Summary
Ce protocole présente les détails opératoires de la ligature et de la ponction des cæcaux (CLP) dans un modèle murin de septicémie. CLP est l’une des techniques les plus largement utilisées pour créer un modèle animal de septicémie. Par conséquent, un protocole CLP normalisé est nécessaire pour obtenir des résultats de recherche fiables.
Abstract
La septicémie est une maladie grave qui met la vie en danger et qui se développe rapidement et qui cause des millions de décès chaque année dans le monde. Les chercheurs ont déployé d’énormes efforts pour élucider la physiopathologie de la septicémie à l’aide de divers modèles animaux; le modèle murin de septicémie induite par ligature et ponction des cæcaux (CLP) est largement utilisé dans les laboratoires. Les trois aspects techniques qui affectent la sévérité et la reproductibilité du modèle CLP sont le pourcentage de caecum ligaturé, la taille de l’aiguille utilisée pour la ponction cæcale et le volume de matières fécales pressées dans la cavité abdominale. Le diagnostic rapide et spécifique de la septicémie est un facteur crucial qui affecte le résultat. L’étalon-or pour le diagnostic de la septicémie est la culture microbienne; Cependant, ce processus prend du temps et est parfois inexact. La détection des biomarqueurs spécifiques de la septicémie est rapide, mais les biomarqueurs existants ne sont pas satisfaisants en raison d’une courte demi-vie, de la non-spécificité et d’une sensibilité insuffisante. Par conséquent, il existe un besoin urgent d’un biomarqueur fiable de la septicémie dans les premiers stades. Des publications antérieures suggèrent que des pièges extracellulaires (TNE) excessifs de neutrophiles se produisent dans la septicémie. L’histone citrullinée H3 (CitH3), en tant que composant NET, est élevée à la fois chez les animaux septiques et les patients, et la présence de CitH3 est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie. La présente étude visait à décrire un modèle murin standardisé de septicémie induite par CLP et à établir un biomarqueur sanguin fiable de la septicémie. Notre travail pourrait contribuer au diagnostic précoce et précis de la septicémie à l’avenir.
Introduction
La septicémie est définie comme un dysfonctionnement d’organe potentiellement mortel causé par une réponse dérégulée de l’hôte à l’infection1, et le choc septique est la principale cause de décès dans les cas graves de septicémie2. La septicémie et le choc septique causent des millions de décès dans le monde chaque année3. La clé pour améliorer les résultats des patients atteints de septicémie est l’initiation rapide de traitements tels que les antibiotiques4. La méthode de référence pour le diagnostic de la septicémie est la culture microbienne; Cependant, la culture microbienne prend beaucoup de temps et peut conduire à des résultats faussement positifs et faussement négatifs, ce qui limite considérablement la signification clinique5. Ainsi, il est hautement souhaitable d’identifier un biomarqueur sanguin de la septicémie. La procalcitonine est reconnue comme un biomarqueur idéal de la septicémie mais a une efficacité diagnostique limitée car elle est incapable de distinguer la septicémie des maladies stériles6.
La ligature et la ponction des cæcaux de souris (CLP) sont couramment utilisées pour créer un modèle de septicémie dans la recherche scientifique. Le CLP est l’un des modèles de septicémie les plus utilisés car il imite la péritonite polymicrobienne, activant à la fois les réponses immunitaires pro-inflammatoires et anti-inflammatoires7. Il est bien admis que le CLP crée un modèle de septicémie plus pertinent sur le plan clinique que les techniques alternatives, telles que l’injection d’endotoxines bactériennes. Par conséquent, le CLP est considéré comme le modèle classique de septicémie à utiliser dans la recherche8. Cependant, un inconvénient majeur du CLP est sa reproductibilité, car la gravité du modèle est affectée par plusieurs facteurs tels que le pourcentage de caecum ligaturé, la taille de l’aiguille, le nombre de ponctions et la technique de laparotomie. Par conséquent, il est nécessaire de normaliser le modèle de septicémie induite par CLP. La présente étude décrit les détails du protocole du modèle de septicémie induite par CLP pour montrer la procédure standardisée et augmenter sa reproductibilité.
La réponse inflammatoire se produit au stade précoce de la septicémie, les neutrophiles libérant des quantités excessives d’oxydants et de protéases qui causent des dommages aux organes8. Un facteur clé dans la physiopathologie de la septicémie est la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui libèrent des composants nucléaires et cytosoliques tels que l’ADN, les histones citrullinées et les protéinases antimicrobiennes9. Des études récentes suggèrent qu’une production excessive de TNE médie la pathologie de la septicémie; pendant ce temps, une diminution des TNE, par inhibition enzymatique de la peptidyl arginine déiminase (PAD) par des produits chimiques comme YW3-56 ou Cl-amidine, exerce un effet pro-survie dans des modèles murins de septicémie10,11. L’histone citrullinée H3 (CitH3) a été identifiée comme une protéine spécifique de la septicémie en 201112, et des publications ultérieures ont démontré que la concentration circulante de CitH3 est un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie13,14. CitH3 est considéré comme un biomarqueur plus sensible et durable que la procalcitonine, et est plus spécifique pour distinguer la septicémie que les cytokines inflammatoires13.
Dans cette étude, nous avons évalué un biomarqueur diagnostique fiable de la septicémie dans un modèle murin de septicémie induit par CLP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le Comité d’examen des animaux de l’hôpital Xiangya et de l’Université centrale du Sud (n ° 202103149).
1. Préparation
- Sélectionnez les souris C57BL/6J mâles (poids : 20-25 g ; âge : 8-12 semaines) et hébergez-les pendant 3 jours avant d’effectuer toute procédure.
- Pesez la souris.
- Anesthésiez la souris avec 1,5% d’isoflurane par inhalation et pincez les orteils pour vérifier la profondeur de l’anesthésie.
- Fixez la souris sur le coussin chauffant. Appliquez une crème dépilatoire sur l’abdomen et ne laissez pas plus de 1 min avant de retirer la crème et les cheveux.
REMARQUE: La température corporelle normale doit être maintenue en plaçant un tampon chaud sous la souris anesthésiée pendant la chirurgie.
2. Fonctionnement
- Préparer des instruments chirurgicaux stériles adaptés à la chirurgie des rongeurs. Portez des gants stériles, un masque facial et une blouse chirurgicale pour assurer des conditions d’asepsie.
- Désinfectez la peau abdominale avec des lingettes iodées au moins trois fois. Couvrir la zone chirurgicale opératoire avec des champs chirurgicaux stériles.
- Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour faire une incision d’environ 2 cm dans la paroi abdominale le long de la linea alba.
NOTE: N’endommagez pas les organes. - Identifier et isoler le caecum hors de la cavité péritonéale avec une pince à épiler stérile.
- Ligate 75% du volume du caecum avec des sutures en soie 4-0. Ne ligaturez pas les vaisseaux sanguins mésentériques.
REMARQUE: Le pourcentage du caecum qui est ligaturé détermine la gravité de la septicémie. - Percer le caecum en créant une perforation traversante (deux trous) avec une aiguille de 21 G (d’un côté à travers la paroi cécale au côté opposé) au point médian entre l’extrémité de la queue et le jeu de ligature.
- Jetez l’aiguille. Pressez doucement une petite gouttelette de matières fécales hors du caecum à travers les trous de pénétration.
REMARQUE: La quantité de matières fécales pressées dans la cavité péritonéale doit être constante, car elle détermine également la gravité de la septicémie. Les étapes 2.5-2.7 doivent être ignorées pour les souris simulées. - Replacez doucement le caecum dans la cavité abdominale.
- Fermez le muscle abdominal et la peau séparément avec des sutures de soie 6-0.
- Désinfectez l’incision avec de l’iode.
- Injectez du kétoprofène (5 mg/kg) dans le quadrant inférieur gauche de l’abdomen pour éviter le caecum. Placez la souris sur un coussinet chaud jusqu’à ce qu’elle se soit complètement rétablie de l’anesthésie.
- Placez la souris dans une cage dans une pièce à température contrôlée (22 °C) et laissez-la libre accès à la nourriture et à l’eau. Vérifiez la souris toutes les 6 heures pendant la première semaine postopératoire.
- Euthanasier la souris par surdose de dioxyde de carbone lorsque les symptômes de septicémie répondent aux critères prédéfinis.
3. Traitement
- Divisez au hasard les souris en groupe simulé, groupe CLP, groupe CLP + YW3-56 (Figure 2a) et groupe CLP + Cl-amidine (Figure 1).
Remarque : Le groupe fictif a subi les mêmes procédures que les groupes CLP à l’exception de CLP. YW3-56 (5 mg / kg) ou Cl-amidine (40 mg / kg) a été administré par injection péritonéale 1 h après l’étape 2.9 lors de la suture de la couche musculaire et cutanée. - Récolte d’échantillons
- Prélever le sang périphérique du plexus rétrobulbaire15 24 h après l’opération.
- Préparer le sérum par centrifugation (1 000 x g, 5 min) et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Mesurer la concentration de CitH3 à l’aide d’un kit ELISA sandwich indirect comme décrit précédemment13.
- Enduisez l’anticorps monoclonal anti-CitH3 sur une plaque de 96 puits pour capturer la protéine CitH3.
- Traiter le sérum avec la DNase I (150 unités/mL, 37°pendant 1 h) et incuber dans les puits (20 μL, température ambiante).
- Ajouter un anticorps polyclonal anti-CitH3 (0,33 μg/mL, 100 μL, 2 h) pour détecter la protéine CitH3 capturée.
- Incuber l’anticorps secondaire marqué anti-peroxydase lapin (0,02 μg/mL, 100 μl, 1 h) dans les puits.
- Après un lavage complet, développer les puits avec de la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (100 μL, 20 min).
NOTE: De plus amples détails sur le protocole de la trousse ELISA sont fournis dans la publication précédente13.
- Analyse statistique
- Effectuer une ANOVA d’une façon pour analyser les différences entre les trois groupes, suivie de tests post-hoc de Bonferroni pour des comparaisons multiples. Utilisez un logiciel statistique pour effectuer l’analyse. p valeurs de 0,05 ou moins ont été considérées comme significatives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Comme le montre la figure 2A, aucun CitH3 n’a été détecté dans le groupe simulé par transfert Western. La concentration sérique de CitH3 a augmenté de manière significative après la CLP, et cette augmentation a été bloquée par l’inhibition de la formation de TNE via l’administration de YW3-56, un inhibiteur de la MAP10. La figure 2B montre les concentrations de sérumCitH3 déterminées par ELISA. À 24 heures après la CLP, la concentration sérique de CitH3 a augmenté dans les groupes CLP par rapport au groupe placebo (p = 0,0008), et cette augmentation de CitH3 a été significativement atténuée par Cl-amidine, un inhibiteur de la MAP qui limite la formation de TNE (p = 0,0028).
Figure 1 : Regroupement expérimental. Les souris ont été divisées au hasard en groupe simulé, groupe CLP, groupe CLP + YW3-56 (A) et groupe CLP + Cl-amidine (B). Le CLP a été effectué comme décrit dans le protocole. YW-3-56 (5 mg/kg) ou Cl-amidine (40 mg/kg) a été administré par injection péritonéale 1 h après CLP. Le groupe fictif a subi les mêmes procédures que les groupes CLP, à l’exception du CLP. Le sang a été prélevé à différents moments, et le sérum a été préparé et conservé à -80 °C jusqu’à utilisation. YW3-56 et Cl-amidine sont tous deux des inhibiteurs de la peptidyl arginine déiminase qui limitent considérablement la formation de pièges extracellulaires neutrophiles. Abréviations : CitH3 = histone citrullinée H3; CLP = ligature et ponction cæcales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La concentration sérique de CitH3 a été significativement augmentée dans le modèle de septicémie induite par CLP et a été atténuée par l’inhibition de la MAP. (A) Un transfert Western a été effectué pour tester la concentration sérique de CitH3. Aucun CitH3 n’a été détecté dans le groupe fictif. La concentration de CitH3 a été significativement augmentée dans les groupes CLP, et cette augmentation a été bloquée par le traitement YW3-56. (B) Les concentrations sériques de CitH3 ont été mesurées par ELISA. Presque aucun CitH3 n’a été détecté dans le groupe fictif. Les groupes CLP ont montré des augmentations marquées de CitH3, qui a été atténuée par l’administration de Cl-amidine. YW3-56 et Cl-amidine sont tous deux des inhibiteurs de la MAP qui limitent considérablement la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles. Abréviations : CitH3 = histone citrullinée H3; CLP = ligature et ponction des celles; PAD = peptidyl arginine déiminase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLP introduit des agents pathogènes dans l’abdomen pour créer un modèle préclinique de septicémie. Lors de l’exécution du CLP, il est important d’utiliser des conditions stériles pour éliminer l’interférence des bactéries exogènes et d’utiliser des dosages précis d’anesthésiques16. Les trois aspects techniques du CLP qui affectent la gravité et la reproductibilité du modèle de septicémie sont le pourcentage de caecum ligaturé, la taille de l’aiguille utilisée pour la ponction cæcale et le volume de matières fécales pressées dans la cavité abdominale. La ligature d’environ 75 % du caecum entraîne une septicémie grave, 50 % une ligature entraîne une septicémie modérée et 25 % ou moins une ligature entraîne une septicémie légère17. Le nombre de ponctions et la taille de l’aiguille déterminent le taux de mortalité18, et le meilleur résultat est obtenu par la ponction à travers et à travers. Une petite quantité (une gouttelette) de matières fécales est suffisante pour provoquer une péritonite bactérienne, et des précautions sont nécessaires lors de l’extraction des matières fécales. CLP prend environ 10 min lorsqu’il est effectué par une personne expérimentée.
Le modèle murin de septicémie induite par CLP décrit dans cette étude présente plusieurs limites. Tout d’abord, la souris peut être trop petite pour obtenir suffisamment d’échantillons de sang pour l’analyse du sang périphérique et la mesure des cytokines. Deuxièmement, le CLP ne peut pas être effectué chez les animaux nouveau-nés. Troisièmement, la variabilité se produit toujours et des résultats reproductibles peuvent ne pas être obtenus. Il est important de s’assurer que les chirurgiens ont eu une pratique adéquate dans la réalisation de CLP avant d’effectuer des tests de recherche.
CLP crée un modèle cliniquement réaliste de septicémie qui imite le processus physiopathologique et les profils de cytokines et a été largement utilisé chez les rongeurs. La gravité du CLP peut être manipulée pour remplir différents objectifs d’étude en ajustant la taille de l’aiguille et le pourcentage de caecum ligaturé. Selon nos résultats obtenus à l’aide du modèle CLP, la détection de la concentration circulante de CitH3 permet le diagnostic précoce de la septicémie chez la souris. La valeur diagnostique de la concentration sérique de CitH3 permet l’initiation rapide de traitements anti-septicémie qui améliorent considérablement les résultats des personnes septiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d’intérêts déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions le professeur Wang Wei et le docteur Liu Shuai pour leur aide dans les expériences. Ce travail a été financé par des subventions du Young Research Funding de l’hôpital Xiangya, Central South University (n ° 2019Q10), de la Fondation nationale et scientifique de la province du Hunan (n ° 2020JJ4902) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
