Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Пероральное комбинированное антиретровирусное лечение у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Этот протокол описывает новый метод доставки пероральных комбинированных антиретровирусных препаратов, которые успешно подавляют репликацию РНК ВИЧ-1 у гуманизированных мышей.

Abstract

Пандемия вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) продолжает распространяться во всем мире, и в настоящее время нет вакцины против ВИЧ. Хотя комбинированная антиретровирусная терапия (кАРТ) была успешной в подавлении репликации вируса, она не может полностью уничтожить резервуар у ВИЧ-инфицированных людей. Безопасная и эффективная стратегия лечения ВИЧ-инфекции потребует многосторонних методов, и поэтому достижения животных моделей инфекции ВИЧ-1 имеют решающее значение для развития исследований в области лечения ВИЧ. Гуманизированные мыши резюмируют ключевые особенности инфекции ВИЧ-1. Гуманизированная модель мыши может быть инфицирована ВИЧ-1, а репликация вируса может контролироваться с помощью схем cART. Кроме того, прерывание cART приводит к быстрому вирусному отскоку у гуманизированных мышей. Тем не менее, введение кАРТ животному может быть неэффективным, трудным или токсичным, и многие клинически значимые схемы кАРТ не могут быть оптимально использованы. Наряду с потенциальной небезопасностью для исследователей, введение кАРТ обычно используемой интенсивной ежедневной процедурой инъекций вызывает стресс из-за физического сдерживания животного. Новый пероральный метод cART для лечения ВИЧ-1-инфицированных гуманизированных мышей, описанный в этой статье, привел к подавлению вирусемии ниже уровня обнаружения, увеличению скорости восстановления CD4 + и улучшению общего состояния здоровья у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей.

Introduction

Ожидаемая продолжительность жизни лиц, инфицированных хроническим вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), значительно улучшилась при комбинированном антиретровирусном лечении (кАРТ)1,2. cART успешно снижает репликацию ВИЧ-1 и увеличивает количество CD4+ Т-клеток до нормального состояния у большинства ВИЧ-1 хронически инфицированных участников3, что приводит к улучшению общего состояния здоровья и резкому снижению прогрессирования заболевания4. Однако латентный резервуар ВИЧ-1 устанавливается даже тогда, когда АРТ инициируется во время острой инфекции 5,6,7. Резервуары сохраняются в течение многих лет во время АРТ, а быстрый вирусный отскок после прерывания АРТ хорошо документирован 8,9. Люди, живущие с ВИЧ на АРТ, также предрасположены к более высокому риску сопутствующих заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, рак и нервные расстройства 10,11,12. Поэтому необходимо функциональное лекарство от ВИЧ. Животные модели для инфекции ВИЧ-1 предлагают очевидные преимущества в разработке и проверке новых стратегий лечения ВИЧ 13,14,15. Гуманизированные мыши, как модель на небольших животных, могут обеспечить многолинейное восстановление иммунных клеток человека в различных тканях, что позволяет проводить тщательное изучение ВИЧ-инфекции 16,17,18,19. Среди гуманизированных моделей гуманизированная модель костного мозга-печени-тимуса (BLT) успешно рекапитулирует хроническую инфекцию ВИЧ-1, а также функциональные иммунные реакции человека на инфекцию ВИЧ-1 20,21,22,23,24. Поэтому гуманизированная модель мыши BLT широко используется для изучения различных аспектов в области исследований ВИЧ. Гуманизированные мыши BLT являются не только хорошо зарекомендовавшими себя моделями для рекапитуляции персистирующей инфекции ВИЧ-1 и патогенеза, но и последовательными инструментами для оценки стратегий вмешательства на основе клеточной терапии. Нынешние авторы и другие продемонстрировали, что гуманизированная модель мышей BLT рекапитулирует персистирующую инфекцию ВИЧ-1 и патогенез 25,26,27 и предоставляет инструменты для оценки стратегий вмешательства на основе клеточной терапии 28,29,30,31,32,33.

Схемы cART, состоящие из комбинаций антиретровирусных препаратов, которые ежедневно принимаются, подавляют репликацию ВИЧ-1 до такой степени, что вирусная нагрузка у успешно пролеченных лиц остается неопределяемой в течение длительноговремени 34. Результаты лечения ВИЧ-инфицированных гуманизированных мышей клинически значимыми схемами кАРТ аналогичны тем, которые наблюдались у ВИЧ-1 инфицированных АРТ лиц22: уровни ВИЧ-1 подавляются ниже пределов обнаружения, а прерывание кАРТ приводит к отскоку репликации ВИЧ из латентного резервуара35. Подкожная (SC)27,36,37 или внутрибрюшинная (IP)37,38,39 инъекция является маршрутом, обычно используемым для лечения кАРТ у гуманизированных мышей. Однако интенсивная ежедневная инъекция вызывает стресс у животных при физическом сдерживании40. Это также трудоемко и потенциально небезопасно для исследователей из-за повышенного воздействия ВИЧ при использовании острых предметов. Пероральное введение идеально подходит для имитации абсорбции, распределения и выведения препаратов кАРТ, которые принимаются ВИЧ-1-инфицированными людьми. Пероральное введение обычно включает в себя индивидуальные и часто трудоемкие процедуры для введения антиретровирусных препаратов в стерилизованную (необходимую из-за иммунодефицита мышей) пищу 24,37,41 или воду 42,43,44,45,46 , которые могут быть или не быть химически совместимыми со многими антиретровирусными препаратами или приводить к чему-то, что мыши не будут легко есть или пить (что повлияет на дозу и уровень лекарств в организме). Новый метод перорального введения кАРТ, предложенный здесь, превосходит предыдущие попытки доставки из-за его совместимости с различными типами антиретровирусных препаратов, безопасности и простоты приготовления и введения, а также снижения стресса и беспокойства животных в результате ежедневной инъекции.

Тенофовир дизопроксил фумарат (TDF), Элвитегравир (ELV) и Ралтегравир (RAL) являются плохо водорастворимыми препаратами. Интересно, что повышенная биодоступность TDF наблюдается с жирной пищей, предполагая, что конкурентное ингибирование липаз жирной пищей может обеспечить определенную защиту TDF47. Поэтому чашки DietGel Boost были выбраны для замены обычного чау-чау для грызунов в качестве метода доставки, основанного на их скромном содержании жира (20,3 г на 100 г) по сравнению с обычным чау-чау грызунов (10 г на 100 г) и типичной диетой с высоким содержанием жиров у мышей (40-60 г на 100 г)48. Общий вес одной чашки составляет 75 г; таким образом, каждая чашка будет содержать количество пищи, а значит и лекарство, достаточное для пяти мышей в течение 3 дней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Анонимная ткань человеческого плода была приобретена коммерчески. Исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, одобренными Калифорнийским университетом в Лос-Анджелесе и Комитетом по исследованиям животных (ARC) (UCLA) в соответствии со всеми федеральными, государственными и местными руководящими принципами. В частности, все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями и руководящими принципами по содержанию и уходу за лабораторными животными Национальных институтов здравоохранения (NIH) и Международной ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AALAC) в соответствии с Протоколом UCLA ARC No 2010-038-02B. Все операции проводились под кетамином (100 мг/кг)/ксилазином (5 мг/кг) и изофлурановой анестезией (2-3 об.), и были предприняты все усилия для минимизации боли и дискомфорта животных.

1. Гуманизированные мыши, инфицированные ВИЧ-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Гуманизированные мыши были построены, как описано ранее в 30,31,49. Протокол кратко описан ниже.

  1. Очищайте CD34+ кроветворные клетки-предшественники из печени плода человека с помощью микрошариков против CD34 в соответствии с протоколом производителя.
  2. Обезболивать 6-8-недельных мышей NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) самцов и самок и сублетально облучать (2,7 Гр) перед операцией.
  3. Имплантируйте тимус, полученный от того же донора, что и печень плода, под почечную капсулу вместе с печенью.
  4. После имплантации вводите мышам от 0,5 до одного миллиона клеток CD34+ внутривенно.
  5. Через 8-10 недель собирают 100 мкл мышиной крови с помощью ретроорбитального кровотечения50 в микроцентрифужные трубки, содержащие 5 мкл ЭДТА и центрифугу при 350 х г в течение 3 мин.
  6. Храните плазму при -80 °C для мониторинга вирусной нагрузки после того, как мышь была инфицирована ВИЧ-1. Добавьте 2 мл 83% раствора NH4C и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре для лизирования эритроцитов.
  7. Добавьте 10 мл RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), чтобы остановить лизис. Открутите при 300 х г в течение 5 мин.
  8. Аспират супернатант. Окрашивание клеток панелью антител (см. Таблицу материалов) и анализ с помощью проточной цитометрии для проверки приживления иммунных клеток человека.
  9. Инфицировать мышей, демонстрирующих более 50% циркулирующих клеток CD45+, путем ретроорбитальной инъекции в вену 51,52 с не менее 200 нг р24 штамма ВИЧ-1 (т.е. NFNSXSL9 30,53,54) с помощью инсулинового шприца. Собирать кровь раз в две недели для анализа проточной цитометрии и измерения вирусной нагрузки.

2. Приготовление препаратов АРТ

  1. Взвешивание отдельных препаратов; Например, чтобы сделать 10 пищевых стаканчиков с cART, используйте стерильные клеточные скребки для взвешивания 250 мг FTC (Эмтрицитабина), 375 мг TDF и 500 мг RAL или ELV в отдельные стерильные центрифужные трубки 15 мл в шкафу биобезопасности.
  2. Добавьте 1 мл ДМСО в пробирку FTC 250 мг (конечная концентрация 250 мг/мл), добавьте 1,5 мл ДМСО в пробирку 375 мг TDF (конечная концентрация 250 мг/мл) и добавьте 1 мл ДМСО в 500 мг RAL или ELV трубку (конечная концентрация 500 мг/мл). Перемешайте или пипетируйте смесь препарата до полного растворения и получения прозрачного раствора.
  3. Используйте гидрофильный мембранный фильтр PVDF размером пор 0,22 мкМ для стерилизации растворов стерильным шприцем. Отдельные растворы препарата можно хранить при -20 °С в течение 12 недель.
  4. Когда готовы к применению, только что разморозьте по одной аликвоте каждого раствора препарата при 37 °C до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Хорошо перемешать с помощью пипетки.
  5. Комбинируйте препараты и хорошо смешивайте, чтобы составить мастер-микс: 1 мл FTC в DMSO, 1,5 мл TDF в DMSO и 1 мл ELV или RAL в DMSO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество составит 10 пищевых чашек.
  6. Добавьте 350 мкл раствора cART master mix в одну чашку, чтобы сделать одну чашку DietGel Boost cART.
  7. Добавьте в чашку 0,75 мл триметоприма-сульфаметоксазола (конечная концентрация 0,48 мг/мл).
  8. Тщательно перемешайте, используя 1 мл стерильных наконечников пипетки.
  9. Aliquot чашка с пищей, содержащая cART из оригинальной чашки с микропатком на чашку Петри 60 мм по мере необходимости. Взвесьте пищу на весах, чтобы рассчитать количество чашки с пищей, содержащей cART для каждой клетки, в соответствии с количеством мышей.

3. Назначение препаратов АРТ ВИЧ-1 инфицированным мышам

  1. Выньте обычный чау из клетки и замените его чашкой с пищей, содержащей cART.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем мышь съедает до 5 г пищи в день. Примерно одну чашку с пищей можно вводить пяти мышам в течение 2 дней.
  2. Обновляйте пищу cART три раза в неделю.
  3. Взвешивайте использованные чашки для контроля потребления. Взвешивайте мышей еженедельно, чтобы подтвердить потребление.

4. Мониторинг вирусной нагрузки с помощью ПЦР в режиме реального времени

  1. Оценка иммунных клеток человека (уровни CD4 и CD8 Т-клеток) и репликации ВИЧ-1 у мышей BLT каждые 2 недели путем ретроорбитального кровотечения. Соберите плазму, следуя инструкциям на шагах 1.5-1.8.
  2. Мониторинг вирусной нагрузки плазмы мышей, инфицированных ВИЧ-1 до и во время перорального приема кАРТ в течение 8 недель. Извлеките вирусную РНК плазмы из плазмы с помощью набора для экстракции вирусной РНК и количественно оцените ее с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров и зондов (см. Таблицу материалов), как описано ранее 27,30,31. Используйте следующий протокол цикла: 48 °C (15 мин), 95 °C (10 мин), затем 95 °C (15 с), 60 °C (1 мин) в течение 45 циклов.

5. Оценка соотношения CD4/CD8 с помощью проточной цитометрии

  1. Готовят одноклеточные суспензии из периферической крови двухнедельных кровотечений, следуя шагам 1,5-1,8.
  2. Окрашивание клеток поверхностными маркерами и анализ методом проточной цитометрии. Используют следующие поверхностные маркерные антитела 27,30,43,49 в проточной цитометрии: CD45 (клон HI30), CD8 (клон SK1), CD3 (клон OKT3), CD4 (клон RPA-T4)27,30,42,49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Предполагая, что средняя мышь с весом 25 г потребляет 4 г пищи в день, суточная доза препарата при пероральном приеме соответствует 2,88 мг / кг TFV, 83 мг / кг FTC и 768 мг / кг RAL. Чтобы проверить, является ли оптимизированный режим питания токсичным и влияет ли на общее состояние здоровья по сравнению с ежедневной инъекцией кАРТ, вес мышей контролировали еженедельно до и во время кАРТ с помощью пероральной или подкожной инъекции. Не было существенных различий в весе до введения cART в каждой группе (рисунок 1). Тем не менее, вес мышей постоянно снижался во время ежедневной инъекции cART SC. Напротив, FTC / TDF / ELV или FTC / TDF / RAL в DietGel восстанавливали вес мышей до уровней до начала АРТ после 5 недель перорального приема кАРТ. Кроме того, не наблюдалось значительных изменений веса между группами Ралтегравира или Элвитегравира.

Чтобы проверить, подавляет ли пероральный прием кАРТ вирусную нагрузку так же эффективно, как ежедневная инъекция, двухнедельную вирусную нагрузку плазмы оценивали с помощью ОТ-ПЦР. На рисунке 2 показано, что режим питания FTC/TDF/ELV ART на 100% эффективно подавлял репликацию вируса до неопределяемых уровней в течение 4 недель; Режим питания FTC / TDF / RAL ART может подавлять 80% мышей до неопределяемых уровней в течение 4 недель, тогда как только 70% мышей, получавших инъекцию SC, достигли неопределяемых уровней после 4 недель лечения. Результаты показали, что пероральное введение подавляет репликацию вируса быстрее и эффективнее, чем инъекция SC. Кроме того, режим питания кАРТ предотвращал дальнейшее снижение соотношения CD4/CD8 в периферической крови раньше, чем суточная инъекция SC (рисунок 3). Эти результаты показали, что предлагаемый пероральный режим кАРТ может успешно подавлять вирусемию плазмы ниже уровня обнаружения, быстро восстанавливать уровни CD4 Т-клеток и улучшать общее состояние здоровья животных у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей.

Figure 1
Рисунок 1: Изменения массы тела мыши до и во время лечения кАРТ после заражения ВИЧ-1 в разных группах. Гуманизированные мыши были инфицированы ВИЧNFNSXSL9 после восстановления иммунитета. После 4 недель инфекции ВИЧ-1 мышей либо лечили в течение еще 7,5 недель режимом FTC/TDF/RAL через подкожную (SC) инъекцию, либо пероральным введением FTC/TDF/RAL или FTC/TDF/ELV. Массу тела мышей измеряли, начиная с 1 недели до ВИЧ-инфекции. Все статистические сравнения проводились с использованием теста Манна-Уитни, представляющего собой среднее значение группы (± S.E.). Зеленые звездочки показывают статистические различия между ftC / TDF / ELV пищевой пероральной группой и группой инъекций FTC / TDF / RAL SC. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Пероральное введение кАРТ с пищей показывает более быстрое подавление вируса. Как описано на рисунке 1, мышей либо не лечили, либо лечили режимом FTC/TDF/RAL через подкожную инъекцию и пероральное введение макета пищевой чашки, FTC/TDF/RAL или FTC/TDF/ELV в течение еще 7,5 недель. (A) Вирусная нагрузка плазмы с течением времени после заражения ВИЧ-1 в различных группах. (B) Сводка вирусной нагрузки с течением времени после инфицирования ВИЧ-1 в различных группах с указанием среднего геометрического значения группы с 95% доверительным интервалом (ДИ). Черные стрелки указывают время инициализации cART для групп, обработанных cART. (C) Анализ выживаемости времени после лечения кАРТ до неопределяемой вирусной нагрузки для каждой группы. n= 6-7 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Пероральные препараты для приготовления пищи в ВРТ показывают более быстрое восстановление соотношения CD4/CD8. Соотношение CD4/CD8 в периферической крови с течением времени после заражения ВИЧ-1 для каждой группы. Все статистические сравнения проводились с использованием теста Манна-Уитни, представляющего собой среднее групповое значение (± S.E.). Красные звездочки показывают статистические различия между группой ftC / TDF / RAL пищевой пероральной группы и группой инъекций FTC / TDF / RAL SC. *P < 0,05. n=6-7 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь разработан метод перорального введения кАРТ для ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей путем объединения трех антиретровирусных препаратов в пище с высоким содержанием питательных веществ. По сравнению с введением ежедневными инъекциями, пероральные роды проще в использовании, ограничивают частоту введения, уменьшают обращение с животными, минимизируют стресс и повышают безопасность55. До этого момента только в нескольких исследованиях на гуманизированных мышах 24,37,41 использовались пищевые гранулы, содержащие измельченные препараты АРТ для лечения мышей. Однако этот метод сложно применять широко из-за ограниченного доступа к производству специальных пищевых гранул. В других исследованиях 42,43,44,45,46 использовалась питьевая вода в качестве системы доставки кАРТ. Однако добавление лекарства в питьевую воду может изменить стабильность, чистоту или даже эффективность активных ингредиентов. Кроме того, многие антиретровирусные препараты, включая TDF, RAL и ELV, плохо растворимы в воде. Исследования показали, что пероральная биодоступность TDF была увеличена на 40% после высокожирной пищи56, предполагая, что конкурентное ингибирование липаз пищей может обеспечить определенную защиту для TDF57. DietGel Boost - это пищевая добавка, которая обеспечивает гидратацию, питание и обогащение продуктов, которые улучшают общее благосостояние исследовательских животных58. Обогащенный питательными веществами гель состоит из 25%-30% чистой воды с добавлением углеводов, белков, жиров, минералов и электролитов и сертифицирован без фитоэстрогенов и нитрозаминов58. Он обеспечивает экономичную, эффективную и трудоэффективную альтернативу пюре диетам58. Поскольку 20,3% общего жира было включено в чашку Boost, мы предполагаем, что высокие уровни питательных веществ могут лучше растворять TDF и, следовательно, увеличивать его пероральную биодоступность. Таким образом, пищевая суспензия с высоким содержанием питательных веществ была использована для доставки препаратов cART, чтобы имитировать пероральную доставку препаратов cART, которые в настоящее время используют ВИЧ-инфицированные люди.

Мыши имеют более высокий метаболизм, чем люди, и, таким образом, доза различных соединений была преобразована и использована формулой, как описано в ссылке59. Человеческие дозы 0,4 мг (общая доза) RAL, 0,1 мг (общая доза) FTC и 2,14 мг (общая доза) TDF были преобразованы на основе поправочного коэффициента (Km, оцененного путем деления средней массы тела (кг) вида на площадь поверхности его тела (м2)) для оценки значений эквивалентной дозы мыши 37 (Km) и 3 (Km) для людей и мышей59, соответственно. Учитывая относительно низкую растворимость TDF, RAL и ELV в воде, DMSO использовался здесь в качестве растворителя для препаратов cART. Конечная концентрация ДМСО, содержащегося в пероральном приеме кАРТ пищи, составляет 0,0059% (v/v). Концентрация ДМСО очень низкая и относительно безопасная в качестве лекарственного растворителя 60,61,62,63. Важно отметить, что в этих исследованиях не наблюдалось потери меха или каких-либо изменений поведения у мышей.

Процедура, описанная выше, является очень надежным и повторяемым методом доставки cART для лечения ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей. Этому протоколу можно легко следовать. Критическими шагами в протоколе являются: 1) поддержание стерильности всего процесса любого материала, участвующего в протоколе, связанного с пищей DietGel, учитывающей иммунодефицит гуманизированных мышей, и 2) предотвращение многократного оттаивания / замораживания растворов запасов cART и аликвотных препаратов cART соответственно в соответствии с номерами и группами мышей. Данные свидетельствуют о том, что пероральное введение трех препаратов cART (TDF, FTC и RAL или ELV), предварительно смешанное в чашке с пищей, эффективно подавляет репликацию ВИЧ-1 и снижает вирусную нагрузку в плазме до неопределяемых уровней в течение 4 недель лечения. Пероральное введение кАРТ с пищей не только предотвратило дальнейшее снижение CD4 Т-клеток, но и привело к увеличению процента CD4 Т-клеток в периферической крови. Кроме того, пероральный метод введения cART восстанавливал вес мыши быстрее, чем ежедневная инъекция, и улучшал общее состояние здоровья.

Важно отметить, что этот метод устранил риск воздействия на исследователя острых предметов во время ежедневной инъекции препаратов кАРТ ВИЧ-1 инфицированным гуманизированным мышам. Предлагаемый метод, который успешно подавляет репликацию РНК ВИЧ-1 у гуманизированных мышей, будет очень ценным для доклинических исследований по доказательству концепции разработки новых методов лечения, которые близко имитируют доставку лекарств у хронических ВИЧ-1 инфицированных лиц, получавших кАРТ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SK является основателем CDR3 Inc. Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить докторов Ромаса Гелезиунаса и Джеффа Марри, а также сотрудников Gilead за предоставление антиретровирусных препаратов, используемых в этом исследовании. Эта работа финансировалась NCI 1R01CA239261-01 (для кухни), грантами NIH P30AI28697 (ядро вирусологии UCLA CFAR, ядро генной и клеточной терапии и гуманизированное ядро мыши), U19AI149504 (PI: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (для Zhen), NIAID R2120200174 (PI: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Эта работа также была поддержана Институтом СПИДа UCLA, Благотворительным фондом Джеймса Б. Пендлтона и Фондом семьи Маккарти.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 188
Пероральное комбинированное антиретровирусное лечение у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A.,… More

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter