Summary
Dieses Protokoll stellt die operativen Details der Stuhlligatur und -punktion (CLP) in einem Mausmodell der Sepsis dar. CLP ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken, um ein Tiermodell für Sepsis zu erstellen. Daher ist ein standardisiertes CLP-Protokoll erforderlich, um zuverlässige Forschungsergebnisse zu erzielen.
Abstract
Sepsis ist eine schwere lebensbedrohliche und sich schnell entwickelnde Krankheit, die jährlich weltweit Millionen von Todesfällen verursacht. Forscher haben enorme Anstrengungen unternommen, um die Pathophysiologie der Sepsis anhand verschiedener Tiermodelle aufzuklären. Das Mausmodell der durch Cekalligatur und Punktion induzierten Sepsis (CLP) ist in Laboratorien weit verbreitet. Die drei technischen Aspekte, die den Schweregrad und die Replizierbarkeit des CLP-Modells beeinflussen, sind der Prozentsatz des gebundenen Blinddarms, die Größe der für die Stuhlpunktion verwendeten Nadel und das Volumen des in die Bauchhöhle gepressten Kots. Die schnelle und spezifische Diagnose einer Sepsis ist ein entscheidender Faktor, der das Ergebnis beeinflusst. Der Goldstandard für die Sepsis-Diagnose ist die mikrobielle Kultur; Dieser Prozess ist jedoch zeitaufwendig und manchmal ungenau. Der Nachweis von Sepsis-spezifischen Biomarkern ist schnell, aber die vorhandenen Biomarker sind aufgrund einer kurzen Halbwertszeit, Nicht-Spezifität und unzureichender Sensitivität unbefriedigend. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem zuverlässigen Biomarker für Sepsis in den frühen Stadien. Frühere Publikationen deuten darauf hin, dass exzessive neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) bei Sepsis auftreten. Citrulliniertes Histon H3 (CitH3) als NET-Komponente ist sowohl bei septischen Tieren als auch bei Patienten erhöht, und das Vorhandensein von CitH3 ist ein zuverlässiger diagnostischer Biomarker für Sepsis. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, ein standardisiertes Mausmodell der CLP-induzierten Sepsis zu beschreiben und einen zuverlässigen Blutbiomarker für Sepsis zu etablieren. Unsere Arbeit kann in Zukunft zur frühzeitigen und genauen Diagnose einer Sepsis beitragen.
Introduction
Sepsis ist definiert als lebensbedrohliche Organfunktionsstörung, die durch eine fehlregulierte Wirtsreaktion auf Infektionverursacht wird 1, und septischer Schock ist die häufigste Todesursache in schweren Fällen von Sepsis2. Sepsis und septischer Schock verursachen jedes Jahr weltweit Millionen von Todesfällen3. Der Schlüssel zur Verbesserung des Ergebnisses von Patienten mit Sepsis ist die sofortige Einleitung von Behandlungen wie Antibiotika4. Die Goldstandardmethode für die Diagnose von Sepsis ist die mikrobielle Kultur; Die mikrobielle Kultur ist jedoch zeitaufwendig und kann zu falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen führen, was die klinische Signifikanz stark einschränkt5. Daher ist es sehr wünschenswert, einen Blutbiomarker für Sepsis zu identifizieren. Procalcitonin gilt als idealer Sepsis-Biomarker, hat aber eine begrenzte diagnostische Wirksamkeit, da es Sepsis nicht von sterilen Erkrankungen unterscheiden kann6.
Die Ligatur und Punktion im Stuhl der Maus (CLP) wird häufig verwendet, um ein Modell der Sepsis in der wissenschaftlichen Forschung zu erstellen. CLP ist eines der am weitesten verbreiteten Sepsismodelle, da es die polymikrobielle Peritonitis nachahmt und sowohl entzündungsfördernde als auch entzündungshemmende Immunantworten aktiviert7. Es ist allgemein anerkannt, dass CLP ein klinisch relevanteres Sepsismodell schafft als alternative Techniken wie die Injektion von bakteriellem Endotoxin. Daher gilt CLP als das klassische Sepsis-Modell für den Einsatz in der Forschung8. Ein großer Nachteil von CLP ist jedoch seine Reproduzierbarkeit, da der Schweregrad des Modells von mehreren Faktoren wie dem Prozentsatz der Blinddarmligierung, der Nadelgröße, der Anzahl der Punktionen und der Laparotomietechnik beeinflusst wird. Daher ist es notwendig, das CLP-induzierte Sepsis-Modell zu standardisieren. Die vorliegende Studie beschreibt die Protokolldetails des CLP-induzierten Sepsismodells, um das standardisierte Verfahren aufzuzeigen und seine Reproduzierbarkeit zu erhöhen.
Die Entzündungsreaktion tritt im frühen Stadium der Sepsis auf, wobei Neutrophile übermäßige Mengen an Oxidationsmitteln und Proteasen freisetzen, die Organschäden verursachen8. Ein Schlüsselfaktor in der Pathophysiologie der Sepsis ist die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs), die nukleäre und zytosolische Komponenten wie DNA, citrullinierte Histone und antimikrobielle Proteinasen freisetzen9. Neuere Studien deuten darauf hin, dass eine übermäßige Erzeugung von NETs die Pathologie der Sepsis vermittelt; In der Zwischenzeit übt eine Abnahme der NETs durch enzymatische Hemmung der Peptidylarginin-Deiminase (PAD) durch Chemikalien wie YW3-56 oder Cl-Amidin einen Pro-Überlebenseffekt in Mausmodellen der Sepsis10,11 aus. Citrulliniertes Histon H3 (CitH3) wurde 2011 als Sepsis-spezifisches Protein identifiziert12, und nachfolgende Publikationen haben gezeigt, dass die zirkulierende CitH3-Konzentration ein zuverlässiger diagnostischer Biomarker für Sepsis13,14 ist. CitH3 gilt als empfindlicherer und langlebigerer Biomarker als Procalcitonin und ist spezifischer bei der Unterscheidung von Sepsis als entzündliche Zytokine13.
In dieser Studie haben wir einen zuverlässigen diagnostischen Biomarker für Sepsis in einem CLP-induzierten Mausmodell der Sepsis evaluiert.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Animal Review Committee am Xiangya Hospital und der Central South University (Nr. 202103149) genehmigt wurden.
1. Vorbereitung
- Wählen Sie männliche C57BL / 6J-Mäuse aus (Gewicht: 20-25 g; Alter: 8-12 Wochen) und halten Sie 3 Tage lang unter, bevor Sie irgendwelche Eingriffe durchführen.
- Wiegen Sie die Maus.
- Betäuben Sie die Maus mit 1,5% Isofluran durch Einatmen und kneifen Sie die Zehen, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.
- Fixieren Sie die Maus auf dem Heizkissen. Tragen Sie die Enthaarungscreme auf den Bauch auf und lassen Sie sie nicht länger als 1 Minute einwirken, bevor Sie die Creme und die Haare entfernen.
HINWEIS: Die normale Körpertemperatur sollte aufrechterhalten werden, indem während der Operation ein warmes Pad unter die betäubte Maus gelegt wird.
2. Betrieb
- Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente vor, die für die Chirurgie von Nagetieren geeignet sind. Tragen Sie sterile Handschuhe, eine Gesichtsmaske und einen OP-Kittel, um aseptische Bedingungen zu gewährleisten.
- Desinfizieren Sie die Bauchhaut mindestens dreimal mit Jodtüchern. Decken Sie den operativen Operationsbereich mit sterilen OP-Abdecktüchern ab.
- Verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um einen ca. 2 cm langen Schnitt in der Bauchdecke entlang der Linea alba zu machen.
HINWEIS: Beschädigen Sie die Organe nicht. - Identifizieren und isolieren Sie den Blinddarm aus der Bauchhöhle mit einer sterilen Pinzette.
- Ligate 75% des Blinddarmvolumens mit 4-0 Seidennähten. Ligatur die mesenterialen Blutgefäße nicht.
HINWEIS: Der Prozentsatz des Blinddarms, der ligiert ist, bestimmt den Schweregrad der Sepsis. - Punktieren Sie den Blinddarm, indem Sie eine Durchgangsperforation (zwei Löcher) mit einer 21 G-Nadel (von einer Seite durch die Stuhlwand zur gegenüberliegenden Seite) in der Mitte zwischen dem Schwanzende und dem Ligatursatz erzeugen.
- Entsorgen Sie die Nadel. Drücken Sie vorsichtig einen kleinen Kottropfen aus dem Blinddarm durch die Eindringlöcher.
HINWEIS: Die Menge an Kot, die in die Peritonealhöhle gepresst wird, sollte konsistent sein, da dies auch den Schweregrad der Sepsis bestimmt. Die Schritte 2.5-2.7 sollten für Scheinmäuse übersprungen werden. - Setzen Sie den Blinddarm vorsichtig in die Bauchhöhle ein.
- Verschließen Sie den Bauchmuskel und die Haut separat mit 6-0 Seidennähten.
- Desinfizieren Sie den Schnitt mit Jod.
- Injizieren Sie Ketoprofen (5 mg/kg) in den unteren linken Quadranten des Abdomens, um den Blinddarm zu vermeiden. Legen Sie die Maus auf ein warmes Pad, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
- Setzen Sie die Maus in einen Käfig in einem temperaturkontrollierten Raum (22 °C) und geben Sie freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Überprüfen Sie die Maus alle 6 Stunden für die erste Woche postoperativ.
- Euthanasieren Sie die Maus durch eine Überdosierung von Kohlendioxid, wenn die Symptome einer Sepsis die vordefinierten Endpunkte erreichen.
3. Behandlung
- Zufällige Aufteilung der Mäuse in die Scheingruppe, CLP-Gruppe, CLP + YW3-56-Gruppe (Abbildung 2a) und CLP + Cl-Amidin-Gruppe (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Scheingruppe durchlief die gleichen Verfahren wie die CLP-Gruppen mit Ausnahme der CLP-Verordnung. YW3-56 (5 mg/kg) oder Cl-Amidin (40 mg/kg) wurde 1 h nach Schritt 2.9 beim Nähen der Muskel- und Hautschicht als peritoneale Injektion verabreicht. - Probeernte
- Entnehmen Sie peripheres Blut aus dem retrobulbären Plexus15 24 h nach der Operation.
- Das Serum durch Zentrifugation (1.000 x g, 5 min) vorbereiten und bis zur Anwendung bei -80 °C lagern.
- Messen Sie die CitH3-Konzentration mit einem indirekten Sandwich-ELISA-Kit, wie zuvor beschrieben13.
- Beschichten Sie den monoklonalen Anti-CitH3-Antikörper auf einer 96-Well-Platte, um das CitH3-Protein einzufangen.
- Das Serum mit DNase I (150 Einheiten/ml, 37° für 1 h) behandeln und in den Vertiefungen inkubieren (20 μL, Raumtemperatur).
- Fügen Sie einen polyklonalen Anti-CitH3-Antikörper (0,33 μg/ml, 100 μL, 2 h) hinzu, um das eingefangene CitH3-Protein nachzuweisen.
- Inkubieren Sie den Anti-Kaninchenperoxidase-markierten sekundären Antikörper (0,02 μg/ml, 100 μl, 1 h) in den Vertiefungen.
- Nach gründlichem Waschen die Vertiefungen mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (100 μL, 20 min) entwickeln.
HINWEIS: Weitere Protokolldetails des ELISA-Kits finden Sie in der vorherigen Publikation13.
- Statistische Analyse
- Führen Sie eine Einweg-ANOVA durch, um die Unterschiede zwischen den drei Gruppen zu analysieren, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Tests für mehrere Vergleiche. Verwenden Sie eine Statistiksoftware, um die Analyse durchzuführen. p-Werte von 0,05 oder weniger wurden als signifikant angesehen.
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Representative Results
Wie in Abbildung 2A gezeigt, wurde in der Scheingruppe kein CitH3 durch Western Blotting nachgewiesen. Die Serumkonzentration von CitH3 stieg nach CLP signifikant an, und dieser Anstieg wurde durch die Hemmung der NET-Bildung durch die Verabreichung von YW3-56, einem pAVK-Inhibitor10, blockiert. Abbildung 2B zeigt die SerumCitH3-Konzentrationen, die durch ELISA bestimmt wurden. 24 h nach CLP war die Serumkonzentration von CitH3 in den CLP-Gruppen im Vergleich zur Scheingruppe erhöht (p = 0,0008), und dieser CitH3-Anstieg wurde durch Cl-Amidin, einen pAVK-Inhibitor, der die NETTO-Bildung begrenzt, signifikant abgeschwächt (p = 0,0028).
Abbildung 1: Experimentelle Gruppierung. Die Mäuse wurden zufällig in die Scheingruppe, CLP-Gruppe, CLP +YW3-56-Gruppe (A) und CLP + Cl-Amidin-Gruppe (B) eingeteilt. CLP wurde wie im Protokoll beschrieben durchgeführt. YW-3-56 (5 mg/kg) oder Cl-Amidin (40 mg/kg) wurde 1 h nach CLP als peritoneale Injektion verabreicht. Die Scheingruppe durchlief die gleichen Verfahren wie die CLP-Gruppen, mit Ausnahme der CLP-Verordnung. Blut wurde zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und das Serum wurde vorbereitet und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. YW3-56 und Cl-Amidin sind beide Peptidyl-Arginin-Deiminase-Inhibitoren, die die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen signifikant begrenzen. Abkürzungen: CitH3 = citrulliniertes Histon H3; CLP = Ligatur und Punktion im Stuhl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Serum-CitH3-Konzentration war im CLP-induzierten Sepsis-Modell signifikant erhöht und wurde durch pAVK-Hemmung gelindert . (A) Western Blotting wurde durchgeführt, um die Serumkonzentration von CitH3 zu testen. In der Scheingruppe wurde kein CitH3 nachgewiesen. Die CitH3-Konzentration war in den CLP-Gruppen signifikant erhöht, und dieser Anstieg wurde durch die Behandlung mit YW3-56 blockiert. (B) Die Serum-CitH3-Konzentrationen wurden mittels ELISA gemessen. In der Scheingruppe wurde fast kein CitH3 nachgewiesen. Die CLP-Gruppen zeigten einen deutlichen Anstieg von CitH3, das durch die Verabreichung von Cl-Amidin abgeschwächt wurde. YW3-56 und Cl-Amidin sind beide pAVK-Inhibitoren, die die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen signifikant begrenzen. Abkürzungen: CitH3 = citrulliniertes Histon H3; CLP = Ligatur und Punktion im Stuhl; PAD = Peptidylarginin-Deiminase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
CLP führt Krankheitserreger in den Bauch ein, um ein präklinisches Modell der Sepsis zu erstellen. Bei der Durchführung von CLP ist es wichtig, sterile Bedingungen zu verwenden, um die Interferenz exogener Bakterien zu beseitigen und genaue Dosierungen von Anästhetika zu verwenden16. Die drei technischen Aspekte von CLP, die den Schweregrad und die Replizierbarkeit des Sepsismodells beeinflussen, sind der Prozentsatz des gebundenen Blinddarms, die Größe der Nadel, die für die Stuhlpunktion verwendet wird, und das Volumen des Kots, der in die Bauchhöhle gepresst wird. Eine Ligation von etwa 75% des Blinddarms führt zu einer schweren Sepsis, 50% Ligation zu einer moderaten Sepsis und 25% Ligation oder weniger zu einer leichten Sepsis17. Die Anzahl der Einstiche und die Nadelgröße bestimmen die Sterblichkeitsrate18, und das beste Ergebnis wird durch Durchgangspunktion erzielt. Eine kleine Menge (ein Tröpfchen) Kot reicht aus, um eine bakterielle Peritonitis zu verursachen, und beim Auspressen des Kots ist Vorsicht geboten. CLP dauert ca. 10 Minuten, wenn es von einer erfahrenen Person durchgeführt wird.
Das in dieser Studie beschriebene Mausmodell der CLP-induzierten Sepsis weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens kann die Maus zu klein sein, um genügend Blutproben für die periphere Blutanalyse und Zytokinmessung zu erhalten. Zweitens kann CLP nicht bei neugeborenen Tieren durchgeführt werden. Drittens tritt immer noch Variabilität auf, und reproduzierbare Ergebnisse können möglicherweise nicht erzielt werden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Chirurgen ausreichende Übung in der Durchführung von CLP haben, bevor sie Forschungstests durchführen.
CLP erstellt ein klinisch realistisches Modell der Sepsis, das den pathophysiologischen Prozess und die Zytokinprofile nachahmt und bei Nagetieren weit verbreitet ist. Der Schweregrad von CLP kann manipuliert werden, um verschiedene Studienzwecke zu erfüllen, indem die Größe der Nadel und der Prozentsatz des ligierten Blinddarms angepasst werden. Nach unseren Ergebnissen, die wir mit dem CLP-Modell erhalten haben, ermöglicht der Nachweis der zirkulierenden CitH3-Konzentration die frühzeitige Diagnose einer Sepsis bei Mäusen. Der diagnostische Wert der Serumkonzentration von CitH3 ermöglicht die sofortige Einleitung von Anti-Sepsis-Behandlungen, die die Ergebnisse septischer Personen signifikant verbessern.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Professor Wang Wei und Dr. Liu Shuai für die Hilfe bei den Experimenten. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Young Research Funding des Xiangya Hospital, Central South University (Nr. 2019Q10), der National and Science Foundation der Provinz Hunan (Nr. 2020JJ4902) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82202394) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
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