Визуализация развития рубцов с помощью анализа SCAD - анализ рубцевания кожи Ex-situ
Summary
Этот протокол описывает генерацию эксплантата кожи-фасции, называемого «SCar like tissue in A Dish» или SCAD. Эта модель позволяет беспрецедентно визуализировать одиночные фибробласты при образовании рубцов.
Abstract
Глобальная реакция млекопитающих на герметизацию глубоких тканевых ран заключается в образовании рубцов и сокращении тканей, опосредованных специализированными фибробластами фасций. Несмотря на клиническое значение образования рубцов и нарушения заживления ран, наше понимание динамики фибробластов фасций в заживлении ран является поверхностным из-за отсутствия соответствующих анализов, которые позволяют непосредственно визуализировать хореографию и динамику фибробластов в сложных средах, таких как в кожных ранах. В этой статье представлен протокол для создания шрамов на коже ex-situ с использованием SCAD или «SCar-подобной ткани в чашке», которые имитируют сложную среду кожных ран. В этом анализе кожа полной толщиной 2 мм иссекается и культивируется вверх ногами в средах в течение 5 дней, в течение которых рубцы и контрактуры кожи развиваются равномерно. Эта методология в сочетании с трансгенными моделями мышей, специфичными для линии фибробластов, позволяет визуализировать отдельные линии фибробластов на протяжении всего процесса заживления ран. В целом, этот протокол помогает исследователям понять фундаментальные процессы и механизмы заживления ран, непосредственно изучая влияние модуляторов на результаты заживления ран.
Introduction
Заживление ран – это процесс восстановления нарушенных ран. Повреждения тканей у беспозвоночных приводят к частичной или полной регенерации. Напротив, млекопитающие реагируют на глубокие повреждения рубцеванием, процессом, предназначенным для быстрого уплотнения ран плотными пробками матричных волокон, которые минимизируют нарушенную область и в то же время постоянно деформируют поврежденный участок 1,2,3. Большие ожоги кожи или глубокие открытые раны у млекопитающих приводят к патологическим фенотипам, таким как гипертрофические или келоидные рубцы 4,5. Эти обильные шрамы создают огромную нагрузку на клинические и глобальные системы здравоохранения. Только в США управление шрамами стоит около 10 миллиардов долларов в год 6,7. Поэтому разработка соответствующих методологий необходима для лучшего понимания основополагающих процессов и механизмов, связанных с образованием рубцов.
В последние годы широкий спектр исследований на мышах выявил гетерогенные популяции фибробластов с различными функциональными потенциями, основанными на их происхождении в определенных местах кожи 8,9,10. В коже спины Rinkevich et al., 2015, определили, что специфическая популяция фибробластов с ранней эмбриональной экспрессией Engrailed-1 (En1), называемая EPF (Engrailed positive fibroblast), способствует кожному рубцеванию при ранении. И наоборот, другая линия фибробластов без истории энгральсированной экспрессии, энгралированный отрицательный фибробласт (ENF), не способствует образованию рубцов8. Картирование судьбы этих линий En1 с использованием cre-управляемых трансгенных линий мыши, скрещенных с флуоресцентными репортерными линиями мыши, такими как R26mTmG (En1Cre x R26mTmG), позволяет визуализировать популяции EPF и ENF.
Изучение миграции фибробластов in vivo в течение нескольких дней ограничено этическими и техническими ограничениями. Кроме того, комбинированные, вирусные и нейтрализующие экраны библиотеки антител для модуляции путей, участвующих в рубцевании, являются технически сложными. Ранее использовавшиеся модели in vitro или ex vivo не обладают способностью визуализировать миграцию фибробластов и образование рубцов в подлинных микросредах кожи, однородность в развитии рубцов, а также сложность тканей, которая имитирует in vivo кожные среды11,12. Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, мы разработали анализ рубцевания ex vivo, называемый SCAD (SCar-подобная ткань в A Dish)13,14. Этот простой анализ может быть выполнен путем иссечения кожи полной толщины 2 мм, содержащей эпидермис, дерму и подкожные участки фасций, и культивирования их в сывороточных средах ДМСО на срок до 5 дней. Шрамы, полученные из SCAD, надежно реплицируют транскриптомные и протеомные признаки рубцов in vivo. Кроме того, SCAD, генерируемые соответствующими трансгенными линиями мышей (например, мышей En1), скрещенных с флуоресцентными репортерными линиями мыши, позволяют визуализировать динамику миграции фибробластов и развитие рубцов с беспрецедентным разрешением. Кроме того, эта модель может быть легко адаптирована для любых приложений с высокой пропускной способностью (например, библиотека соединений, библиотека антител или вирусный скрининг)13,14. В этой статье мы опишем оптимизированный протокол для генерации SCAD и последующих приложений последующей обработки для изучения клеточной и матричной динамики при развитии рубцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько моделей уже были разработаны, чтобы понять образование рубцов после травмы. Хотя в этом отношении было достигнуто много успехов, но фактические механизмы все еще не ясны. В отличие от предыдущей методики, модель SCAD включает в себя все типы клеток и кожные слои, тем самым сохран…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех соавторов Jiang et al. 2020 за вклад в разработку методологии SCAD13. Мы благодарим д-ра Штеффена Дитцеля и ядро Bioimaging в Университете Людвига-Максимиланса за доступ к многофотонной системе. Y.R. был поддержан Фондом Эльзе-Крёнер-Фрезениус-Stiftung (2016_A21), Грантом консолидатора Европейского исследовательского совета (ERC-CoG 819933) и Фондом LEO (LF-OC-21-000835).
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing–Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
