Summary
Ce protocole décrit la génération d’une explantation de fascia de peau appelée « tissu semblable à un SCar dans un plat » ou SCAD. Ce modèle permet une visualisation sans précédent de fibroblastes uniques lors de la formation de cicatrices.
Abstract
La réponse globale des mammifères à l’étanchéité des plaies des tissus profonds se fait par la formation de cicatrices et la contraction des tissus, médiées par des fibroblastes de fascia spécialisés. Malgré l’importance clinique de la formation de cicatrices et de la cicatrisation altérée des plaies, notre compréhension de la dynamique des fibroblastes du fascia dans la cicatrisation des plaies est superficielle en raison du manque de tests pertinents permettant une visualisation directe de la chorégraphie et de la dynamique des fibroblastes dans des environnements complexes tels que les plaies cutanées. Cet article présente un protocole pour générer des cicatrices cutanées ex situ à l’aide de SCAD ou « SCar-like tissue in A Dish » qui émulent l’environnement complexe des plaies cutanées. Dans ce test, une peau pleine épaisseur de 2 mm est excisée et cultivée à l’envers dans un milieu pendant 5 jours, au cours desquels les cicatrices et les contractures cutanées se développent uniformément. Cette méthodologie, associée à des modèles murins transgéniques spécifiques à la lignée des fibroblastes, permet de visualiser les lignées de fibroblastes individuelles tout au long du processus de réparation des plaies. Dans l’ensemble, ce protocole aide les chercheurs à comprendre les processus fondamentaux et les mécanismes de réparation des plaies, en explorant directement les effets des modulateurs sur les résultats de la cicatrisation des plaies.
Introduction
La cicatrisation des plaies est un processus de restauration des plaies brisées. Les lésions tissulaires chez les invertébrés entraînent une régénération partielle ou complète. En revanche, les mammifères réagissent aux blessures profondes par la cicatrisation, un processus conçu pour sceller rapidement les plaies avec des bouchons denses de fibres matricielles qui minimisent la zone percée et déforment en même temps de manière permanente le site blessé 1,2,3. Les grandes brûlures cutanées ou les plaies profondes chez les mammifères entraînent des phénotypes pathologiques tels que des cicatrices hypertrophiques ou chéloïdes 4,5. Ces cicatrices exubérantes causent un fardeau énorme sur les systèmes de santé cliniques et mondiaux. Rien qu’aux États-Unis, la gestion des cicatrices coûte environ 10 milliards de dollars par an 6,7. Par conséquent, le développement de méthodologies pertinentes est nécessaire pour mieux comprendre les processus et mécanismes fondamentaux impliqués dans la formation des cicatrices.
Au cours des dernières années, un large éventail d’études chez la souris a révélé des populations hétérogènes de fibroblastes avec des puissances fonctionnelles distinctes en fonction de leurs origines dans certains emplacements de la peau 8,9,10. Dans la peau du dos, Rinkevich et al., 2015, ont identifié qu’une population spécifique de fibroblastes avec une expression embryonnaire précoce d’Engrailed-1 (En1), appelée EPF (Fibroblaste positif engrailed) contribue à la cicatrisation cutanée lors de la blessure. Inversement, une autre lignée de fibroblastes sans antécédents d’expression engrailed, engrailed negative fibroblast (ENF), ne contribue pas à la formation decicatrices 8. La cartographie du destin de ces lignées En1 à l’aide de lignées de souris transgéniques à cre croisées avec des lignées de souris rapporteures de fluorescence telles que R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) permet de visualiser les populations EPF et ENF.
L’étude de la migration des fibroblastes in vivo sur plusieurs jours est limitée par des contraintes éthiques et techniques. En outre, les criblages de bibliothèque d’anticorps composés, viraux et neutralisants pour moduler les voies impliquées dans la cicatrisation sont techniquement difficiles. Les modèles in vitro ou ex vivo précédemment utilisés n’ont pas la capacité de visualiser la migration des fibroblastes et la formation de cicatrices dans des microenvironnements cutanés authentiques, l’uniformité dans le développement des cicatrices, ainsi que la complexité tissulaire qui émule les environnements cutanés in vivo 11,12. Pour surmonter les limites ci-dessus, nous avons développé un test de cicatrisation ex vivo appelé SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Ce test simple peut être effectué en excisant une peau pleine épaisseur de 2 mm contenant l’épiderme, le derme et les régions sous-cutanées du fascia et en les cultivant dans un milieu de DMSO supplémenté en sérum pendant 5 jours. Les cicatrices générées par SCAD reproduisent de manière fiable les caractéristiques transcriptomiques et protéomiques des cicatrices in vivo. De plus, les SCAD générés à partir de lignées de souris transgéniques pertinentes (par exemple, des souris En1) croisées avec des lignées de souris rapporteures fluorescentes permettent de visualiser la dynamique de migration des fibroblastes et le développement de cicatrices à une résolution sans précédent. De plus, ce modèle peut être facilement adapté à toutes les applications à haut débit (p. ex., bibliothèque de composés, bibliothèque d’anticorps ou dépistage viral)13,14. Dans cet article, nous décrivons un protocole optimisé pour générer des SCAD et des applications de traitement en aval ultérieures pour étudier la dynamique cellulaire et matricielle dans le développement des cicatrices.
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Protocol
Le modèle présenté ci-dessous fournit une description détaillée étape par étape de la génération du test SCAD, comme décrit brièvement dans Jiang et al., 202013. Les préparations d’échantillons SCAD ont été effectuées après avoir sacrifié les animaux conformément aux directives internationales et gouvernementales de Haute-Bavière. Les animaux étaient hébergés dans les animaleries du Centre Helmholtz de Munich. Les pièces ont été entretenues avec une humidité optimale et une température constante avec un cycle de lumière de 12 h. Les animaux ont reçu de la nourriture et de l’eau ad libitum.
1. Préparation des tissus SCAD
- Sacrifiez les nouveau-nés le jour postnatal 0 ou le jour 1 (P0 ou P1).
- Retirez soigneusement la peau dorsale pleine épaisseur d’au moins 1,5 cm x 1,5 cm jusqu’à la couche musculaire squelettique à l’aide d’un scalpel chirurgical stérile.
- Pelez la peau à l’aide de pinces incurvées stériles, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent.
- Lavez le tissu excisé avec 50 à 100 mL de milieuX DMEM/F-12 froids pour éliminer le sang contaminant.
- Laver une fois avec la solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks pour maintenir la viabilité des tissus et des cellules.
- Placez la peau à l’envers (fascia superficiel sur le dessus) dans une boîte de Petri de 10 cm contenant du milieu DMEM/F12.
- À l’aide d’un poinçon de biopsie jetable de 2 mm, éliminez les morceaux de peau ronds de pleine épaisseur, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent jusqu’à l’épiderme pour générer des tissus SCAD.
- Préparer et remplir 200 μL de milieux DMEM/F12 (sans rouge phénol) de milieux complets DMEM/F12 complétés par 10 % de FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM d’acides aminés non essentiels et 1x pénicilline/streptomycine dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits.
- À l’aide de pinces stériles, transférez soigneusement et immergez complètement le tissu SCAD individuel à l’envers (fascia orienté vers le haut) vers les puits d’une plaque de 96 puits.
- Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire maintenu dans des conditions standard (37 °C, 21 % (v/v) d’oxygène, 5 % (v/v) de C02 et 95 % d’humidité).
2. SCAD - Culture tissulaire
- Cultivez des SCAD dans un incubateur jusqu’à 5 jours.
- Aux jours 2 et 4 de la culture, remplacez le milieu par 200 μl de milieux complets DMEM/F12 fraîchement préchauffés pour assurer la viabilité continue des cellules et des tissus. Remplacer les composés de traitement lors de chaque changement de milieu.
REMARQUE : Assurez-vous de laisser 10 μL de milieu dans le puits pour éviter que les tissus ne collent aux puits. - Préparer les SCAD pour les expériences suivantes : Imagerie en direct (section 3) et Prélèvement de tissus et coloration par immunofluorescence 2D/3D (section 4).
3. Imagerie en direct des SCAD
- Préparer un minimum de 30 mL de solution d’agarose à faible fusion de 2 % à 3 % (p/v) dans du PBS dans une bouteille en verre en la chauffant au micro-ondes jusqu’à ébullition.
- Transférer immédiatement la bouteille et refroidir la solution d’agarose liquide dans un bain-marie à 40 °C.
- Transférer le tissu SCAD avec le fascia / cicatrice vers le haut sur le centre d’un plat de 35 mm.
- Intégrer le SCAD à température ambiante (RT) en transférant lentement de l’agarose liquide à 40 °C sur le plat de 35 mm à l’aide d’une pipette Pasteur. L’agarose polymérise en 2 min.
- Ajouter 2 mL de milieu complet DMEM/F12 préchauffé (sans indicateur de rouge phénol).
- Acquérir des images time-lapse de SCADs jour 0 jusqu’à 48 h à l’aide d’un microscope confocal ou multiphotonique équipé d’un système d’incubation approprié réglé à 37 °C, 21% (v / v) d’oxygène, 5% (v / v) C02 et 95% d’humidité.
4. Prélèvement de tissus et coloration par immunofluorescence 2D/3D
- Lavez les mouchoirs aux moments pertinents en remplaçant le milieu par du PBS stérile.
- À l’aide de pinces stériles, transférer soigneusement les SCAD individuels dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 500 μL de paraformaldéhyde à 2 % pour fixer les tissus pendant la nuit à 4 °C.
- Lavez les tissus trois fois avec du PBS et procédez à la coloration par immunofluorescence 2D/3D.
- Coloration par immunofluorescence 3D
- Perméabiliser les tissus en incubant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 500 μL de PBS complété par 0,2% de gélatine, 0,5% de Triton-X100 et 0,01% de Thimérosal (PBSGT) à RT pendant 24 h.
- Préparer une quantité adéquate d’anticorps primaires conformément aux instructions du fabricant et incuber les tissus SCAD dans 150 μL de solution pbSGT pendant 24 h à TA.
REMARQUE : Si la concentration optimale d’anticorps pour la fluorescence immunitaire n’est pas déclarée par le fabricant, le titrage préalable des anticorps doit être effectué sur les tissus témoins en utilisant des concentrations variables (p. ex., 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Lavez doucement les SCAD trois fois avec pbS pour éliminer l’anticorps primaire non lié.
- Incuber du tissu avec 1:1000 anticorps secondaires Alexa Fluor pertinents dans le PBS pendant la nuit à RT.
- Lavez doucement le tissu pendant 30 minutes dans le PBS trois fois pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires non liés.
- Transférez le tissu sur une parabole à fond de verre de 35 mm pour l’imagerie confocale ou multiphotonique.
REMARQUE: Lors de l’utilisation d’objectifs d’immersion dans l’eau, incorporez les SCAD dans de l’agarose à faible point de fusion à 2 % pour immobiliser le tissu afin d’éviter la dérive lors de l’acquisition de l’image.
- Coloration par immunofluorescence 2D
- Transférez le tissu dans un cryo-moule et remplissez-le doucement avec un composé à température de coupe optimale (OCT) pour immerger complètement le tissu.
- Ajustez doucement l’orientation du tissu, en assurant l’absence de bulles d’air pour obtenir une section transversale ou une section verticale.
- Placez le moule sur de la glace carbonique pendant 20 à 30 minutes et incubez le bloc à -80 °C pendant la nuit.
- Réglez la température de la lame sur -25 °C et la température du bloc de l’échantillon sur -17 °C. Préparer une cryo-section de 6 μm à l’aide d’un cryostat, transférer les sections sur une lame d’adhérence et stocker les lames dans un congélateur à -20 °C.
- Rincer les lames trois fois dans du PBS et incuber les lames dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % p/v dans du PBST (PBS complété par 0,05 % d’interpolation) pendant 1 h.
- Ajouter une quantité appropriée d’anticorps primaire à 150μl de PGST et incuber pendant la nuit à 4 °C
REMARQUE : Si la concentration optimale d’anticorps pour la fluorescence immunitaire n’est pas déclarée par le fabricant, le titrage préalable des anticorps doit être effectué sur les sections témoins en utilisant des concentrations variables (p. ex., 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Lavez doucement les sections trois fois avec pbS pour éliminer l’anticorps primaire non lié.
- Incuber du tissu avec 1:1000 anticorps secondaires Alexa Fluor pertinents dans le PBS pendant la nuit à RT pendant 2 h.
- Lavez doucement le tissu pendant 5 min dans le PBS trois fois pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires non liés.
- Montez les diapositives avec un support de montage contenant du DAPI et séchez les diapositives dans l’obscurité à RT.
- Imagez les sections à l’aide d’un microscope à fluorescence.
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Representative Results
La génération de SCAD peut être séparée en trois étapes essentielles: la récolte de la peau de souris P0-P1, la génération de poinçons de biopsie de pleine épaisseur et la culture ultérieure de scads individuels jusqu’à 5 jours dans des plaques de 96 puits. En tant que lecture, ce test peut en outre être appliqué pour analyser les aspects spatiaux et temporels de la cicatrisation. L’analyse spatiale utilise le marquage immunitaire 2D et 3D des tissus pour étudier la localisation spatiale des composants cellulaires et matriciels dans le développement du tissu cicatriciel. Les études spatio-temporelles permettent de visualiser ces cicatrices ex situ à l’aide de protéines fluorescentes intrinsèques ou extrinsèques tissulaires qui peuvent être visualisées à l’aide de modalités d’imagerie time-lapse 3D pertinentes.
Les étapes pivots de ce test sont la mise en place de l’expérience en générant soigneusement des poinçons de biopsie de pleine épaisseur, en assurant la présence d’une couche de « gelée » fasciale et en cultivant le tissu complètement immergé à l’envers (épiderme face au fond des plaques de 96 puits). Cela permet le développement de cicatrices uniformes, une dynamique de migration comparable des populations de fibroblastes pertinentes et une contraction de la peau entre les SCAD (Figure 1A). La polyvalence du test SCAD permet de prélever le tissu sur tout le spectre du développement des cicatrices. Par exemple, si le but de l’expérience est d’étudier la dynamique précoce de la cicatrisation, l’analyse spatiale et spatio-temporelle peut être limitée à D1 ou D2 de la culture SCAD (Figure 1B).
Des images représentatives en plein champ lumineux des SCAD au jour 0 et au jour 5 sont présentées à la Figure 2A et à la Figure 2A', respectivement. Pour l’analyse 2D, il est essentiel d’intégrer les SCAD dans l’OCT dans une orientation perpendiculaire dépourvue de bulles d’air pour assurer l’intégrité des tissus après sectionnement. Ces coupes tissulaires peuvent en outre être soumises à une analyse histologique (p. ex., coloration trichrome masson -Figure 2B,2B') ou coloration par immunofluorescence (Figure 2C,2C') sur les cryosections du derme dorsal de souris En1 Cre,R26mTmG; EPF en vert et ENF en rouge à partir de la cicatrice précoce (Figure 2D) et à un stade avancé (Figure 2D').
L’imagerie accélérée 3D et 3D des cicatrices nécessite la détection de signaux de fluorescence profondément à l’intérieur du tissu (400-800 μm). L’excitation dans les longueurs d’onde proche infrarouge à l’aide de l’excitation à deux photons permet de telles mesures sans avoir besoin de nettoyage des tissus, une méthodologie couramment utilisée en imagerie 3D pour rendre les tissus transparents en minimisant la diffusion et l’absorption de la lumière 15,16,17. Nous avons utilisé un microscope multiphoton vertical équipé d’un objectif de trempage d’eau 25x en combinaison avec un laser accordable. Les tissus ont été soumis à une coloration immunitaire 3D à l’aide de sondes pertinentes. Pour l’imagerie 3D, le tissu a été incorporé dans une solution d’agarose à faible fusion à 2 % pour immobiliser ou empêcher la dérive dans les tissus (figure 3A) surmontée de PBSGT pour correspondre à l’indice de réfraction requis pour l’objectif d’immersion dans l’eau. L’image représentative de la figure 3B et de la figure 3B montre la localisation exclusive de la protéine N-cadhérine (rose/magenta-Alexa fluor 647) sur le site cicatriciel d’un jour 5 SCAD à partir d’une peau arrière En1 Cre,R26mTmG; EPF en vert et ENF en rouge. Pour l’imagerie time-lapse 3D, une légère modification a été apportée à la configuration ci-dessus en intégrant le tissu dans une solution d’agarose à faible fusion à 2% surmontée d’un milieu DMEM / F12 sans indicateur de rouge phénol au lieu de PBS. Afin d’assurer de bonnes conditions pour le tissu SCAD « vivant » pendant l’imagerie, une chambre d’incubation appropriée a été ajoutée afin que tous les phénotypes soient correctement enregistrés pendant l’imagerie (Figure 3C). Des instantanés représentatifs des premiers essaims de fibroblastes sont montrés dans la figure 3D, la figure 3D' et la figure 3D'' au cours des 12 premières heures/premiers stades du développement de la cicatrice.
Figure 1 : Flux de travail schématique du test SCAD. (A) La peau arrière du jour postnatal 0 / jour 1 les petits sont excisés, assurant l’intégrité tissulaire contenant les couches dermiques suivantes: épiderme (E), derme papillaire et réticulaire (et RD) et couche de fascia (F) suivie de poinçons de biopsie de 2 mm pour obtenir des SCADs de jour 0. (B) Les SCAD peuvent ensuite être cultivés jusqu’à 5 jours avec une étape facultative de récolte intermittente / fixation tissulaire basée sur la nature des expériences individuelles (flèches pointillées) avec une étape de changement de milieu de culture les jours 2 et 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Coloration par immunofluorescence 2D. Lectures 2D représentatives pour étudier les cicatrices précoces et tardives à l’aide d’une image en monture entière en champ lumineux (A et A') au jour 0 (A) et au jour 5 (A'). (B et B') Coloration trichrome par Masson des coupes tissulaires verticales pour révéler les signatures de la contraction tissulaire cicatricielle et de l’accumulation d’ECM au niveau du noyau cicatriciel (triangle rempli jaune) au jour 0 (B) et au jour 5 (B'). (C et C') Analyse d’immunofluorescence des SCAD du jour 0 (C) et du jour 5 (C') générés à partir de la peau arrière En1 Cre,R26mTmG. Les EPF sont représentés en vert, ENF en rouge et DAPI en bleu à partir de la cicatrice précoce (D) et tardive (D'). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Configuration schématique et lectures représentatives des SCAD pour l’analyse spatio et spatio-temporelle 3D. (A) Représentation schématique de l’intégration des SCAD dans un gel d’agarose à basse température de fusion à 2 % sous un microscope fluorescent vertical et (B) image représentative d’un jour 5 coloré immunofluorescent 3D SCAD généré à partir de En1 Cre,R26mTmG derme de souris et immunocoloré avec l’anticorps N-Cadhérine (Magenta). Les EPF sont indiqués en vert et les ENF en rouge. (C) Représentation schématique Installation SCAD d’imagerie 3D équipée d’une chambre d’incubation : 37 °C, 21 % (v/v) d’oxygène, 5 % (v/v) de C02 et 95 % d’humidité. (D) Résultats représentatifs de l’imagerie en direct montrant des événements précoces de progression des essaims de fibroblastes (cercle pointillé blanc) au cours des 12 premières heures du jour 0 et du jour 1 du stade SCAD. (E) Représentation graphique des trajectoires cellulaires unicellulaires suivies de fibroblastes individuels à D, D’et D''. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Plusieurs modèles ont déjà été développés pour comprendre la formation de cicatrices après une blessure. Bien que de nombreux progrès aient été réalisés à cet égard, les mécanismes réels ne sont toujours pas clairs. Contrairement à la technique précédente, le modèle SCAD intègre tous les types de cellules et les couches cutanées, maintenant ainsi la complexité de la peau native18,19. Cette méthodologie est capable de générer des ensembles de données fondamentaux qui sont importants pour comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent à la formation de cicatrices. Le test est conçu d’une manière simple, minimaliste, mais capable de produire des lectures fondamentales et fonctionnelles qui sont cruciales pour comprendre la migration des fibroblastes, le dépôt ECM, la contraction épidermique / musculaire13,14. Il est relativement moins complexe que les configurations in vivo et les écarts par rapport à l’échantillon peuvent être minimisés. De plus, ce test peut être facilement couplé à des pipelines d’analyse à haut débit. Dans lequel tout le spectre ou les bibliothèques d’inhibiteurs ou d’activateurs tels que les composés chimiques, les anticorps neutralisants, le siRNA ou les méthodologies virales qui réduisent ou favorisent la cicatrisation pourraient être appliqués avec une relative facilité à des quantités minimales de tissus excisés. En ce qui concerne la limitation de ce modèle de cicatrice ex vivo, ce test ne peut pas être appliqué pour étudier les aspects phénotypiques ou dynamiques de a) essaims immunitaires non résidents dans le développement de cicatrices b) vascularisation c) maturation cicatricielle car le tissu n’est pas viable au-delà de 5 jours après la blessure.
Avant que la biopsie ne frappe l’excision, il est important qu’il ne reste pas de sang résiduel dans le tissu, car cela pourrait interférer avec le déroulement de l’expérience. Nous recommandons de laver le tissu plus d’une fois avec HBSS si nécessaire, pour s’assurer que tout sang résiduel du tissu est éliminé. En outre, le changement de média un jour sur deux doit être effectué avec un soin particulier, car les couches dermique et épidermique peuvent se séparer en raison de la petite taille du tissu. Par conséquent, il est impératif de pratiquer la procédure correctement à l’avance avant de commencer des expériences réelles. Pour éviter la séparation répétée des couches tissulaires, nous suggérons que lors du changement de milieu, 10 μl de milieu résiduel puissent être conservés avant d’être remplacés par des milieux frais afin de stabiliser le tissu et de minimiser le changement de tension superficielle sur le tissu causé par le milieu ajouté au puits.
Pour les pipelines d’analyse 2D, nous recommandons d’équilibrer le tissu avec le composé de température de coupe optimale du liquide à température ambiante pendant quelques minutes avant de monter le tissu dans un bloc. Cela empêche la séparation des tissus due à la formation de cristaux de glace pendant le sectionnement. Les pipelines d’imagerie time-lapse 3D/3D doivent être modifiés de manière adéquate en fonction de la modalité de microscope disponible. Pour un microscope vertical (avec ou sans objectif d’immersion dans l’eau), l’incorporation du tissu dans l’agarose ou l’utilisation de superglue empêche le déplacement physique du tissu pendant l’imagerie. Les objectifs d’immersion dans l’eau permettent une imagerie time-lapse 3D/3D utilisant du PBS ou des milieux incolores (sans rouge phénol). Pour un microscope inversé, le tissu pourrait être placé sur un fond de verre / plaque d’imagerie et immobilisé à l’aide d’une goutte d’agarose à basse température de fusion et surmonté d’un support approprié pour assurer la viabilité pendant l’imagerie en direct. Dans les deux modalités, un système d’incubation compatible peut être utilisé pour assurer la bonne température, l’humidité et l’alimentation en gaz pendant l’imagerie.
En conclusion, le modèle SCAD permet l’identification et la caractérisation de nouveaux indices moléculaires et voies mécanistes impliqués dans la cicatrisation des plaies des mammifères13,14. Le protocole fournit une description détaillée de la génération de SCAD et des applications et analyses potentielles en aval pour fournir un aperçu du développement des cicatrices.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions tous les co-auteurs de Jiang et al. 2020 pour avoir contribué au développement de la méthodologie SCAD13. Nous remercions le Dr Steffen Dietzel et l’installation centrale de bioimagerie de la Ludwig-Maximilans-Universität pour leur accès au système Multiphoton. Y.R. a été soutenu par la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), la subvention Consolidator du Conseil européen de la recherche (ERC-CoG 819933) et la Fondation LEO (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
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