Summary
ゲノム規模でのRNA編集イベントの迅速な検出と信頼性の高い定量化は依然として困難であり、現在は直接RNAシーケンシング法に依存しています。ここで説明するプロトコルは、RNA編集を検出するための簡単で迅速でポータブルな方法として、微小温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)を使用しています。
Abstract
RNA編集は、RNAにおける転写後配列変化をもたらすプロセスである。RNA編集の検出と定量は、主にサンガーシーケンシングとRNAシーケンシング技術に依存しています。ただし、これらの方法はコストと時間がかかる場合があります。このプロトコルでは、ポータブルマイクロ温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)システムが、RNA編集の迅速な検出のための非シーケンシングアプローチとして使用されます。このプロセスは電気泳動の原理に基づいており、核酸サンプルがポリアクリルアミドゲル上を移動する際に高温を使用して変性します。さまざまな温度にわたって、DNA断片は、完全に分離された二本鎖DNAから部分的に分離された鎖への勾配を形成し、次いで完全に分離された一本鎖DNAへの勾配を形成する。異なるヌクレオチド塩基を有するRNA編集部位は、μTGGE分析において異なる融解プロファイルを生成する。我々は、μTGGEベースのアプローチを使用して、4つの編集されたRNA断片とそれらに対応する非編集(野生型)断片の融解プロファイルの違いを特徴付けた。パターン類似性スコア(PaSS)は、編集されたRNAと編集されていないRNAによって生成されたバンドパターンを比較することによって計算され、方法の再現性を評価するために使用された。全体として、ここで説明するプラットフォームは、RNA中の一塩基変異でさえも、簡単でシンプルで費用対効果の高い方法で検出することを可能にします。この解析ツールは、新しい分子生物学の知見の一助となることが期待されます。
Introduction
ゲノムRNA中の一塩基変異体(SNV)は、A対I、C対U、およびU対C変異体を含むが、RNA編集事象を示し得る。しかし、RNA中のSNVの検出は依然として技術的に困難な作業である。従来、編集済みRNAと非編集RNAの比率は、直接シークエンシング、対立遺伝子特異的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または変性高速液体クロマトグラフィー(HPLC)アプローチによって決定される1、2、3、4、5、6に近づく。しかし、これらのアプローチは特に時間的または費用対効果が高くなく、高レベルのノイズによって引き起こされるそれらの低い精度は、RNAベースのSNV検出の技術的ボトルネックを引き起こします7,8。ここでは、RNA編集解析への直接RNAシーケンシングアプローチの必要性を排除する代替方法として、一塩基多型(SNP)を同定するための温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)に基づくプロトコルについて説明します。
電気泳動は、生命科学実験室における生体分子の分離および分析のための好ましい方法である。TGGEは、同じサイズでありながら配列が異なる二本鎖DNA断片の分離を可能にする。この技術は、DNA断片の融解温度における配列関連の違いと、それに続く線形温度勾配9,10を有する多孔質ゲルにおけるそれらの移動度の変化に依存する。DNA断片の融解は、特異的な融解プロファイルを生成する。最も低い融解温度を有するドメインがゲル内の特定の位置で対応する温度に達すると、らせん構造から部分的に融解した構造への移行が起こり、分子の遊走は実質的に停止する。したがって、TGGEはDNA断片の移動度(サイズ情報)と温度誘起構造遷移(配列依存性情報)の両方を利用し、DNA断片の特性評価への強力なアプローチとなっています。DNA分子の3つの構造遷移に対応するTGGE融解パターンの特徴点は、鎖初期解離点、鎖中間解離点、鎖末端解離点です(図1)。ドメイン内の配列の変動は、たとえ一塩基の違いであっても、融解温度に影響を与えるため、異なる配列を持つ分子はTGGE分析において離散的な融解(変性)パターンを示します。したがって、TGGEはゲノムRNA中のSNVを分析するために使用でき、RNA編集を検出するための非常に貴重なハイスループット方法となり得る。このハイスループットゲインは、従来のゲル電気泳動ベースのTGGEを使用すると失われます。しかし、microTGGE(μTGGE)と名付けられたTGGEの小型化バージョンは、ゲル電気泳動時間を短縮し、生産性を100倍向上させて分析を加速するために使用できます11。μTGGE法のシンプルさとコンパクトさは、現場で適用可能なハンドヘルドで手頃な価格のゲル電気泳動システムであるPalmPAGE12の導入によって改善されました。
ここでは、新しいTGGEベースのプロトコルを使用して、 シロイヌナズナ 組織からの2つと哺乳動物のHEK293細胞で発現された2つを含む4つの遺伝子における3種類のRNA編集部位(A-to-I、C-to-U、およびU-to-C)を調べる。このプロトコルは、RNA編集の迅速な検出のためのポータブルシステムであるPalmPAGE(ハードウェア)とuMelt(ソフトウェア)の使用を統合しています13。平均実行時間は 15 ~ 30 分で、このプロトコルは、直接 RNA シーケンシングアプローチを必要とせずに、RNA 編集の迅速で信頼性が高く、簡単な識別を可能にします。
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Protocol
1. ターゲットフラグメントの最適化
注:このプロトコルの開発には、 A. thalianaの2つの核遺伝子(AT2G16586およびAT5G02670)、およびHEK293細胞で発現する青色蛍光タンパク質(BFP)および増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)をコードする遺伝子を含む、4つの編集された遺伝子が使用された。
- 編集領域と非編集領域を表す異なる融解プロファイルを有する遺伝子断片を同定するために、元のuMeltソフトウェア13の拡張であるuMelt HETSウェブベースのツールを使用して予測融解曲線を生成する。
注: このツールは、ヘテロ二重およびホモデュプレックス製品の融解曲線の形状を予測します。 - 各標的遺伝子について、3対の遺伝子断片(長さ300〜324bp)を設計する。各ペアは、編集部位を有する断片と、5'末端、中間位置、または3'末端のいずれかに位置する非編集部位を有する対応する野生型断片とから構成される。
- さらなる分析のために、ヘリシティ軸上の融解領域間の最大差を示した非編集/編集ペアを選択します。μTGGE解析の場合、以下のセクション2に記載されるように、PCR増幅によって選択された遺伝子断片を合成する。
- DNADynamoソフトウェア(https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm)を使用してフォワードプライマーとリバースプライマーを設計し、NCBI Primer-BLASTツールを使用して検証します。
- プライマーをTE緩衝液(1mM EDTA·Na2)を100pmol/μLの濃度で保存し、使用前に、各プライマーセットを蒸留水を用いて10pmol/μLの濃度に希釈する。
2. 標的断片のRNA抽出とRT-PCR増幅
- RNA抽出
- 編集済みおよび非編集された遺伝子の供給源から、TRIzol抽出14 または市販のキットなどの標準的な方法を用いて全RNAを抽出する。
- ステップ2.2で説明したように、標準RT-PCRプロトコルを使用して対応するcDNAの合成を実行します。
- 逆転写
- 1 μL のオリゴ(dT)プライマー、1 μL の 10 mM dNTP ミックス、10 μL の全 RNA、および 10 μL の滅菌蒸留水をヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブに加えます。
- 混合物を65°Cで5分間加熱し、次いで氷上で少なくとも1分間インキュベートする。
- 最大速度(12,000 x g)で2~3秒間遠心分離してチューブの内容物を集め、4 μLの5x ReverTra Aceバッファー、1 μLの0.1 M DTT、および1 μLのM-MLV(Moloney Murine 白血病ウイルス)逆転写酵素(200 U/μL、 材料表)を加える。
- 優しく上下にピペッティングして混ぜる。ランダムプライマーを使用する場合は、チューブを25°Cで5分間インキュベートする。
- チューブを55°Cで60分間インキュベートし、デジタルドライバス/ブロックヒーターで70°Cで15分間加熱して反応を失活させます。
- 分光光度計を用いてcDNAの濃度を測定し、-25°Cで保存する。
-
PCR増幅および産物の確認シーケンシング
- ヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブに以下の試薬を加える:4 μLの5 Taq Polymerase Buffer、2 μLの2 mM dNTPミックス、2 μLの25 mM MgCl 2、1.6 μLのプライマーセット(正方向と逆方向;各10 mM)、2 μLのcDNAテンプレート、0.1 μLのTaqポリメラーゼ(2.5 U/μL)、および8.3 μLの滅菌蒸留水(最終容量、 20 μL)。
- 以下のサイクル条件でPCRを行う:初期変性を95°Cで2分間;95°Cで2分間の変性を35サイクル、適切な温度で(使用する特定のプライマーセットに応じて)30秒間アニーリングし、72°Cで2分間伸長する;その後、72°Cで7分間最終伸長した。
- PCR産物を精製するために、2UのエキソヌクレアーゼIおよび0.5Uのエビアルカリホスファターゼ(ExoSAP)を添加する。チューブをサーマルサイクラー中で37°Cで1時間インキュベートし、続いて80°Cで15分間インキュベートし、次いで次のステップまで4°Cに維持する。
- 確認シーケンシングのために、11.5 μL の滅菌蒸留水、2.5 μL のフォワードプライマーまたはリバースプライマー、および 1 μL の PCR 産物 (ExoSAP を使用) を新しい微量遠心チューブに追加します。
注: シーケンシング解析には、DNA シーケンシングサービス(Eurofins Genomics など)を使用してください。 - PCR 産物の特異性を検証するには、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方でシーケンシングを実行します。代表的な解析に用いたプライマー対を 表1に示す。
- 精製したPCR産物を脱イオン水で200ng/μLの濃度に希釈する。次に、精製物 6 μL と 3 μL の 6 x ゲルローディング色素を 250 μL チューブで混合し、滅菌水で全量を 12 μL に上げます。PCR産物を、以下に説明するようにμTGGEで進行する準備ができるまで(-25°Cで)保存する。
3. μTGGE分析
注:μTGGE分析は、小型化された経済的なシステムを使用して実行されます。ゲルカセット、ゲルカセットホルダー、水平ゲル電気泳動プラットフォーム、電源、およびゲルイメージングシステムを含む完全なシステムの概要を 図2に示します。
- ゲルカセットの組み立て
- μTGGE分析に用いたゲルカセットを 図2Aに示す。このデザインは、ボトムゲルプレート、トップゲルプレート、レーンフォーマープレートの3つの1インチゲルプレートで構成されています。上部のゲルプレートを他の2つのプレートの間に挟み込み、ゲル重合用のゲルカセットホルダーに組み立てます。
- ポリアクリルアミドゲル調製
- 50 mLチューブに7.2 gの尿素を加え、10 mLの滅菌水に溶解する。サンプルをマイクロ波で20〜30秒間加熱し、室温(RT)にします。
- 3 mL の 5x トリス/ホウ酸塩/EDTA (TBE) バッファー (材料表)、2.25 mL の 40% (w/v) アクリルアミド/ビス (19:1)、75 μL の 10x 過硫酸アンモニウム、および 15 μL のテトラメチルエチレンジアミンを溶液に加えます。
- 直ちにゲル溶液をゲルカセットホルダーにゆっくりと注ぎ、気泡の形成を避ける。
- μTGGEユニットを使用した融解プロファイルの生成
- 図2に示すμTGGE装置の小型で経済的なバージョンを使用し、DNAマイグレーションの方向に対して垂直に設定された温度勾配(25〜65°C)を使用してください。
- 上下の電気泳動バッファーパッド (0.5 cm x 2.5 cm) を 2 mL の 1x TBE バッファーに浸します。
- 図2に示すように、ゲルカセットを水平電気泳動チャンバーユニットに配置し、それに応じて上下のバッファーパッドを配置します。
- 次に、10 μL の PCR 産物を中央 (長い) ウェルに、1 μL の PCR 産物を各サイドウェルにロードします。
- 1分間待機した後、電源ユニットを接続し、25~65°Cの直線温度勾配で100Vを12分間供給します。
- 走行が完了したら、カセットを取り出し、上部のガラスカバーを取り外します。
- 300 μL の 10x SYBR ゴールド染色剤をゲルに注ぎます。手のひらサイズの電気泳動装置に取り付けられた青色LED懐中電灯を使用して、溶融プロファイルを視覚化します。
メモ: ゲル画像のソフトファイルは、パターン類似度スコア(PaSS)計算のために保存する必要があります。 - 電気泳動実験3xごとに繰り返し、データの再現性を確認する。
4. パスSSの計算
メモ:計算はμTGGEアナライザソフトウェアを使用して実行されます。
- ソフトウェアをダウンロードして開きます。
- ゲル画像を含むJPEGファイルを開きます。ソフトウェアはJPEG形式のファイルのみを受け入れることに注意してください。
- [フレーム]ボタンをクリックし、ゲル画像の適切な領域(フレーム)を選択します。
- [ 座標補正] ボタンをクリックし、 図1Bに示すように、2つの参照点を追加します。
- [ フィーチャ ポイントの追加] ボタンをクリックし、 図 1B に示すようにサンプル ポイントを追加します。次に、処理したゲル画像データをμTGGE(*.tgg)形式で保存する。
- [ サンプル] ボタンをクリックし、[ 単純なポイントを検索] オプションを選択して、2つ以上の画像を比較します。
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Representative Results
μTGGEを使用してRNA編集イベントにおける一塩基塩基変化を同定
HEK293細胞で産生されたBFP遺伝子を含む4つの編集された遺伝子がこのプロトコル(アポリポタンパク質B mRNA編集酵素複合体のデアミナーゼ酵素によるC-to-U RNA編集;APOBEC115)、HEK293細胞で産生された黄土色終止コドン(TAA)を含むEGFP遺伝子(RNAに作用するアデノシンデアミナーゼによるA-to-I RNA編集による1;ADAR116)、およびA. thaliana 17、18におけるAT2G16586およびAT5G02670核遺伝子(U-to-C RNA編集を伴う)。編集済みサンプルと対応する非編集サンプルとの間の一塩基差異は、DNAシークエンシングによって確認した。次に、μTGGE分析を実施して、サンプルの融解曲線間の差を調べた(図3)。
C-to-U RNA編集タイプの場合、元のC塩基を有する非編集サンプルは、修飾U塩基を有する編集サンプルよりも鎖末端融点においてより長い融解パターンを示した(図3A)。A-to-I(G) RNA編集タイプの場合、修正I(G)ベースを持つ編集サンプルは、元のAベースを持つ非編集サンプルよりもストランド末端融点で長い融解パターンを示しました(図3B)。「逆の」U-to-C RNA編集タイプについて、2つの遺伝子を解析した。AT2G16586遺伝子について、改変C塩基を有する編集サンプルは、元のU塩基を有する非編集サンプルよりも、鎖初期融解と鎖末端融点との間のより長い融解パターンを示した(図3C)。しかしながら、他のAT5G02670遺伝子についても同様のパターンは観察されなかった(図3D)。それにもかかわらず、最終融点では、編集されていないタイプと編集されたタイプの間に明確な違いがありました。これは、溶融プロファイルを明確に観察することが、編集されていないタイプと編集されたタイプを区別するための重要なステップであることを示しています。
RNA編集イベントを表すμTGGE融解パターンの定量解析
次に、PaSS値11を算出し、上述した4つのRNA編集事象を表すμTGGE ベースの融解プロファイルの再現性を評価した。PaSS値は、2つの融解パターンをどの程度密接に重ね合わせることができるかの尺度を提供し、非常によく類似した融解パターンに対してより高い値(最大値:1)を生成する。したがって、編集されていないサンプルと編集されたサンプルを比較するためのPaSS値は、1未満であると予想されます。 図1Bに示すように、二本鎖DNAから一本鎖DNAへの構造遷移に対応する融解パターンの特徴点を用いて、PaSS値を算出した。実験変数を排除するために、2つの内部基準点を用いてコンピュータ支援正規化を実施した:試料の位置を二本鎖形態で表す基準点#1(左端のレーン)と、試料の位置を一本鎖形態で表す基準点#2(右端のレーン)。特徴点の座標は内部基準点の座標に正規化され、PaSS値の計算に使用された。各実験を3回繰り返し、その平均値を求めた。予想通り、編集された4つのサンプルのPaSS値は1つより低かった(図4)。C-to-UおよびA-to-I RNA編集タイプのPaSS値は、2つのU-to-C RNA編集タイプのPaSS値よりも低かった。この違いは、編集サイトのそれぞれの場所に関連している可能性があります。具体的には、C対UおよびA対I編集部位は、5'末端の比較的近く(それぞれ〜300bp断片の位置48および59)に位置し、一方、U対C編集部位は断片の中央付近(位置152および169)に位置していた。これらの知見は、断片の中心に位置する部位よりも、末端位置に位置する編集部位がμTGGEを用いてより容易に検出できることを示唆している。
RNA編集イベントを同定するためのTGGE融解パターンの最適化
我々のこれまでの結果は、PaSS値がRNA編集部位の特定の位置によって変動し得ることを示唆したように、我々は、C-to-U編集部位が5'末端に近く、3'末端末端に近い位置にあるBFP遺伝子(HEK293T細胞で発現)の300bp断片の融解パターンの違いを調べた。 または断片の中心にある(図5A)。μTGGE分析の前に、uMelt HETSウェブベースのツールを使用して、未編集断片および3つの編集断片の融解パターンを予測した。この分析は、C-to-U修飾が温度軸に沿って融解曲線を左にシフトさせると予想されることを示した(図5B)。非編集および3つの編集断片のμTGGE分析から計算されたPaSS値を、5'末端RNA編集<3'末端末端RNA編集<5'末端および3'末端末端RNA編集の中心に並べた(図5C)。特に、これらのPaSS値は、uMeltを使用して予測された結果と一致していた。これらの知見は、5'末端または3'末端に位置するヌクレオチド塩基の違いが、より中央に位置するヌクレオチド塩基の違いよりも、編集された遺伝子と編集されていない遺伝子のPaSS値の間に大きな変動をもたらすことを示している。さらに、これらの結果は、編集された遺伝子と編集されていない遺伝子の融解プロファイルの違いに関する事前知識が、RNA編集のために遺伝子断片を最適化するためのガイドとして使用できることを示唆している。
図1:μTGGEによるRNA編集の同定に用いられた手順 (A)RNA編集事象の種類を調べた。(B)編集済みおよび非編集された遺伝子の典型的な融解プロファイルの概略図。μTGGEでは、サンプルは温度勾配ゲルを通って移動し、特徴的な曲率を生成します。融解パターンの特徴点が割り当てられ、次に処理されてパターン類似度スコア(PaSS)値が計算されます。PaSSの計算は、式に示すように実行され、各特徴点のベクトル P は、その対応する位置にあり、温度および移動度の関数(すなわち、ベクトル P=P (T,m))。上付き文字(1)および(2)は、それぞれ編集された遺伝子および編集されていない遺伝子を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:手のひらサイズのゲル電気泳動装置のイラストと写真。 (a)ゲルカセットで3つの1の組み立て。(b)温度勾配プレートを備えたゲルカセットホルダーの説明図。写真は、上下のバッファーパッドの位置と、初期負荷後のサンプルの位置を示しています。(C)電源、水平ゲル電気泳動プラットフォーム、およびゲルイメージングシステムを含む完全なシステムの概要。このシステムは、迅速なオンサイトポリアクリルアミドゲル電気泳動ベースの分析のための実行可能なソリューションを提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RNA編集イベントにおける一塩基変化のTGGE解析 3つの異なるRNA編集タイプの融解プロファイルを、4つの遺伝子を用いて調べた。(a)HEK293T細胞で発現するBFPにおけるC-to-U RNA編集。(B)HEK293T細胞で発現したEGFPにおけるA-to-I(G)RNA編集。(c) A. thaliana由来のAT2G16586遺伝子におけるU-to-C RNA編集。(d) A. thaliana由来のAT5G02670遺伝子におけるU-to-C RNA編集。編集したサイトの場所は黄色 (赤いフォント) で強調表示され、プライマーの位置には下線が引かれます。編集済みサンプルと非編集サンプルの融解パターンの違いを赤丸で示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ここで調べた4つの編集済み遺伝子の平均PaSS値。エラーバーは、3回の反復の標準偏差を表す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)HEK293T細胞で発現したBFP遺伝子のC-to-U型RNA編集部位は、遺伝子断片の5'末端、3'末端、または中央にシフトしていた。(B)(A)に示す未編集および3つの編集断片の融解パターンの理論的予測。予測は uMelt を使用して実行しました。(c)(A)に示す編集済み遺伝子の平均PaSS値。エラーバーは、3回の反復の標準偏差を表す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| S.No | RNA 編集 | 源 | 立場 | 遺伝子 ID | フォワードプライマー | リバースプライマー | シーケンス長 | ||
| 1 | C-to-U | HEK293Tセル | 第48回 | ティッカー | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | AからI | HEK293Tセル | 第五十九 | ティッカー | AGGGCGATGC カクタッグカ |
CCGTCCTCCT ティッカー |
300 | ||
| 3 | U から C まで | シロイヌナズナ | 第百五十二回 | AT2G16586 | ググチャックト アクトクトガトガ |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U から C まで | シロイヌナズナ | 第百六十九回 | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG アトカグトカ |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
表1:現在のプロトコルで使用されている遺伝子のリスト
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Discussion
RNA編集は生物学において重要な役割を果たします。しかし、クロマトグラフィーやシーケンシングなどの現在の RNA 編集の検出方法は、コストが高く、時間要件が大きすぎ、複雑さが増すため、いくつかの課題があります。ここで説明するプロトコルは、ポータブルでマイクロサイズのTGGEベースのシステムを使用する、RNA編集を検出するためのシンプルで迅速で費用対効果の高い方法です。このシステムは、サンガーシーケンシングの前に編集された遺伝子と編集されていない遺伝子を区別するために使用することができる。具体的には、一塩基ヌクレオチド修飾を有する編集済みおよび非編集済み遺伝子を、TGGE融解プロファイルの変化に基づいて分化させることができる。ゲルに1を組み込むため、このシステムは非常に少量のサンプルを必要とし、配列間の相違を迅速に検出できます。さらに、ここで説明するプロトコルは、専門家とこの分野の新規参入者の両方にとって非常に簡単です。標的遺伝子断片の最適化は、編集された領域と編集されていない領域を明確に区別するために重要であり、このプロセスは現在のプロトコルでは簡素化されています。
このプロトコルは、蛍光タグ付きプライマーを用いたマルチプレックス分析と互換性があります。定量分析の場合、未知のRNAサンプル(編集済みまたは非編集済み)を緑色蛍光でタグ付けし、TGGE分析中に赤色蛍光タグ付き参照標準(編集済みまたは非編集済み)で共存させることができます。
μTGGE法が一塩基RNA編集事象を検出する能力を実証することに加えて、μTGGEを用いて得られた実験結果とuMELTを用いて得られた同じ遺伝子断片について得られた理論結果との間の類似性も検証した。さらに、遺伝子断片の5'末端と3'末端に位置するヌクレオチド塩基の違いは、断片の中心に位置するものよりもμTGGE融解プロファイルに大きな差(すなわち、より小さいPaSS値)をもたらすことを見出した。有望ではあるが、現在のプロトコルは、RNA編集中の特定のタイプのヌクレオチド修飾の分析および検出に限定され得る。RNA編集の他のタイプおよび/または場所を分析するためのこのプロトコルのさらなる最適化および開発は、今後の研究で実施される予定です。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金(17H02204, 18K19288)の助成を受けて行われました。ルチカは日本政府(文部科学省奨学金)の資金援助を受けていました。ラディカ・ビヤニ氏(JAIST高木研究室)とキルティ・シャルマ博士(バイオシーズ株式会社)に電気泳動関連の実験に協力していただき、誠にありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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