Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines Haut-Faszien-Explantats, das als “SCar-ähnliches Gewebe in einer Schale” oder SCAD bezeichnet wird. Dieses Modell ermöglicht eine beispiellose Visualisierung einzelner Fibroblasten während der Narbenbildung.
Die globale Reaktion von Säugetieren auf die Versiegelung tiefer Gewebewunden erfolgt durch Narbenbildung und Gewebekontraktion, vermittelt durch spezialisierte Faszienfibroblasten. Trotz der klinischen Bedeutung der Narbenbildung und der gestörten Wundheilung ist unser Verständnis der Faszienfibroblastendynamik in der Wundheilung aufgrund des Fehlens relevanter Assays, die eine direkte Visualisierung der Fibroblastenchoreografie und -dynamik in komplexen Umgebungen wie in Hautwunden ermöglichen, oberflächlich. Dieses Papier stellt ein Protokoll zur Erzeugung von Ex-situ-Hautnarben mit SCAD oder “SCar-ähnlichem Gewebe in A Dish” vor, die die komplexe Umgebung von Hautwunden nachahmen. Bei diesem Assay wird 2 mm dicke Haut 5 Tage lang in Medien ausgeschnitten und auf den Kopf gestellt, wobei sich Narben und Hautkontrakturen gleichmäßig entwickeln. Diese Methodik, gepaart mit fibroblastenlinienspezifischen transgenen Mausmodellen, ermöglicht die Visualisierung einzelner Fibroblastenlinien über den gesamten Wundreparaturprozess hinweg. Insgesamt hilft dieses Protokoll den Forschern, grundlegende Prozesse und Mechanismen der Wundreparatur zu verstehen und die Auswirkungen von Modulatoren auf die Wundheilungsergebnisse direkt zu untersuchen.
Wundheilung ist ein Prozess der Wiederherstellung von gebrochenen Wunden. Gewebeverletzungen bei Wirbellosen führen zu einer teilweisen oder vollständigen Regeneration. Im Gegensatz dazu reagieren Säugetiere auf tiefe Verletzungen durch Narbenbildung, ein Prozess, der darauf zugeschnitten ist, Wunden schnell mit dichten Pfropfen aus Matrixfasern zu versiegeln, die den durchbrochenen Bereich minimieren und gleichzeitig die verletzte Stelle dauerhaft verformen 1,2,3. Große Hautverbrennungen oder tiefe offene Wunden bei Säugetieren führen zu pathologischen Phänotypen wie hypertrophen oder keloiden Narben 4,5. Diese überschwänglichen Narben verursachen eine enorme Belastung für die klinischen und globalen Gesundheitssysteme. Allein in den USA kostet das Narbenmanagement jährlichetwa 10 Milliarden US-Dollar 6,7. Daher ist die Entwicklung relevanter Methoden erforderlich, um die grundlegenden Prozesse und Mechanismen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, besser zu verstehen.
In den letzten Jahren hat eine breite Palette von Studien an Mäusen heterogene Fibroblastenpopulationen mit unterschiedlichen funktionellen Potenzen basierend auf ihrer Herkunft an bestimmten Hautstellengezeigt 8,9,10. In der Rückenhaut identifizierten Rinkevich et al., 2015, dass eine spezifische Fibroblastenpopulation mit einer frühen embryonalen Expression von Engrailed-1 (En1), genannt EPF (Engrailed positive Fibroblast), zur kutanen Narbenbildung bei der Wunde beiträgt. Umgekehrt trägt eine andere Fibroblastenlinie ohne Geschichte der engrailed expression, Engrailed negative fibroblast (ENF), nicht zur Narbenbildungbei 8. Die Schicksalskartierung dieser En1-Linien unter Verwendung von Cre-gesteuerten transgenen Mauslinien, die zu Fluoreszenzreporter-Mauslinien wie R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) gekreuzt wurden, ermöglicht die Visualisierung von EPF- und ENF-Populationen.
Die Untersuchung der Fibroblastenmigration in vivo über mehrere Tage ist durch ethische und technische Einschränkungen begrenzt. Darüber hinaus sind zusammengesetzte, virale und neutralisierende Antikörperbibliotheks-Screens zur Modulation von Signalwegen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, technisch eine Herausforderung. Zuvor verwendete In-vitro– oder Ex-vivo-Modelle sind nicht in der Lage, die Migration von Fibroblasten und die Narbenbildung in echten Hautmikroumgebungen, die Gleichmäßigkeit der Narbenentwicklung sowie die Gewebekomplexität, die in vivo-Hautumgebungen emuliert, zu visualisieren 11,12. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Ex-vivo-Narbenuntersuchungsassay namens SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14 entwickelt. Dieser einfache Assay kann durchgeführt werden, indem 2 mm dicke Haut, die die Epidermis, die Dermis und die subkutanen Faszienregionen enthält, entfernt und in serumergänzten DMSO-Medien für bis zu 5 Tage kultiviert werden. Narben, die durch SCAD erzeugt werden, replizieren zuverlässig transkriptomische und proteomische Merkmale von In-vivo-Narben. Darüber hinaus ermöglichen SCADs, die aus relevanten transgenen Mauslinien (z. B. En1-Mäusen) erzeugt werden, die mit fluoreszierenden Reporter-Mauslinien gekreuzt sind, die Visualisierung der Migrationsdynamik und Narbenentwicklung von Fibroblasten mit einer beispiellosen Auflösung. Darüber hinaus kann dieses Modell leicht an alle Anwendungen mit hohem Durchsatz angepasst werden (z. B. Substanzbibliothek, Antikörperbibliothek oder virales Screening)13,14. In diesem Artikel beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SCADs und nachgelagerten Verarbeitungsanwendungen zur Untersuchung der Zell- und Matrixdynamik bei der Narbenentwicklung.
Mehrere Modelle wurden bereits entwickelt, um die Narbenbildung nach Verletzungen zu verstehen. Während in dieser Hinsicht viele Fortschritte erzielt wurden, sind die tatsächlichen Mechanismen noch nicht klar. Im Gegensatz zur bisherigen Technik bezieht das SCAD-Modell alle Zelltypen und Hautschichten mit ein, wodurch die Komplexität der nativen Haut18,19 erhalten bleibt. Diese Methodik ist in der Lage, grundlegende Datensätze zu generieren, die für das Vers…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken allen Co-Autoren von Jiang et al. 2020 für ihren Beitrag zur Entwicklung der SCAD-Methodik13. Wir danken Dr. Steffen Dietzel und der Bioimaging Core Facility der Ludwig-Maximilans-Universität für den Zugang zum Multiphotonensystem. Y.R. wurde gefördert durch die Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), den European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) und die LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |