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Immunology and Infection

Trattamento antiretrovirale combinato orale in topi umanizzati infetti da HIV-1

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per somministrare farmaci antiretrovirali combinati orali che sopprimono con successo la replicazione dell'RNA dell'HIV-1 nei topi umanizzati.

Abstract

La pandemia del virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1) continua a diffondersi senza sosta in tutto il mondo e attualmente non esiste un vaccino disponibile contro l'HIV. Sebbene la terapia antiretrovirale combinata (cART) abbia avuto successo nel sopprimere la replicazione virale, non può sradicare completamente il serbatoio da individui con infezione da HIV. Una strategia di cura sicura ed efficace per l'infezione da HIV richiederà metodi su più fronti, e quindi i progressi dei modelli animali per l'infezione da HIV-1 sono fondamentali per lo sviluppo della ricerca sulla cura dell'HIV. I topi umanizzati ricapitolano le caratteristiche chiave dell'infezione da HIV-1. Il modello murino umanizzato può essere infettato da HIV-1 e la replicazione virale può essere controllata con regimi cART. Inoltre, l'interruzione della cART provoca un rapido rimbalzo virale nei topi umanizzati. Tuttavia, la somministrazione di cART all'animale può essere inefficace, difficile o tossica e molti regimi di cART clinicamente rilevanti non possono essere utilizzati in modo ottimale. Oltre ad essere potenzialmente pericoloso per i ricercatori, la somministrazione di cART mediante una procedura di iniezione giornaliera intensiva comunemente usata induce stress da contenzione fisica dell'animale. Il nuovo metodo orale cART per il trattamento di topi umanizzati infetti da HIV-1 descritto in questo articolo ha portato alla soppressione della viremia al di sotto del livello di rilevamento, all'aumento del tasso di ripristino di CD4 + e al miglioramento della salute generale nei topi umanizzati infetti da HIV-1.

Introduction

L'aspettativa di vita degli individui con infezione da virus dell'immunodeficienza umana cronica (HIV) è significativamente migliorata con il trattamento antiretrovirale combinato (cART)1,2. cART riduce con successo la replicazione dell'HIV-1 e aumenta la conta delle cellule T CD4+ alla normalità nella maggior parte dei partecipanti con infezione cronica da HIV-13, con conseguente miglioramento della salute generale e drastica riduzione della progressione della malattia4. Tuttavia, il serbatoio latente di HIV-1 si stabilisce anche quando l'ART viene iniziata durante l'infezione acuta 5,6,7. I serbatoi persistono negli anni durante l'ART e il rapido rimbalzo virale dopo l'interruzione dell'ART è ben documentato 8,9. Le persone che vivono con l'HIV in ART sono anche predisposte a un rischio più elevato di comorbidità come malattie cardiovascolari, cancro e disturbi neurologici10,11,12. Pertanto, è necessaria una cura funzionale per l'HIV. I modelli animali per l'infezione da HIV-1 offrono evidenti vantaggi nello sviluppo e nella convalida di nuove strategie di cura dell'HIV13,14,15. I topi umanizzati, come un piccolo modello animale, possono fornire la ricostituzione multilineare delle cellule immunitarie umane in diversi tessuti, che consente lo studio ravvicinato dell'infezione da HIV16,17,18,19. Tra i modelli umanizzati, il modello umanizzato midollo osseo-fegato-timo (BLT) ricapitola con successo l'infezione cronica da HIV-1 e le risposte immunitarie umane funzionali all'infezione da HIV-1 20,21,22,23,24. Pertanto, il modello murino BLT umanizzato è stato ampiamente utilizzato per indagare vari aspetti nel campo della ricerca sull'HIV. I topi BLT umanizzati non sono solo modelli consolidati per la ricapitolazione dell'infezione persistente da HIV-1 e della patogenesi, ma anche strumenti consequenziali per la valutazione delle strategie di intervento basate sulla terapia cellulare. Gli autori attuali e altri hanno dimostrato che il modello umanizzato di topi BLT ricapitola l'infezione persistente da HIV-1 e la patogenesi 25,26,27 e fornisce strumenti per valutare le strategie di intervento basate sulla terapia cellulare 28,29,30,31,32,33.

I regimi di cART costituiti da combinazioni di farmaci antiretrovirali assunti quotidianamente sopprimono la replicazione dell'HIV-1 al punto che la carica virale negli individui trattati con successo rimane non rilevabile a lungo termine34. I risultati del trattamento di topi umanizzati con infezione da HIV con regimi di cART clinicamente rilevanti assomigliano a quelli osservati negli individui trattati con ART infetti da HIV-122: i livelli di HIV-1 sono soppressi al di sotto dei limiti di rilevazione e l'interruzione di cART provoca un rimbalzo della replicazione dell'HIV dal serbatoio latente35. L'iniezione sottocutanea (SC)27,36,37 o intraperitoneale (IP)37,38,39 è la via comunemente usata per il trattamento cART nei topi umanizzati. Tuttavia, l'iniezione giornaliera intensiva induce stress agli animali per contenzione fisica40. È anche laborioso e potenzialmente pericoloso per i ricercatori a causa della maggiore esposizione all'HIV durante l'utilizzo di oggetti taglienti. La somministrazione orale è ideale per imitare l'assorbimento, la distribuzione e l'escrezione dei farmaci cART assunti da individui con infezione da HIV-1. La somministrazione orale comporta tipicamente procedure personalizzate e spesso laboriose per mettere i farmaci antiretrovirali in alimenti sterilizzati (necessari a causa dell'immunodeficienza dei topi) 24,37,41 o acqua 42,43,44,45,46 , che può o non può essere chimicamente compatibile con molti farmaci antiretrovirali, o provocare qualcosa che i topi non mangerebbero o berrebbero prontamente (il che influenzerebbe i livelli di dose e farmaco nel corpo). Il nuovo metodo di somministrazione perorale di cART qui proposto supera i precedenti tentativi di somministrazione grazie alla sua compatibilità con diversi tipi di farmaci antiretrovirali, alla sicurezza e alla facilità di preparazione e somministrazione e alla riduzione dello stress e dell'ansia degli animali derivanti dall'iniezione giornaliera.

Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) e Raltegravir (RAL) sono farmaci scarsamente solubili in acqua. È interessante notare che si osserva una maggiore biodisponibilità di TDF con cibi grassi, suggerendo che l'inibizione competitiva delle lipasi da parte del cibo grasso può fornire una certa protezione per TDF47. Pertanto, le coppette DietGel Boost sono state selezionate per sostituire il normale chow di roditori come metodo di consegna basato sul loro modesto contenuto di grassi (20,3 g per 100 g) rispetto al normale roditore (10 g per 100 g) e una tipica dieta ricca di grassi per topi (40-60 g per 100 g)48. Il peso totale di una tazza è di 75 g; Pertanto, ogni tazza conterrà la quantità di cibo, e quindi di droga, sufficiente per cinque topi in 3 giorni.

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Protocol

Il tessuto fetale umano anonimizzato è stato acquisito commercialmente. La ricerca sugli animali è stata condotta secondo i protocolli approvati dall'Università della California, Los Angeles, e (UCLA) Animal Research Committee (ARC) in conformità con tutte le linee guida federali, statali e locali. In particolare, tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni e le linee guida per l'alloggio e la cura degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH) e dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AALAC) International ai sensi del numero di protocollo ARC UCLA 2010-038-02B. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti con ketamina (100 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) e anestesia isoflurana (2-3 vol%) e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il dolore e il disagio degli animali.

1. Topi umanizzati infettati da HIV-1

NOTA: I topi umanizzati sono stati costruiti come precedentemente descritto in30,31,49. Il protocollo è brevemente descritto di seguito.

  1. Purificare le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ dal fegato fetale umano tramite microsfere anti-CD34 secondo il protocollo del produttore.
  2. Anestetizzare topi maschi e femmine di 6-8 settimane NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) e irradiare sub-letalmente (2,7 Gy) prima dell'intervento.
  3. Impianto di timo, derivato dallo stesso donatore del fegato fetale, sotto la capsula renale insieme al fegato.
  4. Dopo l'impianto, iniettare topi con 0,5 milioni a un milione di cellule CD34+, per via endovenosa.
  5. Dopo 8-10 settimane, raccogliere 100 μL di sangue di topo tramite sanguinamento retroorbitale50 in provette da microcentrifuga contenenti 5 μL di EDTA e centrifugare a 350 x g per 3 minuti.
  6. Conservare il plasma a -80 °C per monitorare la carica virale dopo che il topo è stato infettato da HIV-1. Aggiungere 2 ml di soluzione di NH4C all'83% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi.
  7. Aggiungere 10 ml di RPMI con siero bovino fetale al 10% (FBS) per fermare la lisi. Girare a 300 x g per 5 min.
  8. Aspirare il surnatante. Colorare le cellule con pannello anticorpale (vedi Tabella dei materiali) e analizzarle mediante citometria a flusso per controllare l'attecchimento delle cellule immunitarie umane.
  9. Infettare topi che presentano più del 50% di cellule CD45+ circolanti mediante iniezione venosa retroorbitaria51,52 con almeno 200 ng di p24 di un ceppo HIV-1 (cioè NFNSXSL9 30,53,54) usando una siringa da insulina. Raccogliere il sangue bisettimanalmente per l'analisi della citometria a flusso e per misurare la carica virale.

2. Preparazione di farmaci ART

  1. Pesare i singoli farmaci; ad esempio, per realizzare 10 bicchieri alimentari con cART, utilizzare raschietti cellulari sterili per pesare 250 mg di FTC (Emtricitabina), 375 mg di TDF e 500 mg di RAL o ELV in singole provette sterili da centrifuga da 15 ml in un armadio di biosicurezza.
  2. Aggiungere 1 mL di DMSO in un tubo FTC da 250 mg (concentrazione finale di 250 mg/ml), aggiungere 1,5 mL di DMSO in un tubo TDF da 375 mg (concentrazione finale di 250 mg/ml) e aggiungere 1mL di DMSO in un tubo RAL o ELV da 500 mg (concentrazione finale di 500 mg/ml). Mescolare o pipetare la miscela di droga fino a completa dissoluzione e si ottiene una soluzione chiara.
  3. Utilizzare un filtro a membrana idrofilo PVDF da 0,22 μM per sterilizzare le soluzioni con una siringa sterile. Le singole soluzioni farmacologiche possono essere conservate a -20 °C per 12 settimane.
  4. Quando è pronto per l'uso, scongelare appena un'aliquota di ciascuna soluzione di farmaco a 37 °C fino a quando la soluzione diventa limpida. Mescolare bene usando un pipet.
  5. Combinare i farmaci e mescolare bene per formare il master mix: 1 mL di FTC in DMSO, 1,5 mL di TDF in DMSO e 1 mL di ELV o RAL in DMSO.
    NOTA: Questa quantità farà 10 tazze di cibo.
  6. Aggiungere 350 μL di soluzione master mix cART in una tazza per creare una tazza DietGel Boost cART.
  7. Aggiungere 0,75 mL di Trimetoprim-Sulfametossazolo (0,48 mg/mL concentrazione finale) nella tazza.
  8. Mescolare accuratamente con 1 mL di punte sterili per pipette.
  9. Aliquotare la tazza contenente cART dalla tazza originale con una micro spatola su una piastra di Petri da 60 mm secondo necessità. Pesare il cibo su una bilancia per calcolare la quantità di tazza di cibo contenente cART per ogni gabbia in base al numero di topi.

3. Somministrazione di farmaci ART a topi infetti da HIV-1

  1. Rimuovere il chow normale dalla gabbia e sostituirlo con una tazza di cibo contenente cART.
    NOTA: In media, un topo mangerà fino a 5 g di cibo al giorno. Circa una tazza di cibo può essere somministrata a cinque topi per 2 giorni.
  2. Rinfrescare il cibo cART tre volte a settimana.
  3. Pesare le tazze usate per monitorare l'assunzione. Pesare i topi settimanalmente per confermare il consumo.

4. Monitorare la carica virale mediante PCR in tempo reale

  1. Valutare le cellule immunitarie umane (livelli di cellule T CD4 e CD8) e la replicazione dell'HIV-1 nei topi BLT ogni 2 settimane mediante sanguinamento retroorbitale. Raccogliere il plasma seguendo le istruzioni nei passaggi 1.5-1.8.
  2. Monitorare le cariche virali plasmatiche di topi infettati da HIV-1 prima e durante la somministrazione orale di cART per 8 settimane. Estrarre l'RNA virale plasmatico dal plasma utilizzando un kit di estrazione dell'RNA virale e quantificarlo mediante PCR in tempo reale utilizzando i primer e le sonde (vedi Tabella dei materiali) come precedentemente descritto 27,30,31. Utilizzare il seguente protocollo di ciclismo: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), quindi ciclismo 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) per 45 cicli.

5. Valutare i rapporti CD4/CD8 mediante citometria a flusso

  1. Preparare sospensioni monocellulari da sangue periferico di sanguinamenti bisettimanali seguendo i passaggi 1.5-1.8.
  2. Colorare le cellule con marcatori superficiali e analizzare mediante citometria a flusso. Utilizzare i seguenti anticorpi marcatori di superficie 27,30,43,49 nella citometria a flusso: CD45 (clone HI30), CD8 (clone SK1), CD3 (clone OKT3), CD4 (clone RPA-T4)27,30,42,49.

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Representative Results

Supponendo che un topo medio del peso di 25 g consumi 4 g di cibo al giorno, la dose giornaliera di farmaco attraverso l'assunzione orale corrisponde a 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC e 768 mg/kg RAL. Per verificare se il regime alimentare ottimizzato è tossico e influenza la salute generale rispetto all'iniezione giornaliera di cART, il peso dei topi è stato monitorato settimanalmente prima e durante la cART attraverso l'iniezione orale o sottocutanea. Non ci sono state differenze di peso significative prima della somministrazione di cART in ciascun gruppo (Figura 1). Tuttavia, il peso del topo diminuiva continuamente durante l'iniezione giornaliera di cART SC. Al contrario, FTC/TDF/ELV o FTC/TDF/RAL in DietGel ha ripristinato il peso del topo ai livelli pre-inizio dell'ART dopo 5 settimane di somministrazione orale di cART. Inoltre, non sono state osservate variazioni significative di peso tra i gruppi Raltegravir o Elvitegravir.

Per verificare se la somministrazione orale di cART sopprime la carica virale con la stessa efficacia di un'iniezione giornaliera, sono state valutate le cariche virali plasmatiche bisettimanali utilizzando la RT-PCR. La figura 2 mostra che il regime alimentare FTC/TDF/ELV ART ha soppresso efficacemente al 100% la replicazione virale a livelli non rilevabili entro 4 settimane; Il regime alimentare FTC / TDF / RAL ART può sopprimere l'80% dei topi a livelli non rilevabili entro 4 settimane, mentre solo il 70% dei topi che hanno ricevuto l'iniezione SC ha raggiunto livelli non rilevabili dopo 4 settimane di trattamento. I risultati hanno dimostrato che la somministrazione orale sopprime la replicazione virale più velocemente e in modo più efficiente rispetto all'iniezione SC. Inoltre, il regime alimentare cART ha impedito l'ulteriore declino dei rapporti CD4/CD8 nel sangue periferico prima dell'iniezione giornaliera SC (Figura 3). Questi risultati hanno suggerito che il regime cART orale proposto può sopprimere con successo la viremia plasmatica al di sotto del livello di rilevamento, ripristinare rapidamente i livelli delle cellule T CD4 e migliorare la salute generale degli animali nei topi umanizzati infetti da HIV-1.

Figure 1
Figura 1: Variazioni del peso corporeo del topo prima e durante il trattamento con cART dopo l'infezione da HIV-1 in diversi gruppi. I topi umanizzati sono stati infettati con HIVNFNSXSL9 dopo ricostituzione immunitaria. Dopo 4 settimane di infezione da HIV-1, i topi sono stati trattati per altre 7,5 settimane con regime FTC / TDF / RAL tramite iniezione sottocutanea (SC) o mediante somministrazione orale di FTC / TDF / RAL o FTC / TDF / ELV. Il peso corporeo del topo è stato misurato a partire da 1 settimana prima dell'infezione da HIV. Tutti i confronti statistici sono stati condotti utilizzando il test di Mann-Whitney, media del gruppo di segnalazione (± S.E.). Le stelle asterisco verdi mostrano differenze statistiche tra il gruppo orale alimentare FTC/TDF/ELV e il gruppo di iniezione FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 in ogni gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: La somministrazione orale di cART negli alimenti mostra una soppressione virale più rapida. Come descritto nella Figura 1, i topi non sono stati trattati o trattati con regime FTC/TDF/RAL attraverso iniezione sottocutanea e attraverso somministrazione orale di regimi alimentari mock, FTC/TDF/RAL, o FTC/TDF/ELV per altre 7,5 settimane. (A) Carica virale plasmatica nel tempo dopo l'infezione da HIV-1 in diversi gruppi. (B) Riassunto della carica virale nel tempo dopo l'infezione da HIV-1 in diversi gruppi, riportando la media geometrica del gruppo con intervallo di confidenza (IC) del 95%. Le frecce nere indicano l'ora di inizio della cART per i gruppi trattati con cART. (C) Analisi della sopravvivenza del tempo dopo il trattamento con cART a carica virale non rilevabile per ciascun gruppo. n= 6-7 in ciascun gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Le somministrazioni orali di alimenti ART mostrano un ripristino più rapido del rapporto CD4/CD8. Rapporto CD4/CD8 nel sangue periferico nel tempo dopo l'infezione da HIV-1 per ciascun gruppo. Tutti i confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il test di Mann-Whitney, media del gruppo di segnalazione (± S.E.). Le stelle asterisco rosse mostrano differenze statistiche tra il gruppo orale alimentare FTC/TDF/RAL e il gruppo di iniezione FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05. n=6-7 in ogni gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Un metodo di somministrazione orale di cART è stato sviluppato qui per topi umanizzati infetti da HIV-1 combinando tre farmaci antiretrovirali all'interno di alimenti ad alto contenuto di nutrienti. Rispetto alla somministrazione tramite iniezioni giornaliere, la somministrazione orale è più facile da usare, limita la frequenza di somministrazione, riduce la manipolazione degli animali, riduce al minimo lo stress e migliora la sicurezza55. Fino a questo punto, solo pochi studi su topi umanizzati 24,37,41 hanno usato pellet alimentari contenenti farmaci ART frantumati per trattare i topi. Tuttavia, questo metodo è difficile da applicare ampiamente a causa dell'accesso limitato alla produzione di pellet alimentari speciali. Altri studi 42,43,44,45,46 hanno utilizzato l'acqua potabile come sistema di erogazione cART. Tuttavia, la composizione di un farmaco in acqua potabile potrebbe alterare la stabilità, la purezza o persino la potenza dei principi attivi. Inoltre, molti farmaci antiretrovirali, tra cui TDF, RAL ed ELV, sono scarsamente solubili in acqua. Gli studi hanno dimostrato che la biodisponibilità orale del TDF è aumentata del 40% dopo un pasto ricco di grassi56, suggerendo che l'inibizione competitiva delle lipasi da parte degli alimenti può fornire una certa protezione per TDF57. DietGel Boost è un integratore alimentare che fornisce idratazione, nutrizione e prodotti di arricchimento che migliorano il benessere generale degli animali da ricerca58. Il gel arricchito con sostanze nutritive è costituito dal 25% -30% di acqua pura con aggiunta di carboidrati, proteine, grassi, minerali ed elettroliti ed è certificato privo di fitoestrogeni e nitrosammine58. Fornisce un'alternativa economica, efficace ed efficiente in termini di manodopera alle diete a base di purè58. Poiché il 20,3% del grasso totale è stato incluso nella tazza Boost, proponiamo che alti livelli di nutrienti possano sciogliere meglio il TDF e quindi aumentare la sua biodisponibilità orale. Pertanto, è stata utilizzata una sospensione alimentare ad alto contenuto di nutrienti per fornire i farmaci cART per imitare la consegna perorale dei farmaci cART che gli individui con infezione da HIV-1 attualmente utilizzano.

I topi hanno un metabolismo più elevato rispetto agli esseri umani e, pertanto, la dose dei composti distinti è stata convertita e utilizzata da una formula come descritto nel riferimento59. Dosi umane di 0,4 mg (dose totale) di RAL, 0,1 mg (dose totale) di FTC e 2,14 mg (dose totale) di TDF sono state convertite sulla base del fattore di correzione (Km, stimato dividendo il peso corporeo medio (kg) delle specie per la sua superficie corporea (m2)) per stimare i valori di dose equivalenti al topo di 37 (Km) e 3 (Km) per l'uomo e i topi59, rispettivamente. Considerando la solubilità relativamente bassa di TDF, RAL ed ELV in acqua, il DMSO è stato utilizzato qui come solvente per i farmaci cART. La concentrazione finale di DMSO contenuta nel cibo cART orale è dello 0,0059% (v/v). La concentrazione di DMSO è molto bassa e relativamente sicura come solvente del farmaco60,61,62,63. È importante sottolineare che in questi studi non è stata osservata alcuna perdita di pelo o cambiamenti di comportamento nei topi.

La procedura sopra descritta è un metodo di somministrazione di cART altamente robusto e ripetibile per il trattamento di topi umanizzati infetti da HIV-1. Questo protocollo può essere seguito facilmente. I passaggi critici del protocollo sono 1) mantenere sterile l'intero processo di qualsiasi materiale coinvolto nel protocollo relativo al cibo DietGel considerando l'immunodeficienza dei topi umanizzati e 2) evitare più soluzioni stock di cART scongelate / congelate e aliquote di farmaci cART in modo appropriato in base al numero e ai gruppi di topi. I dati suggeriscono che la somministrazione orale di cART A TRE FARMACI (TDF, FTC e RAL o ELV) premiscelati all'interno della tazza alimentare sopprime efficacemente la replicazione dell'HIV-1 e riduce la carica virale nel plasma a livelli non rilevabili entro 4 settimane di trattamento. La somministrazione orale di cibo cART non solo ha impedito un ulteriore declino delle cellule T CD4, ma ha anche provocato un aumento della percentuale di cellule T CD4 nel sangue periferico. Inoltre, il metodo di somministrazione orale di cART ha ripristinato il peso del topo più velocemente dell'iniezione giornaliera e ha migliorato la salute generale.

È importante sottolineare che questo metodo ha rimosso il rischio di esposizione del ricercatore a taglienti durante l'iniezione giornaliera di farmaci cART in topi umanizzati infetti da HIV-1. Il metodo proposto che sopprime con successo la replicazione dell'RNA dell'HIV-1 nei topi umanizzati sarà molto prezioso per studi preclinici proof-of-concept per lo sviluppo di nuovi trattamenti curativi che imitano da vicino la somministrazione del farmaco in individui infetti cronici da HIV-1 trattati con cART.

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Disclosures

SK è uno dei fondatori di CDR3 Inc. I restanti autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare i dottori Romas Geleziunas e Jeff Murry e le persone di Gilead per aver fornito i farmaci antiretrovirali utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato finanziato da NCI 1R01CA239261-01 (a Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core e Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (a Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'UCLA AIDS Institute, dal James B. Pendleton Charitable Trust e dalla McCarthy Family Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

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Immunologia e infezione numero 188
Trattamento antiretrovirale combinato orale in topi umanizzati infetti da HIV-1
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Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

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