Summary
Este protocolo describe la generación de un explante de piel-fascia denominado "tejido similar a SCar en un plato" o SCAD. Este modelo permite una visualización sin precedentes de fibroblastos individuales durante la formación de cicatrices.
Abstract
La respuesta global de los mamíferos al sellado de heridas de tejido profundo es a través de la formación de cicatrices y la contracción del tejido, mediada por fibroblastos especializados en la fascia. A pesar de la importancia clínica de la formación de cicatrices y la cicatrización deficiente de heridas, nuestra comprensión de la dinámica de los fibroblastos de la fascia en la cicatrización de heridas es superficial debido a la falta de ensayos relevantes que permitan la visualización directa de la coreografía y la dinámica de los fibroblastos en entornos complejos, como en heridas cutáneas. Este artículo presenta un protocolo para generar cicatrices cutáneas ex situ utilizando SCAD o "tejido similar a SCar en un plato" que emulan el complejo entorno de las heridas cutáneas. En este ensayo, la piel de 2 mm de espesor completo se extirpa y se cultiva boca abajo en medios durante 5 días, durante los cuales las cicatrices y las contracturas de la piel se desarrollan de manera uniforme. Esta metodología, junto con modelos de ratón transgénico específicos del linaje de fibroblastos, permite la visualización de linajes de fibroblastos individuales en todo el proceso de reparación de heridas. En general, este protocolo ayuda a los investigadores a comprender los procesos y mecanismos fundamentales de reparación de heridas, explorando directamente los efectos de los moduladores en los resultados de curación de heridas.
Introduction
La cicatrización de heridas es un proceso de restauración de heridas rotas. Las lesiones tisulares en invertebrados resultan en una regeneración parcial o completa. Por el contrario, los mamíferos responden a las lesiones profundas mediante cicatrices, un proceso diseñado para sellar rápidamente las heridas con densos tapones de fibras de matriz que minimizan el área quebrantada y al mismo tiempo deforman permanentemente el sitio lesionado 1,2,3. Las grandes quemaduras en la piel o las heridas abiertas profundas en los mamíferos dan lugar a fenotipos patológicos como cicatrices hipertróficas o queloides 4,5. Estas cicatrices exuberantes causan una tremenda carga en los sistemas de salud clínicos y globales. Solo en los Estados Unidos, el manejo de cicatrices cuesta alrededor de $ 10 mil millones anuales 6,7. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de metodologías relevantes para comprender mejor los procesos y mecanismos fundementales involucrados en la formación de cicatrices.
En los últimos años, una amplia gama de estudios en ratones ha revelado poblaciones heterogéneas de fibroblastos con distintas potencias funcionales basadas en sus orígenes en ciertas ubicaciones de la piel 8,9,10. En la piel posterior, Rinkevich et al., 2015, identificaron que una población específica de fibroblastos con una expresión embrionaria temprana de Engrailed-1 (En1), denominada EPF (Fibroblasto Positivo Engrailed) contribuye a la cicatrización cutánea al enrollarse. Por el contrario, otro linaje de fibroblastos sin antecedentes de expresión engrailed, el fibroblasto negativo engrailed (ENF), no contribuye a la formación de cicatrices8. El mapeo del destino de estos linajes En1 utilizando líneas de ratones transgénicos impulsadas por Cre cruzadas a líneas de ratón reporteros de fluorescencia como R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) permite la visualización de poblaciones de EPF y ENF.
El estudio de la migración de fibroblastos in vivo durante varios días está limitado por restricciones éticas y técnicas. Además, las pantallas de biblioteca de anticuerpos compuestos, virales y neutralizantes para modular las vías involucradas en la cicatrización son técnicamente desafiantes. Los modelos in vitro o ex vivo utilizados anteriormente carecen de la capacidad de visualizar la migración de fibroblastos y la formación de cicatrices en microambientes cutáneos genuinos, uniformidad en el desarrollo de cicatrices, así como complejidad tisular que emula entornos cutáneos in vivo 11,12. Para superar las limitaciones anteriores, desarrollamos un ensayo de cicatrización ex vivo denominado SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Este ensayo simple se puede realizar extirpando la piel de 2 mm de espesor completo que contiene la epidermis, la dermis y las regiones de la fascia subcutánea y cultivándolas en medios DMSO suplementados con suero durante un máximo de 5 días. Las cicatrices generadas a partir de SCAD replican de manera confiable las características transcriptómicas y proteómicas de las cicatrices in vivo. Además, los SCAM generados a partir de líneas de ratones transgénicos relevantes (por ejemplo, ratones En1) cruzados con líneas de ratones reporteros fluorescentes permiten la visualización de la dinámica de migración de fibroblastos y el desarrollo de cicatrices a una resolución sin precedentes. Además, este modelo se puede adaptar fácilmente para cualquier aplicación de alto rendimiento (por ejemplo, biblioteca de compuestos, biblioteca de anticuerpos o cribado viral)13,14. En este artículo, describimos un protocolo optimizado para generar SCADs y posteriores aplicaciones de procesamiento aguas abajo para estudiar la dinámica celular y matricial en el desarrollo de cicatrices.
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Protocol
El modelo que se presenta a continuación proporciona una descripción detallada paso a paso de la generación del ensayo SCAD como se describe brevemente en Jiang et al., 202013. Las preparaciones de muestras de SCAD se realizaron después de sacrificar a los animales según las directrices internacionales y del Gobierno de Alta Baviera. Los animales fueron alojados en las instalaciones para animales del Centro Helmholtz de Múnich. Las habitaciones se mantuvieron con una humedad óptima y una temperatura constante con un ciclo de luz de 12 h. A los animales se les suministró comida y agua ad libitum.
1. Preparación del tejido SCAD
- Sacrifica cachorros recién nacidos el día postnatal 0 o el día 1 (P0 o P1).
- Extirpa cuidadosamente al menos 1,5 cm x 1,5 cm de la piel dorsal de espesor completo hasta la capa muscular esquelética con un bisturí quirúrgico estéril.
- Pelar la piel con pinzas curvas estériles, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente.
- Lave el tejido extirpado con 50-100 ml de medios fríos DMEM/F-12 para eliminar la sangre contaminante.
- Lave una vez con la Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks para mantener la viabilidad de los tejidos y las células.
- Coloque la piel boca abajo (fascia superficial en la parte superior) en una placa de Petri de 10 cm que contenga medios DMEM/F12.
- Usando una punción de biopsia desechable de 2 mm, extirpe las piezas de piel redondas de espesor completo, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente hasta la epidermis para generar tejidos SCAD.
- Prepare y llene 200 μL de DMEM / F12 (sin rojo fenol) medios completos-DMEM / F12 suplementados con 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x aminoácidos no esenciales MEM y 1x Penicilina / estreptomicina en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos.
- Usando fórceps estériles, transfiera cuidadosamente y sumerja completamente el tejido SCAD individual boca abajo (fascia hacia arriba) a los pocillos de una placa de 96 pocillos.
- Transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular mantenida en condiciones estándar (37 °C, 21% (v/v) de oxígeno, 5% (v/v) de C02 y 95% de humedad).
2. SCAD - Cultivo de tejidos
- Cultive SCADs en una incubadora durante un máximo de 5 días.
- En el día 2 y el día 4 de cultivo, reemplace el medio con 200 μl de medios completos DMEM / F12 frescos precalentados para garantizar condiciones de viabilidad celular y tisular continuas. Reemplace los compuestos de tratamiento durante cada cambio de medio.
NOTA: Asegúrese de dejar 10 μL de medios en el pozo para evitar que los tejidos se peguen a los pozos. - Preparar los SCADs para los siguientes experimentos: Imágenes en vivo (sección 3) y Recolección de tejidos y tinción por inmunofluorescencia 2D/3D (sección 4).
3. Imágenes en vivo de SCADs
- Prepare un mínimo de 30 ml de solución de agarosa de baja fusión al 2% -3% (p/v) en PBS en una botella de vidrio calentándola en un microondas hasta que hierva.
- Transfiera inmediatamente la botella y enfríe la solución de agarosa líquida en un baño de agua a 40 °C.
- Transfiera el tejido SCAD con fascia/cicatriz hacia arriba en el centro de un plato de 35 mm.
- Incruste el SCAD a temperatura ambiente (RT) transfiriendo lentamente agarosa líquida a 40 °C en el plato de 35 mm con una pipeta Pasteur. La agarosa polimeriza en 2 min.
- Añadir 2 ml de medios completos DMEM/F12 precalentados (sin indicador rojo fenol).
- Adquiera imágenes de lapso de tiempo de SCADs del día 0 hasta 48 h utilizando un microscopio confocal o multifotón equipado con un sistema de incubación adecuado ajustado a 37 ° C, 21% (v / v) de oxígeno, 5% (v / v) C02 y 95% de humedad.
4. Recolección de tejidos y tinción de inmunofluorescencia 2D/3D
- Lave los tejidos en los puntos de tiempo relevantes reemplazando el medio con PBS estéril.
- Usando fórceps estériles, transfiera cuidadosamente los CAB individuales a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 500 μL de paraformaldehído al 2% para fijar los tejidos durante la noche a 4 °C.
- Lave los tejidos tres veces con PBS y proceda con la tinción de inmunofluorescencia 2D / 3D.
- Tinción por inmunofluorescencia 3D
- Permeabilizar los tejidos incubando en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 μL de PBS suplementado con gelatina al 0,2%, Tritón-X100 al 0,5% y timerosal al 0,01% (PBSGT) en RT durante 24 h.
- Prepare una cantidad adecuada de anticuerpos primarios según las instrucciones del fabricante e incube los tejidos SCAD en 150 μL de solución de PBSGT durante 24 h a RT.
NOTA: Si el fabricante no informa la concentración óptima de anticuerpos para la fluorescencia inmune, la titulación previa de anticuerpos debe realizarse en los tejidos de control utilizando concentraciones variables (por ejemplo, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Lave suavemente los SCAP tres veces con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido.
- Incubar tejido con 1:1000 anticuerpos secundarios relevantes de Alexa Fluor en PBS durante la noche en RT.
- Lave suavemente el tejido durante 30 minutos en PBS tres veces para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios no unidos.
- Transfiera el tejido a un plato con fondo de vidrio de 35 mm para obtener imágenes confocales o multifotónicas.
NOTA: Cuando utilice objetivos de inmersión en agua, incruste los SCAP en agarosa de bajo punto de fusión al 2 % para inmovilizar el tejido y evitar la deriva durante la adquisición de imágenes.
- Tinción por inmunofluorescencia 2D
- Transfiera el tejido a un criomolde y llénelo suavemente con un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para sumergir completamente el tejido.
- Ajuste suavemente la orientación del tejido, asegurando la ausencia de burbujas de aire para obtener una sección transversal o una sección vertical.
- Coloque el molde sobre hielo seco durante 20-30 minutos e incube el bloque a -80 °C durante la noche.
- Ajuste la temperatura de la cuchilla a -25 °C y la temperatura del bloque de muestras a -17 °C. Prepare la criosección de 6 μm con un criostato, transfiera las secciones a un portaobjetos de adhesión y guarde las diapositivas en un congelador de -20 °C.
- Enjuague las diapositivas tres veces en PBS e incube las diapositivas en albúmina sérica bovina (BSA) al 5% p/v en PBST (PBS suplementada con Tween al 0,05%) durante 1 h.
- Añadir una cantidad adecuada de anticuerpo primario a 150μl PGST, e incubar durante la noche a 4 °C
NOTA: Si el fabricante no informa la concentración óptima de anticuerpos para la fluorescencia inmune, la titulación previa de anticuerpos debe realizarse en las secciones de control utilizando concentraciones variables (por ejemplo, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Lave suavemente las secciones tres veces con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido.
- Incubar tejido con 1:1000 anticuerpos secundarios relevantes de Alexa Fluor en PBS durante la noche en RT durante 2 h.
- Lave suavemente el tejido durante 5 minutos en PBS tres veces para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios no unidos.
- Monte las diapositivas con un medio de montaje que contenga DAPI y seque las diapositivas en la oscuridad en RT.
- Tome imágenes de las secciones con un microscopio de fluorescencia.
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Representative Results
La generación de SCADs se puede separar en tres pasos esenciales: Recolección de piel de ratones P0-P1, generación de punzones de biopsia de espesor completo y posterior cultivo de scads individuales hasta 5 días en placas de 96 pocillos. Como lectura, este ensayo se puede aplicar para analizar los aspectos espaciales y temporales de la cicatrización. El análisis espacial utiliza el marcado inmune 2D y 3D de los tejidos para estudiar la localización espacial de los componentes celulares y matriciales dentro del tejido cicatricial en desarrollo. Los estudios espaciotemporales permiten la visualización de estas cicatrices ex situ utilizando proteínas fluorescentes intrínsecas o extrínsecas tisulares que se pueden visualizar utilizando modalidades relevantes de imágenes de lapso de tiempo 3D.
Los pasos fundamentales en este ensayo son configurar el experimento mediante la generación cuidadosa de punzones de biopsia de espesor completo, asegurando la presencia de una capa fascial de "gelatina" y cultivando el tejido completamente sumergido boca abajo (epidermis frente a la parte inferior de las placas de 96 pocillos). Esto permite el desarrollo de cicatrices uniformes, una dinámica de migración comparable de las poblaciones relevantes de fibroblastos y la contracción de la piel a través de los SCAD (Figura 1A). La versatilidad del ensayo SCAD permite cosechar el tejido en todo el espectro del desarrollo de cicatrices. Por ejemplo, si el objetivo del experimento es estudiar la dinámica temprana de la cicatrización, el análisis espacial y espaciotemporal puede limitarse a D1 o D2 del cultivo SCAD (Figura 1B).
Las imágenes representativas de campo brillante de montaje completo de los SCAP en el día 0 y el día 5 se muestran en la Figura 2A y la Figura 2A', respectivamente. Para el análisis 2D, es esencial incrustar los SCADs en OCT en orientación perpendicular desprovista de burbujas de aire para garantizar la integridad del tejido después de la sección. Estas secciones de tejido pueden ser sometidas a análisis histológicos (por ejemplo, tinción tricrómica de Masson-Figura 2B,2B') o tinción de inmunofluorescencia (Figura 2C,2C') en las criosecciones de la dermis dorsal de ratón En1 Cre,R26mTmG; EPF en verde y ENF en rojo desde la cicatriz temprana (Figura 2D) y tardía (Figura 2D').
Las imágenes de lapso de tiempo 3D y 3D de las cicatrices requieren la detección de señales de fluorescencia en el interior del tejido (400-800 μm). La excitación en longitudes de onda del infrarrojo cercano utilizando la excitación de dos fotones permite tales mediciones sin la necesidad de limpieza de tejidos, una metodología comúnmente utilizada en imágenes 3D para hacer que el tejido sea transparente al minimizar la dispersión y absorción de la luz 15,16,17. Utilizamos un microscopio multifotón vertical equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25x en combinación con un láser sintonizable. Los tejidos fueron sometidos a tinción inmune 3D utilizando sondas relevantes. Para las imágenes 3D, el tejido se incrustó en una solución de agarosa de baja fusión al 2% para inmovilizar o prevenir la deriva en el tejido (Figura 3A) rematada con PBSGT para que coincida con el índice de refracción requerido para el objetivo de inmersión en agua. La imagen representativa en la Figura 3B y la Figura 3B' muestra la localización exclusiva de la proteína N-Cadherina (rosa / magenta-Alexa fluor 647) en el sitio de la cicatriz de un día 5 SCAD de una piel posterior En1Cre, R26mTmG; EPF en verde, y ENF en rojo. Para las imágenes de lapso de tiempo en 3D, se realizó una ligera modificación en la configuración anterior al incrustar el tejido en una solución de agarosa de baja fusión al 2% cubierta con medios DMEM / F12 sin indicador rojo de fenol en lugar de PBS. Para garantizar las condiciones adecuadas para el tejido SCAD "vivo" durante la obtención de imágenes, se agregó una cámara de incubación adecuada para que todos los fenotipos se registren correctamente durante la obtención de imágenes (Figura 3C). Las instantáneas representativas de los primeros enjambres de fibroblastos se muestran en la Figura 3D, figura 3D' y Figura 3D'' durante las primeras 12 h / primeras etapas del desarrollo de la cicatriz.
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático del ensayo SCAD. (A) Se extirpa la piel posterior de las crías postnatales día 0 / día 1, asegurando la integridad del tejido que contiene las siguientes capas dérmicas: Epidermis (E), dermis papilar y reticular (PD y RD), y Capa de fascia (F) seguida de punzones de biopsia de 2 mm para obtener SCADs del día 0. (B) Los SCADs se pueden cultivar posteriormente durante un máximo de 5 días con un paso opcional de cosecha intermitente / fijación de tejidos basado en la naturaleza de los experimentos individuales (flechas punteadas) con un paso de cambio de medios de cultivo en el día 2 y el día 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tinción de inmunofluorescencia 2D. Lecturas 2D representativas para estudiar cicatrices tempranas y tardías utilizando (A y A') Imagen de montaje completo de campo brillante en el día 0 (A) y el día 5 (A'). (B y B') Tinción tricrómica de Masson de secciones verticales de tejido para revelar firmas de contracción del tejido cicatricial-acumulación de ECM en el núcleo cicatricial (triángulo relleno amarillo) en el día 0 (B) y el día 5 (B'). (C y C') Análisis de inmunofluorescencia de scaDs de día 0 (C) y día 5 (C') generados a partir de la piel posterior en En1 Cre,R26mTmG. Los EPF se muestran en verde, ENF en rojo y DAPI en azul desde la cicatriz temprana (D) y tardía (D'). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración esquemática y lecturas representativas de SCADs para análisis esptio y espaciotemporal 3D. (A) Representación esquemática de incrustar los SCADs en gel de agarosa a baja temperatura de fusión al 2% bajo un microscopio fluorescente vertical y (B) imagen representativa de un SCAD teñido inmunofluorescente 3D día 5 generado a partir de En1 Cre,R26mTmG dermis de ratón e inmunomantada con anticuerpos N-Cadherina (Magenta). Los EPF se muestran en verde y los ENF se muestran en rojo. (C) Representación esquemática de imágenes 3D SCAD configuración equipada con una cámara de incubación: 37 °C, 21% (v/v) de oxígeno, 5% (v/v) C02 y 95% de humedad. (D) Resultados representativos de imágenes en vivo que muestran eventos tempranos de progresión de enjambres de fibroblastos (círculo discontinuo blanco) en las primeras 12 h del día 0 y el día 1 etapa SCAD. (E) Representación gráfica de trayectorias celulares rastreadas unicelulares de fibroblastos individuales en D, D' y D''. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Ya se han desarrollado varios modelos para comprender la formación de cicatrices después de una lesión. Si bien se han logrado muchos avances en este sentido, los mecanismos reales aún no están claros. A diferencia de la técnica anterior, el modelo SCAD incorpora todos los tipos celulares y capas cutáneas, manteniendo así la complejidad de la piel nativa18,19. Esta metodología es capaz de generar conjuntos de datos fundamentales que son importantes para comprender los mecanismos moleculares que impulsan la formación de cicatrices. El ensayo está diseñado de una manera simple, minimalista, pero capaz de producir lecturas fundamentales y funcionales que son cruciales para comprender la migración de fibroblastos, la deposición de ECM, la contracción epidérmica / muscular13,14. Es relativamente menos complejo que las configuraciones in vivo, y las desviaciones con respecto a la muestra se pueden minimizar. Además, este ensayo se puede combinar fácilmente con tuberías de análisis de alto rendimiento. En el que todo el espectro o las bibliotecas de inhibidores o activadores, como compuestos químicos, anticuerpos neutralizantes, siRNA o metodologías virales que reducen o promueven la cicatrización, podrían aplicarse con relativa facilidad a cantidades mínimas de tejidos extirpados. En cuanto a la limitación de este modelo de cicatriz ex vivo, este ensayo no se puede aplicar para estudiar aspectos fenotípicos o dinámicos de a) enjambres inmunes no residentes en el desarrollo de cicatrices b) vascularización c) maduración cicatricial ya que el tejido no es viable más allá de los 5 días posteriores a la lesión.
Antes de la escisión por punción de biopsia, es importante que no quede sangre residual en el tejido, ya que podría interferir con los procedimientos del experimento. Recomendamos lavar el tejido más de una vez con HBSS si es necesario, para asegurarse de que se elimine cualquier sangre residual del tejido. Además, el cambio de medios en días alternos debe realizarse con especial cuidado, ya que las capas dérmica y epidérmica pueden separarse debido al pequeño tamaño del tejido. Por lo tanto, es imperativo practicar el procedimiento correctamente por adelantado antes de comenzar los experimentos reales. Para evitar la separación repetida de las capas de tejido, sugerimos que durante el cambio de medios, se puedan mantener 10 μl de medios residuales antes de reemplazarlos con medios frescos para estabilizar el tejido y minimizar el cambio en la tensión superficial en el tejido causado por los medios agregados al pozo.
Para las tuberías de análisis 2D, recomendamos equilibrar el tejido con un compuesto líquido de temperatura de corte óptima a temperatura ambiente durante unos minutos antes de montar el tejido en un bloque. Esto evita la separación del tejido debido a la formación de cristales de hielo durante la sección. Las tuberías de imágenes de lapso de tiempo 3D/3D deben modificarse adecuadamente en función de la modalidad de microscopio disponible. Para un microscopio vertical (con o sin objetivo de inmersión en agua), incrustar el tejido en agarosa o usar superpegamento evita el desplazamiento físico del tejido durante la obtención de imágenes. Los objetivos de inmersión en agua permiten imágenes de lapso de tiempo 3D / 3D utilizando PBS o medios incoloros (sin rojo fenol). Para un microscopio invertido, el tejido podría colocarse en una placa de fondo de vidrio / imagen e inmovilizarse utilizando una gota de agarosa de baja temperatura de fusión y rematada con medios adecuados para garantizar la viabilidad durante las imágenes en vivo. En ambas modalidades, se puede utilizar un sistema de incubación compatible para garantizar la temperatura, la humedad y el suministro de gas adecuados durante la obtención de imágenes.
En conclusión, el modelo SCAD permite la identificación y caracterización de nuevas señales moleculares y vías mecanicistas implicadas en la cicatrización de heridas de mamíferos13,14. El protocolo proporciona una descripción detallada de la generación de SCADs y posibles aplicaciones y análisis posteriores para proporcionar información sobre el desarrollo de cicatrices.
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Disclosures
Todos los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Reconocemos a todos los coautores de Jiang et al. 2020 por contribuir al desarrollo de la metodología SCAD13. Agradecemos al Dr. Steffen Dietzel y a las instalaciones centrales de Bioimagen en la Ludwig-Maximilans-Universität por el acceso al sistema Multiphoton. Y.R. contó con el apoyo de la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), la European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) y la Fundación LEO (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
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