите точку на изображении кристалла мочевины, которая будет использоваться для анализа изображений. Увеличьте пространственное значение bin для интеграции данных FLIM с нескольких пикселей до 1 или выше для пика распада > 100 фотонов , изменив переменную Bin , расположенную на основном программном интерфейсе.
    3. Сохраните данные в формате IRF.
      1. В указанном программном обеспечении щелкните раскрывающееся меню под названием IRF, выберите Копировать из данных распада. После этого нажмите кнопку Копировать в буфер обмена , чтобы использовать ее при анализе изображения, полученного во время эксперимента.
  2. Анализ изображений с течением времени существования NAD(P)H и FAD
    1. Импортируйте файл изображения в программное обеспечение для анализа срока службы флуоресценции.
    2. Улучшите визуализацию изображения, чтобы увидеть клетки и субклеточные компартменты, изменив интенсивность и контрастность, если это необходимо.
      1. Щелкните раскрывающееся меню Параметры и выберите Интенсивность. Здесь измените интенсивность и контрастность по своему усмотрению и нажмите кнопку ОК.
    3. Импортируйте IRF из изображения мочевины.
      1. Щелкните раскрывающееся меню IRF и выберите Вставить из буфера обмена.
    4. Задайте параметры мультиэкспоненциального распада50.
      1. Задайте пороговое значение для оценки распадов для пикселов цитоплазмы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь было использовано значение 50. Значение было выбрано путем сравнения пиковых значений флуоресценции нескольких репрезентативных пикселей фона и ядра с пиковым значением нескольких пикселей цитоплазмы. Для порогового значения было выбрано значение между пикселями ядра и пикселями цитоплазмы.
    5. Убедитесь, что значение Shift выравнивает IRF относительно восходящего края флуоресценции. При необходимости измените сдвиг на значение, которое минимизирует значение хи-квадрата.
    6. Увеличьте пространственную корзину так, чтобы пиксели цитоплазмы имели пиковые значения флуоресценции на уровне или выше 100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение пространственного бункера приведет к снижению пространственного разрешения.
    7. Вычисление времени жизни флуоресценции для всех пикселей в изображении.
      1. В указанной программе щелкните раскрывающееся меню Рассчитать | Матрица распада.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Успех указывается изображением ложного цвета в соответствии со сроком службы флуоресценции, взвешенным по амплитуде.
    8. Сохраните данные о времени жизни флуоресценции.
      1. Щелкните раскрывающееся меню Файл | Экспорт. Выберите нужные параметры для анализа и нажмите кнопку ОК. Сохраните изображение.
      2. Нажмите кнопку «Цвет » в раскрывающемся меню «Параметры», чтобы настроить отображаемую метрику времени жизни флуоресценции, цветовую конфигурацию на B-G-R, а также задайте минимальные и максимальные значения цветовой шкалы для настройки цветовой шкалы изображения с временем жизни флуоресценции.

Figure 2
Рисунок 2: Измеренное IRF кристалла мочевины. (A) Изображение интенсивности, полученное из мочевины. Репрезентативный пиксель был выбран для создания кривой распада IRF (B) для последующего анализа флуоресцентных изображений жизни клеток. Аббревиатура: IRF = функция отклика прибора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Сегментация клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь, использует программное обеспечение для анализа изображений51. Предоставлены репрезентативные изображения MCF-7 и код анализа данных52.
    1. Загрузите файл MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. Импортируйте конвейер MCF7_Segmentation, щелкнув Файл | Импорт | Конвейер из файла, выберите файл MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. Щелкните модуль Изображения и добавьте изображения интенсивности NAD(P)H для сегментации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения должны быть в.tif, .png или .jpg формате.
    4. Нажмите кнопку «Анализировать изображения » в левом нижнем углу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер может нуждаться в оптимизации для изображений, полученных в разных системах. Для устранения неполадок выполните следующие действия
      1. Используйте тестовый режим для тестирования различных параметров: нажмите кнопку Запустить тестовый режим и запустите каждый модуль, нажав кнопку воспроизведения рядом с именем модуля.
      2. Щелкните первый модуль IdentifyPrimaryObjects и отрегулируйте Типичный диаметр объектов в пиксельных единицах (Мин, Макс) в соответствии с диаметром ячеек.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для ячеек MCF-7 использовались 10 и 40 пикселей для минимума и максимума соответственно.
      3. Щелкните модуль EnhanceOrSuppressFeatures и отрегулируйте размер компонента , чтобы улучшить идентификацию выбранного типа компонента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для ячеек MCF-7 использовался размер функции 10 пикселей.
      4. Щелкните второй модуль EnhanceOrSuppressFeatures и отрегулируйте диапазон размеров отверстий , чтобы оптимизировать улучшение ядерных областей.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для ячеек MCF-7 использовался диапазон 5-20.
      5. Щелкните второй модуль IdentifyPrimaryObjects и настройте параметры (Стратегия пороговых значений, Метод пороговых значений, Шкала сглаживания пороговых значений и Пороговый поправочный коэффициент) для оптимизации идентификации ядер. Нажмите на ? по каждому параметру, чтобы определить оптимальные настройки и применить к модулю IdentifySecondaryObjects .
      6. Щелкните модуль FilterObjects и отрегулируйте форму области. Выберите минимальный и максимальный пиксель идентифицируемой фигуры области.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для ячеек MCF-7 использовались 100 и 500 для максимума и минимума, соответственно. Процесс сегментации клеток путем идентификации ядра и распространения к границам клеток подробно объясняется Уолшем и Skala47.
    5. Используя маски цитоплазмы клеток, усредните выходные переменные времени жизни флуоресценции для каждой клетки в изображении.

Figure 3
Рисунок 3: Идентификация и сегментация отдельных клеток. Изображение интенсивности NAD(P)H ячеек MCF7 (A), полученное путем интеграции изображения времени жизни флуоресценции. Клетки были визуализированы с использованием возбуждения 750 нм при 5 мВт в течение 60 с. Оси x и y представляют расположение изображения в пикселях. (A) Были идентифицированы отдельные клетки. Ячейки были замаскированы (B) для устранения любого фонового шума из набора данных. Затем ядро идентифицировали (C) и проецировали на клеточную маску (D). Затем клетки были отфильтрованы (E) для удаления маскированных областей, которые не соответствуют размеру типичных клеток. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Альтернативный метод: визуализация интенсивности флуоресценции

  1. Включите оборудование, которое будет использоваться во время эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения интенсивности флуоресценции могут быть получены с помощью широкоугольных флуоресцентных микроскопов, конфокальных флуоресцентных микроскопов или многофотонных микроскопов.
    1. Убедитесь, что используемый микроскоп имеет соответствующий источник возбуждения для NAD(P)H (длина волны одного фотона ~ 370-405 нм: длина волны двух фотонов ~ 700-750 нм) и FAD (длина волны одного фотона ~ 488 нм, длина волны двух фотонов ~ 890 нм).
    2. Убедитесь, что микроскоп имеет фильтр для изоляции излучения NAD(P)H (~400-500 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) часто работают для NAD(P)H.
    3. Убедитесь, что микроскоп имеет фильтр для изоляции излучения FAD (~500-600 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый флуоресцентный белок (GFP) часто работает для FAD.
  2. Подготовьте микроскоп.
    1. Включите лампу Brightfield. Убедитесь, что свет проникает в окуляр. При необходимости нанесите 1 каплю соответствующей погружной среды поверх соответствующего объектива.
    2. Переместите объектив вниз, чтобы правильно разместить образцы без каких-либо помех. Поместите чашку Петри на сцену должным образом. Убедитесь, что образец безопасен и не будет перемещаться во время визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы клетки были помещены в камеру окружающей среды для поддержания тепла, влажности и уровня CO2 во время получения изображения, поскольку эти параметры могут влиять на клеточный метаболизм.
    3. Центрируйте образец с целью. Как только это будет сделано, загляните в окуляр и переместите объектив, пока клетки не окажутся в фокусе.
  3. Начните визуализацию интенсивности.
    1. Откройте программное обеспечение для обработки изображений и задайте конфигурацию возбуждения и излучения для захвата NAD(P)H, щелкнув вкладку «Захват» в программном обеспечении для сбора изображений и расположив фильтр возбуждения и излучения NAD(P)H в башне микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации NAD(P)H использовались фильтр возбуждения 357/44, дихроичный фильтр 409 длинных проходов и эмиссионный фильтр 447/60.
    2. Оптимизируйте освещенность возбуждения и параметры детектора. Если отбеливание является проблемой, уменьшите интенсивность освещения и увеличьте время интеграции изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NAD(P)H является слабым сигналом; помните об отбеливании, если используется слишком много энергии.
    3. Получение изображения NAD(P)H требуемого размера. Убедитесь, что изображение сохранено.
    4. Установите конфигурацию возбуждения и излучения для улавливания FAD. Оптимизируйте освещенность возбуждения и параметры детектора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации FAD использовались фильтр возбуждения 458/64, дихроичный фильтр 495 longpass и эмиссионный фильтр 550/88.
    5. Получение изображения FAD. Убедитесь, что изображение сохранено.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры получения изображения NAD(P)H и FAD (интенсивность освещения, размер изображения, усиление детектора) должны оставаться неизменными на протяжении всего эксперимента по визуализации.
    6. Повторите процесс в дополнительных пяти местах, расположенных на расстоянии не менее 2 FOV от изображений.
  4. Анализ данных окислительно-восстановительного соотношения на уровне изображения
    1. Откройте изображения интенсивности NAD(P)H и FAD в программе обработки изображений.
    2. Установите пороговое значение для NAD(P)H, чтобы сохранить пиксели цитоплазмы, и установите для пикселей фона и ядра значение 0.
    3. Рассчитайте изображение с окислительно-восстановительным отношением, оценив уравнение FAD/(NAD(P)H+FAD) на каждом пикселе, используя пороговое изображение NAD(P)H.
    4. Вычислите среднее значение значений, отличных от 0 пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги могут быть выполнены в программном обеспечении для анализа изображений или закодированы непосредственно с помощью скриптов.
  5. Анализ окислительно-восстановительного соотношения на клеточном уровне
    1. Выполните шаги 4.3.1-4.3.5, чтобы получить изображение маски ячеек в каждом изображении NAD(P)H.
    2. Рассчитайте окислительное соотношение изображения, оценив уравнение FAD/(NAD(P)H+FAD) на каждом пикселе.
    3. Используя маску цитоплазмы клетки, усредните коэффициент окислительно-восстановительных значений для всех пикселей для каждой клетки в изображении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эпителиальная клеточная линия рака молочной железы, MCF-7, культивировалась в DMEM, дополненном 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином. Для флуоресцентной визуализации клетки засевали с плотностью 4 × 105 клеток на 35-миллиметровую камеру визуализации со стеклянным дном за 48 ч до визуализации. Клетки были изображены до и после лечения цианидом с использованием протоколов, указанных выше. Целью эксперимента с цианидом является подтверждение спектральной изоляции флуоресценции NAD(P)H и FAD и проверка системы визуализации и протокола анализа для обнаружения метаболических изменений в клетках. Парные изображения с частотой флуоресценции NAD(P)H и FAD были сделаны в пяти различных местах до цианида и в пяти разных местах после добавления цианида в среду. Параметры времени жизни флуоресценции (оптический окислительно-восстановительный коэффициент, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1, FAD τ2 и FAD τm) были рассчитаны с использованием измеренного IRF из мочевины (рисунок 2) и усреднены по пикселям цитоплазмы каждой ячейки, используемой для сегментации (рисунок 3).

Многофотонная флуоресцентная пожизненная визуализация NAD(P)H и FAD позволяет визуализировать морфологию и метаболизм клеток (рисунок 4). Высокое разрешение, достигаемое с помощью многофотонной микроскопии, позволяет идентифицировать отдельные клетки. NAD(P)H и FAD в основном расположены в митохондриях и цитоплазме, в то время как ядро, в котором отсутствуют метаболические NAD(P)H и FAD, по сравнению с ним темное23,53. Изображения срока службы обеспечивают визуализацию взвешенных по амплитуде времени жизни NAD(P)H и FAD по всей клетке и в результате воздействия цианида (рисунок 4).

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные изображения срока службы флуоресценции клеток MCF7 до и после обработки цианидом. (A) NAD(P)H амплитудно-взвешенное изображение срока службы флуоресценции и (B) Амплитудно-взвешенное faD изображение срока службы флуоресценции до обработки цианидом. (C) NAD(P)H амплитудно-взвешенное изображение срока службы флуоресценции и (D) FAD амплитудно-взвешенное изображение срока службы флуоресценции после обработки цианидом. Время жизни флуоресценции, взвешенное по амплитуде (обозначенное цветовой полосой), измеряет время, в течение которого флуорофор, в этих случаях NAD(P)H и FAD, находится в возбужденном состоянии. Продолжительность жизни NAD(P)H уменьшается при лечении цианидом, тогда как продолжительность жизни FAD увеличивается после обработки цианидом. Сигнал NADH был визуализирован с использованием возбуждения 750 нм при 5 мВт в течение 60 с, а сигнал FAD был сфотографирован с использованием возбуждения 890 нм при 7 мВт в течение 60 с. Изображения, полученные с помощью 40-кратного водоиммерного объектива, числовая диафрагма = 1,1. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Цианид ингибирует комплекс IV цепи переноса электронов, который ингибирует окислительное фосфорилирование2,15. После воздействия цианида и до гибели клеток NAD(P)H накапливается в митохондриях, и FAD уменьшается1,15. Из-за этих четко определенных изменений интенсивности NAD(P)H и FAD из-за ингибирования метаболизма цианидом возмущение является стандартным тестом для проверки протоколов автофлуоресцентной визуализации и анализа2,54. Как и ожидалось, оптическое окислительно-восстановительное соотношение (FAD/(FAD+NAD(P)H)) клеток MCF-7 снизилось после обработки цианидом (Рисунок 5, p = 0,044, t-тест Уэлча). Оптический окислительно-восстановительный коэффициент не является стандартизированной формулой, но было показано, что все формулы интенсивности эквивалентны20. FAD/(NAD(P)H+FAD) был выбран для определения оптического окислительно-восстановительного соотношения, поскольку комбинированная сумма NAD(P)H и FAD в знаменателе обеспечивает нормализованное значение от 0 до 120,55. Противоположный эффект - увеличение оптического окислительно-восстановительного соотношения - ожидается для возмущений цианида с оптическими окислительно-восстановительными отношениями, рассчитанными с NAD(P)H в числителе.

Figure 5
Рисунок 5: Оптическое окислительно-восстановительное соотношение клеток MCF7 уменьшается при лечении цианидом. Квадраты показывают медиану, а также первый и третий квартили, рассчитанные на основе данных ячейки. Среднее значение представлено символом черной точки, а медиана представлена черной линией внутри коробки. Серые точки данных, наложенные на каждый прямоугольник, представляют собой усредненное значение всех пикселей цитоплазмы в каждой клетке. Контрольная группа состояла из 91 клетки из пяти различных изображений, а группа цианида состояла из 95 клеток из пяти разных изображений. p < 0,01, t-тест Уэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Взвешенное по амплитуде время жизни NAD(P)H (τm) клеток MCF7 уменьшалось при воздействии цианида (рисунок 6A, p < 2,2 × 10-16, т-тест Уэлча). Как короткий, так и длительный срок службы уменьшился для NAD(P)H (рисунок 6B,C), но увеличился для NAD(P)H α 1 (рисунок 6D). Эти изменения в времени жизни флуоресценции NAD(P)H, снижение τm, увеличение α 1 и снижение τ2 соответствовали опубликованным значениям возмущений цианида40,56. Снижение продолжительности жизни флуоресценции, взвешенной по амплитуде NAD(P)H, при воздействии цианида указывает на повышенное закалку в микросреде NAD(P)H. Увеличение α 1 указывает на более свободный NAD(P)H, как и ожидалось от увеличения NAD(P)H из-за влияния цианида на клеточный метаболизм21.

Figure 6
Рисунок 6: Время флуоресценции NAD(P)H клеток MCF7 до и после обработки цианидом. Квадраты на панелях A-D показывают медиану, а также первый и третий квартиль, рассчитанные на основе данных на уровне ячеек. Среднее значение представлено символом черной точки, а медиана представлена черной линией внутри коробки. Серые точки данных, наложенные на каждый прямоугольник, представляют собой усредненное значение всех пикселей цитоплазмы в клетке. Контрольная группа состояла из 91 клетки из пяти различных изображений, а группа цианида состояла из 95 клеток из пяти разных изображений. (A-D) демонстрируют изменения в NAD(P)H амплитудно-взвешенном времени жизни (τm), NAD(P)H с коротким сроком службы (τ1), NAD(P)H с длительным сроком службы (τ2) и NAD(P)H-пропорциональном компоненте короткого срока службы (α 1) из-за обработки цианидом. p-значения были рассчитаны с использованием t-теста Уэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Амплитудно-взвешенное время жизни FAD (τm) клеток MCF7 увеличилось после воздействия цианида (рисунок 7A, p = 3,688 × 10-12, т-тест Уэлча). Как короткий, так и длительный срок службы увеличился для FAD (рисунок 7B, C), но уменьшился для FAD α 1 (рисунок 7D). Изменения в времени жизни флуоресценции FAD, увеличение τm и τ2 и снижение α 1 согласуются с опубликованными данными о времени жизни флуоресценции FAD цианидного возмущения57. Изменение значений продолжительности жизни и α 1 предполагает метаболические изменения в клетках, включая увеличение количества свободного FAD21.

Figure 7
Рисунок 7: Время жизни флуоресценции FAD до и после обработки цианидом. Квадраты в A-D показывают медиану, первый и третий квартиль и среднее значение, рассчитанное на основе данных на уровне ячеек. Среднее значение представлено символом черной точки, а медиана представлена черной линией внутри коробки. Серые точки данных, наложенные на каждый прямоугольник, представляют собой усредненное значение всех пикселей цитоплазмы в клетке. Контрольная группа состояла из 91 клетки из пяти различных изображений, а группа цианида состояла из 95 клеток из пяти разных изображений. (A-D) демонстрируют изменения в амплитудно-взвешенном времени жизни FAD (τm), FAD с коротким сроком службы (τ1), FAD с длительным сроком службы (τ2) и FAD-пропорциональном компоненте короткого срока службы (α 1) от обработки цианидом. p-значения были рассчитаны с использованием t-теста Уэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Интенсивность автофлуоресценции и пожизненная визуализация широко использовались для оценки метаболизма в клетках21,55. FLIM имеет высокое разрешение и, следовательно, разрешает одиночные клетки, что важно для исследований рака, поскольку клеточная гетерогенность способствует агрессии опухоли и лекарственной устойчивости7,39,41,44,45,46,58. Аналогичным образом, аутофлуоресцентная визуализация клеточного метаболизма полезна для визуализации иммунных клеток, поскольку функция иммунных клеток связана с клеточным метаболизмом, а популяции иммунных клеток часто неоднородны20,31. Стандартные биохимические анализы обычно оценивают иммунные клетки на популяционном уровне или требуют внутриклеточной маркировки после пермеабилизации клеток34,59,60. Автофлуоресцентная визуализация также хорошо подходит для высоких разрешений in vivo и динамических измерений метаболизма из-за неразрушающего характера света и отсутствия химических или генетически закодированных меток36,37,38,41,48,55 . Критические шаги для визуализации интенсивности и времени флуоресценции NAD(P)H и FAD включают выбор соответствующих длин волн для возбуждения и излучения, проверку того, что клетки не содержат синтетических или дополнительных эндогенных флуорофоров, которые будут способствовать перекрытию флуоресценции, и использование неповреждающих лазерных мощностей.

Автофлуоресцентная визуализация NAD(P)H и FAD заполняет уникальную нишу в качестве технологии количественной метаболической визуализации без меток и высокого разрешения. Другие методы визуализации, такие как FDG-PET и MRS, изображают метаболизм тканей, но не имеют разрешения на клеточном уровне и, следовательно, не могут оценить клеточную гетерогенность. Другие биохимические методы, такие как анализы потребления кислорода, измерения метаболитов в среде или анализ белка, требуют дорогостоящих одноразовых реагентов, получения измерений из объединенных клеток и требуют протоколов разрушения клеток, предотвращая исследования на время или анализ in vivo61,62.

В то время как автофлуоресцентная визуализация NAD(P)H и FAD обеспечивает изображения с высоким разрешением без меток и неразрушающим образом, некоторые ограничения автофлуоресцентной визуализации должны учитываться при разработке и интерпретации экспериментов. FLIM требует специализированного и дорогостоящего оборудования, которое не является широко доступным. Для возбуждения FLIM требуется импульсный источник возбуждения с пикосекундными или фемтосекундными импульсами с частотой повторения от 40 до 100 МГц с выходной мощностью > 50 мВт63. Кроме того, получение изображения происходит относительно медленно, с компромиссом между количеством пикселей или разрешением изображения и временем получения изображения. Параметры, рекомендуемые в этом протоколе 256 x 256 пикселей и время интеграции 60 с, обеспечивают изображение с разумным разрешением в пределах около 1 мили. Пользователь может выбрать изображение меньших областей с меньшим количеством пикселей или выполнить сканирование линий для повышения скорости изображения.

Кроме того, изображения с более высоким пикселем могут быть получены с увеличенным временем интеграции изображений. Анализ данных и интерпретация изображений времени автофлуоресценции могут быть сложными, поскольку FLIM предоставляет конкретную биофизическую информацию о метаболических коферментах и их молекулярной среде, а не о конкретных метаболических путях. Оптическая микроскопия также ограничена глубиной проникновения света в ткани из-за рассеяния и поглощения света. Исследования in vivo могут проводиться на глубине ~0,5 мм с помощью многофотонных систем визуализации поверхностных тканей или через оконные камеры2,20,21,64,65.

В то время как NAD(P)H и FAD являются первичными эндогенными флуорофорами в изолированных клетках, дополнительные молекулы, включая коллаген и эластин, могут способствовать аутофлуоресцентным сигналам в тканях. Изображения с высоким разрешением многофотонной микроскопии позволяют визуализировать клеточные и неклеточные компартменты для сегментации пикселей NAD(P)H и FAD из внеклеточных белков40. Некоторые клетки содержат эндогенные молекулы с перекрывающейся флуоресценцией, такие как липофусцин, ретинол, триптофан и меланин66. Поэтому автофлуоресцентные изображения NAD(P)H и FAD могут содержать фоновые вклады других эндогенных молекул.

Аналогичным образом, в то время как NAD(P)H и FAD могут быть мультиплексированы экзогенными флуорофорами, которые излучают на длинах волн выше 600 нм, экзогенные метки, такие как DAPI или генетически закодированные белки, такие как GFP, спектрально перекрываются с автофлуоресцентной визуализацией. Эксперимент с возмущением цианида, описанный здесь, помогает убедиться, что длины волн возбуждения и излучения изолируют NAD(P)H и FAD в достаточной степени для захвата метаболических изменений в клетках. Другие типы клеток могут быть применены к этому протоколу; однако пользователь должен оптимизировать параметры изображения, включая мощность лазера и время интеграции изображения для каждого типа клеток, а также экспериментировать для предотвращения фотоотбеливания. Фотоотбеливание может быть сведено к минимуму путем мониторинга скорости подсчета фотонов или средней интенсивности флуоресценции во время визуализации в течение всего срока службы сканирования. Увеличение или уменьшение интенсивности флуоресценции указывает на то, что мощность лазера слишком высока. Если мощность лазера индуцирует фотоотбеливание, мощность может быть уменьшена, а общее получение изображения увеличено для достижения достаточного сбора фотонов для анализа в течение всего срока службы.

Хотя время жизни флуоресценции не зависит от параметров изображения, включая мощность лазера и усиление детектора, интенсивность флуоресценции зависит от этих параметров20. Поэтому при проведении автофлуоресцентной визуализации для количественной оценки оптического окислительно-восстановительного соотношения крайне важно использовать последовательные параметры визуализации. Протокол рекомендует, чтобы 5-6 изображений различных FOV были получены от каждой экспериментальной группы. Этот размер выборки обеспечивает достаточные данные как на уровне изображения, так и на уровне клеток для разрешения ожидаемых различий в параметрах времени жизни флуоресценции сливающихся клеток MCF7 из-за возмущения цианида. Оптимальное количество изображений, полученных на группу, зависит от экспериментального дизайна и размера эффекта. При переключении между изображениями NAD(P)H и FAD фокальная плоскость должна оставаться одинаковой в каждом месте для обеспечения согласованности. Хотя пожизненная визуализация обычно не имеет насыщенного числа фотонов, изображения интенсивности, полученные с помощью камер или фотоумножителей, могут быть насыщенными. Следует избегать насыщенности пикселей, чтобы гарантировать, что весь диапазон физиологических интенсивностей запечатлен на изображениях.

При анализе изображений времени жизни флуоресценции можно использовать либо измеренный IRF, либо смоделированный IRF. Смоделированный IRF оценивается по восходящему всплеску флуоресцентной кривой времени жизни; однако реальные IRF, полученные из системы, могут быть более широкими в зависимости от системы и, таким образом, приводить к более точным значениям срока службы. В то время как IRF обычно изменяется только с изменениями аппаратного или программного обеспечения, ежедневное измерение IRF является хорошей практикой для обеспечения того, чтобы система срока службы флуоресценции работала должным образом.

В целом, аутофлуоресцентная визуализация NAD(P)H и FAD обеспечивает безмечаночный, неразрушающий метод для изображения и анализа клеточного метаболизма на уровне одной клетки. Этот метод обеспечивает поэтапный подход к проверке визуализации NAD(P)H и FAD с использованием цианида для индуцирования хорошо охарактеризованного метаболического возмущения в клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Источники финансирования включают Институт профилактики рака и исследований Техаса (CPRIT RP200668) и Техасский университет A & M. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532 (2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500 (2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271 (2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456 (2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014 (2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068 (2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008 (2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104 (2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792 (2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Tags

Биоинженерия выпуск 177 FLIM Метаболизм NAD(P)H FAD Флуоресценция Микроскопия
Автофлуоресцентная визуализация для оценки клеточного метаболизма
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N.,… More

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter