Summary
פרוטוקול זה מציג את הפרטים האופרטיביים של קשירת cecal ונקב (CLP) במודל עכבר של אלח דם. CLP היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר ליצירת מודל חייתי של אלח דם. לכן, נדרש פרוטוקול CLP סטנדרטי להשגת תוצאות מחקר אמינות.
Abstract
אלח דם היא מחלה מסכנת חיים ומתפתחת במהירות הגורמת למיליוני מקרי מוות מדי שנה ברחבי העולם. חוקרים עשו מאמצים אדירים להבהיר את הפתופיזיולוגיה של אלח דם באמצעות מודלים שונים של בעלי חיים; מודל העכבר של אלח דם המושרה על ידי קשירת cecal ונקב (CLP) נמצא בשימוש נרחב במעבדות. שלושת ההיבטים הטכניים המשפיעים על חומרתו ושכפולו של מודל CLP הם אחוז הצקום הקשור, גודל המחט המשמשת לניקוב cecal, ונפח הצואה הנדחקת לחלל הבטן. האבחנה המהירה והספציפית של אלח דם היא גורם מכריע המשפיע על התוצאה. תקן הזהב לאבחון אלח דם הוא תרבית מיקרוביאלית; עם זאת, תהליך זה גוזל זמן ולעיתים אינו מדויק. הזיהוי של סמנים ביולוגיים ספציפיים לאלח דם הוא מהיר, אך הסמנים הביולוגיים הקיימים אינם מספקים בשל זמן מחצית חיים קצר, חוסר ספציפיות ורגישות לא מספקת. לכן, יש צורך דחוף סמן ביולוגי אמין של אלח דם בשלבים המוקדמים. פרסומים קודמים מצביעים על כך שמלכודות חוץ-תאיות מוגזמות של נויטרופילים (NETs) מתרחשות באלח דם. היסטון H3 (CitH3), כמרכיב NET, מוגבה הן בבעלי חיים סופגים והן בחולים, ונוכחותו של CitH3 היא סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם. המחקר הנוכחי נועד לתאר מודל עכברי סטנדרטי של אלח דם המושרה על ידי CLP ולבסס סמן ביולוגי אמין בדם של אלח דם. עבודתנו עשויה לתרום לאבחון מוקדם ומדויק של אלח דם בעתיד.
Introduction
אלח דם מוגדר כתפקוד לקוי של איברים מסכני חיים הנגרם על ידי תגובת מארח לא מווסתת לזיהום1, והלם ספטי הוא סיבת המוות המובילה במקרים חמורים של אלח דם2. אלח דם והלם ספטי גורמים למיליוני מקרי מוות ברחבי העולם מדי שנה3. המפתח לשיפור התוצאה של חולים עם אלח דם הוא ייזום מהיר של טיפולים כגון אנטיביוטיקה4. שיטת תקן הזהב לאבחון אלח דם היא תרבות מיקרוביאלית; עם זאת, תרבית מיקרוביאלית גוזלת זמן רב ויכולה להוביל לתוצאות חיוביות שגויות ושליליות שגויות, המגבילות מאוד את המשמעות הקלינית5. לכן, רצוי מאוד לזהות סמן ביולוגי בדם של אלח דם. פרוקלציטונין מוכר כסמן ביולוגי אידיאלי לאלח דם, אך יש לו יעילות אבחנתית מוגבלת מכיוון שהוא אינו מסוגל להבחין בין אלח דם למחלות סטריליות6.
קשירת צקאל עכבר ודיקור (CLP) משמשת בדרך כלל ליצירת מודל של אלח דם במחקר מדעי. CLP הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר של אלח דם מכיוון שהוא מחקה דלקת צפק פולימיקרוביאלית, ומפעיל תגובות חיסוניות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות7. מקובל כי CLP יוצר מודל אלח דם רלוונטי יותר מבחינה קלינית מאשר טכניקות חלופיות, כגון הזרקת אנדוטוקסין חיידקי. לכן, CLP נחשב למודל אלח הדם הקלאסי לשימוש במחקר8. עם זאת, חסרון מרכזי של CLP הוא יכולת השכפול שלו, שכן חומרת המודל מושפעת ממספר גורמים כגון אחוז הצקום קשירה, גודל המחט, מספר הנקבים וטכניקת הלפרוטומיה. לכן, יש צורך לתקנן את מודל אלח דם המושרה על ידי CLP. המחקר הנוכחי מתאר את פרטי הפרוטוקול של מודל אלח הדם המושרה על ידי CLP כדי להראות את ההליך הסטנדרטי ולהגדיל את יכולת השכפול שלו.
התגובה הדלקתית מתרחשת בשלב מוקדם של אלח דם, כאשר נויטרופילים משחררים כמויות מופרזות של מחמצנים ופרוטאזות הגורמים נזק לאיברים8. גורם מפתח בפתופיזיולוגיה של אלח דם הוא היווצרות מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs), המשחררות רכיבים גרעיניים וציטוזוליים כגון דנ"א, היסטונים ציטרולין וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים9. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שדור מופרז של NETs מתווך את הפתולוגיה של אלח דם; בינתיים, ירידה של NETs, באמצעות עיכוב אנזימטי של פפטידיל ארגינין deiminase (PAD) על ידי כימיקלים כמו YW3-56 או Cl-amidine, מפעילה אפקט פרו-הישרדותי במודלים עכברים של אלח דם10,11. היסטון H3 (CitH3) זוהה כחלבון ספציפי לאלח דם בשנת 201112, ופרסומים מאוחרים יותר הראו כי ריכוז CitH3 במחזור הוא סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם13,14. CitH3 נחשב לסמן ביולוגי רגיש יותר וארוך טווח יותר מאשר פרוקלציטונין, והוא ספציפי יותר בהבחנה בין אלח דם מאשר ציטוקינים דלקתיים13.
במחקר זה, הערכנו סמן ביולוגי אבחוני אמין של אלח דם במודל עכבר המושרה על ידי CLP של אלח דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הוועדה לבדיקת חיות בבית החולים שיאנגיה ובאוניברסיטת סנטרל דרום (מס '202103149).
1. הכנה
- עכברי C57BL/6J זכרים נבחרים (משקל: 20-25 גרם; גיל: 8-12 שבועות) ובבית למשך 3 ימים לפני ביצוע הליכים כלשהם.
- שקלו את העכבר.
- מרדים את העכבר עם 1.5% איזופלורן על ידי שאיפה וצובט את הבהונות כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
- הנח את העכבר על כרית החימום. החל קרם דפילציה על הבטן ולהשאיר לא יותר מ 1 דקה לפני הסרת הקרם והשיער.
הערה: יש לשמור על טמפרטורת גוף תקינה על ידי הנחת כרית חמה מתחת לעכבר המרדים במהלך הניתוח.
2. מבצע
- הכינו כלי ניתוח סטריליים המתאימים לניתוח בעלי חיים מכרסמים. יש ללבוש כפפות סטריליות, מסכת פנים וחלוק כירורגי כדי להבטיח תנאים אספטיים.
- לחטא את עור הבטן עם מגבונים יוד לפחות שלוש פעמים. יש לכסות את אזור הניתוח הניתוחי בווילונות כירורגיים סטריליים.
- השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי לבצע חתך של כ -2 ס"מ בדופן הבטן לאורך הלינאה אלבה.
הערה: אין לפגוע באיברים. - לזהות ולבודד את cecum מתוך חלל הצפק עם פינצטה סטרילית.
- ליגייט 75% מנפח הצקום עם 4-0 תפרי משי. אין לנעוץ את כלי הדם המזנטריים.
הערה: אחוז הצקום המחויב קובע את חומרת אלח הדם. - נקבו את הצקום על ידי יצירת ניקוב אחד דרך ודרך (שני חורים) עם מחט של 21 G (מצד אחד דרך דופן הסקל לצד הנגדי) בנקודת האמצע שבין קצה הזנב לסט הקשירה.
- השליכו את המחט. סוחטים בעדינות טיפה קטנה של צואה מתוך הצואה דרך חורי החדירה.
הערה: כמות הצואה שנדחקה לתוך חלל הצפק צריכה להיות עקבית, שכן זה גם קובע את חומרת אלח דם. יש לדלג על שלבים 2.5-2.7 עבור עכברי בושה. - החלף בעדינות את הצקום לתוך חלל הבטן.
- סגרו את שרירי הבטן והעור בנפרד עם 6-0 תפרי משי.
- יש לחטא את החתך ביוד.
- הזריקו קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) ברביע השמאלי התחתון של הבטן כדי למנוע את הצקום. הניחו את העכבר על כרית חמה עד שהוא התאושש לחלוטין מההרדמה.
- הניחו את העכבר בכלוב בחדר עם בקרת טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס) ותנו גישה חופשית למזון ולמים. בדוק את העכבר כל 6 שעות בשבוע הראשון שלאחר הניתוח.
- הרדמת העכבר על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני כאשר הסימפטומים של אלח דם פוגשים את נקודות הקצה שהוגדרו מראש.
3. טיפול
- חלקו באופן אקראי עכברים לקבוצת הבושה, קבוצת CLP, קבוצת CLP + YW3-56 (איור 2a) וקבוצת CLP + Cl-amidine (איור 1).
הערה: קבוצת הבושה עברה את אותם הליכים כמו קבוצות CLP למעט CLP. YW3-56 (5 מ"ג/ק"ג) או Cl-amidine (40 מ"ג/ק"ג) ניתנו בהזרקת פריטונל שעה לאחר שלב 2.9 בעת תפירת שכבת השריר והעור. - קציר לדוגמה
- קצירת דם היקפי ממקלעת רטרובולבר15 24 שעות לאחר הניתוח.
- מכינים את הסרום על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם, 5 דקות) ומאחסנים בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
- מדוד את ריכוז CitH3 באמצעות ערכת ELISA של סנדוויץ' עקיף כפי שתואר קודםלכן 13.
- מצפים את הנוגדן החד-שבטי נגד CitH3 על צלחת בעלת 96 בארות כדי ללכוד את חלבון CitH3.
- יש לטפל בסרום עם DNase I (150 יחידה/מ"ל, 37° למשך שעה) ולדגירה בבארות (20 μL, טמפרטורת החדר).
- הוסיפו נוגדן פוליקלונלי נגד CitH3 (0.33 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרול, 2 שעות) כדי לזהות את חלבון CitH3 שנתפס.
- לדגום את הנוגדן המשני המסומן נגד פרוקסידאז (0.02 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם, שעה אחת) בבארות.
- לאחר שטיפה יסודית, לפתח את הבארות עם 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (100 μL, 20 דקות).
הערה: פרטי פרוטוקול נוספים של ערכת ELISA מסופקים בפרסום הקודם13.
- ניתוח סטטיסטי
- בצע בדרך אחת ANOVA כדי לנתח את ההבדלים בין שלוש הקבוצות, ולאחר מכן Bonferroni לאחר בדיקת הוק להשוואות מרובות. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לבצע את הניתוח. ערכי p של 0.05 או פחות נחשבו משמעותיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שניתן לראות באיור 2A, לא זוהה CitH3 בקבוצת הבושה על ידי כתם מערבי. ריכוז CitH3 בסרום עלה באופן משמעותי לאחר CLP, ועלייה זו נחסמה על ידי עיכוב היווצרות NET באמצעות מתן YW3-56, מעכב PAD10. איור 2B מראה את ריכוזי הסרוםCitH3 שנקבעו על-ידי ELISA. ב-24 שעות לאחר CLP, ריכוז ה-CitH3 בסרום עלה בקבוצות ה-CLP בהשוואה לקבוצת ה-sham (p = 0.0008), ועלייה זו של CitH3 הוחלשה באופן משמעותי על-ידי Cl-amidine, מעכב PAD המגביל את היווצרות ה-NET (p = 0.0028).
איור 1: קיבוץ ניסויי. עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצת הבושה, קבוצת CLP, קבוצת CLP +YW3-56 (A) וקבוצת CLP + Cl-amidine (B). CLP בוצע כמתואר בפרוטוקול. YW-3-56 (5 מ"ג/ק"ג) או קל-אמידין (40 מ"ג/ק"ג) ניתן באמצעות הזרקת פריטונל שעה לאחר CLP. קבוצת הבושה עברה את אותם הליכים כמו קבוצות CLP למעט CLP. הדם נאסף בנקודות זמן שונות, והסרום הוכן ואוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. YW3-56 וקל-אמידין הם שניהם מעכבי פפטידיל ארגינין דימינאז המגבילים באופן משמעותי את היווצרותן של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות. קיצורים: CitH3 = היסטון H3; CLP = קשירת cecal ונקב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ריכוז CitH3 בסרום עלה באופן משמעותי במודל אלח הדם המושרה על-ידי CLP, והוקל על-ידי עיכוב PAD. (A) כתם מערבי בוצע כדי לבדוק את ריכוז CitH3 בסרום. לא זוהה CitH3 בקבוצת הבושה. ריכוז CitH3 עלה באופן משמעותי בקבוצות CLP, ועלייה זו נחסמה על ידי טיפול YW3-56. (B) ריכוזי CitH3 בסרום נמדדו על ידי ELISA. כמעט ולא זוהה CitH3 בקבוצת הבושה. קבוצות CLP הראו עליות ניכרות ב- CitH3, אשר הוחלש על ידי מתן Cl-amidine. YW3-56 ו-Cl-amidine הם שניהם מעכבי PAD המגבילים באופן משמעותי את היווצרותן של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות. קיצורים: CitH3 = היסטון H3; CLP = קשירת cecal ונקב; PAD = פפטידיל ארגינין דימינאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLP מכניס פתוגנים לתוך הבטן כדי ליצור מודל פרה-קליני של אלח דם. בעת ביצוע CLP, חשוב להשתמש בתנאים סטריליים כדי למנוע את ההפרעה של חיידקים אקסוגניים ולהשתמש במינונים מדויקים של חומרי הרדמה16. שלושת ההיבטים הטכניים של CLP המשפיעים על חומרתו ושכפולו של מודל אלח הדם הם אחוז הצקום הקשור, גודל המחט המשמשת לניקוב cecal, ונפח הצואה הנדחקת לחלל הבטן. קשירת כ-75% מהצקום גורמת לאלח דם חמור, קשירת 50% גורמת לאלח דם בינוני, ו-25% קשירה או פחות גורמת לאלח דם קל17. מספר הנקבים וגודל המחט קובעים את שיעור התמותה18, והתוצאה הטובה ביותר מושגת על ידי ניקור דרך ודרך. כמות קטנה (טיפה) של צואה מספיקה כדי לגרום לדלקת צפק חיידקית, וטיפול נדרש בעת סחיטת הצואה. CLP לוקח בערך 10 דקות כאשר הוא מבוצע על ידי אדם מנוסה.
למודל העכבר של אלח דם המושרה על ידי CLP המתואר במחקר זה יש מספר מגבלות. ראשית, העכבר עשוי להיות קטן מכדי לקבל מספיק דגימות דם לניתוח דם היקפי ומדידת ציטוקינים. שנית, CLP לא יכול להתבצע בבעלי חיים שזה עתה נולדו. שלישית, השונות עדיין מתרחשת, ולא ניתן להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. חשוב לוודא כי המנתחים התאמנו כראוי בביצוע CLP לפני ביצוע בדיקות מחקר.
CLP יוצר מודל מציאותי מבחינה קלינית של אלח דם המחקה את התהליך הפתופיזיולוגי ואת פרופילי הציטוקינים ונמצא בשימוש נרחב במכרסמים. ניתן לתמרן את חומרת CLP כדי למלא מטרות מחקר שונות על ידי התאמת גודל המחט ואחוז הצקום הקשור. על פי התוצאות שלנו שהתקבלו באמצעות מודל CLP, זיהוי ריכוז CitH3 במחזור מאפשר אבחון מוקדם של אלח דם בעכברים. הערך האבחנתי של ריכוז CitH3 בסרום מאפשר התחלה מהירה של טיפולים נגד אלח דם המשפרים משמעותית את התוצאות של אנשים ספיגה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לפרופסור וונג וואי ולדוקטור ליו שואי על עזרתם בניסויים. עבודה זו מומנה על ידי מענקים ממימון המחקר הצעיר של בית החולים שיאנגיה, אוניברסיטת סנטרל דרום (מס '2019Q10), מהקרן הלאומית והמדעית של מחוז הונאן (מס '2020JJ4902), ומהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
