Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines Haut-Faszien-Explantats, das als "SCar-ähnliches Gewebe in einer Schale" oder SCAD bezeichnet wird. Dieses Modell ermöglicht eine beispiellose Visualisierung einzelner Fibroblasten während der Narbenbildung.
Abstract
Die globale Reaktion von Säugetieren auf die Versiegelung tiefer Gewebewunden erfolgt durch Narbenbildung und Gewebekontraktion, vermittelt durch spezialisierte Faszienfibroblasten. Trotz der klinischen Bedeutung der Narbenbildung und der gestörten Wundheilung ist unser Verständnis der Faszienfibroblastendynamik in der Wundheilung aufgrund des Fehlens relevanter Assays, die eine direkte Visualisierung der Fibroblastenchoreografie und -dynamik in komplexen Umgebungen wie in Hautwunden ermöglichen, oberflächlich. Dieses Papier stellt ein Protokoll zur Erzeugung von Ex-situ-Hautnarben mit SCAD oder "SCar-ähnlichem Gewebe in A Dish" vor, die die komplexe Umgebung von Hautwunden nachahmen. Bei diesem Assay wird 2 mm dicke Haut 5 Tage lang in Medien ausgeschnitten und auf den Kopf gestellt, wobei sich Narben und Hautkontrakturen gleichmäßig entwickeln. Diese Methodik, gepaart mit fibroblastenlinienspezifischen transgenen Mausmodellen, ermöglicht die Visualisierung einzelner Fibroblastenlinien über den gesamten Wundreparaturprozess hinweg. Insgesamt hilft dieses Protokoll den Forschern, grundlegende Prozesse und Mechanismen der Wundreparatur zu verstehen und die Auswirkungen von Modulatoren auf die Wundheilungsergebnisse direkt zu untersuchen.
Introduction
Wundheilung ist ein Prozess der Wiederherstellung von gebrochenen Wunden. Gewebeverletzungen bei Wirbellosen führen zu einer teilweisen oder vollständigen Regeneration. Im Gegensatz dazu reagieren Säugetiere auf tiefe Verletzungen durch Narbenbildung, ein Prozess, der darauf zugeschnitten ist, Wunden schnell mit dichten Pfropfen aus Matrixfasern zu versiegeln, die den durchbrochenen Bereich minimieren und gleichzeitig die verletzte Stelle dauerhaft verformen 1,2,3. Große Hautverbrennungen oder tiefe offene Wunden bei Säugetieren führen zu pathologischen Phänotypen wie hypertrophen oder keloiden Narben 4,5. Diese überschwänglichen Narben verursachen eine enorme Belastung für die klinischen und globalen Gesundheitssysteme. Allein in den USA kostet das Narbenmanagement jährlichetwa 10 Milliarden US-Dollar 6,7. Daher ist die Entwicklung relevanter Methoden erforderlich, um die grundlegenden Prozesse und Mechanismen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, besser zu verstehen.
In den letzten Jahren hat eine breite Palette von Studien an Mäusen heterogene Fibroblastenpopulationen mit unterschiedlichen funktionellen Potenzen basierend auf ihrer Herkunft an bestimmten Hautstellengezeigt 8,9,10. In der Rückenhaut identifizierten Rinkevich et al., 2015, dass eine spezifische Fibroblastenpopulation mit einer frühen embryonalen Expression von Engrailed-1 (En1), genannt EPF (Engrailed positive Fibroblast), zur kutanen Narbenbildung bei der Wunde beiträgt. Umgekehrt trägt eine andere Fibroblastenlinie ohne Geschichte der engrailed expression, Engrailed negative fibroblast (ENF), nicht zur Narbenbildungbei 8. Die Schicksalskartierung dieser En1-Linien unter Verwendung von Cre-gesteuerten transgenen Mauslinien, die zu Fluoreszenzreporter-Mauslinien wie R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) gekreuzt wurden, ermöglicht die Visualisierung von EPF- und ENF-Populationen.
Die Untersuchung der Fibroblastenmigration in vivo über mehrere Tage ist durch ethische und technische Einschränkungen begrenzt. Darüber hinaus sind zusammengesetzte, virale und neutralisierende Antikörperbibliotheks-Screens zur Modulation von Signalwegen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, technisch eine Herausforderung. Zuvor verwendete In-vitro- oder Ex-vivo-Modelle sind nicht in der Lage, die Migration von Fibroblasten und die Narbenbildung in echten Hautmikroumgebungen, die Gleichmäßigkeit der Narbenentwicklung sowie die Gewebekomplexität, die in vivo-Hautumgebungen emuliert, zu visualisieren 11,12. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Ex-vivo-Narbenuntersuchungsassay namens SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14 entwickelt. Dieser einfache Assay kann durchgeführt werden, indem 2 mm dicke Haut, die die Epidermis, die Dermis und die subkutanen Faszienregionen enthält, entfernt und in serumergänzten DMSO-Medien für bis zu 5 Tage kultiviert werden. Narben, die durch SCAD erzeugt werden, replizieren zuverlässig transkriptomische und proteomische Merkmale von In-vivo-Narben. Darüber hinaus ermöglichen SCADs, die aus relevanten transgenen Mauslinien (z. B. En1-Mäusen) erzeugt werden, die mit fluoreszierenden Reporter-Mauslinien gekreuzt sind, die Visualisierung der Migrationsdynamik und Narbenentwicklung von Fibroblasten mit einer beispiellosen Auflösung. Darüber hinaus kann dieses Modell leicht an alle Anwendungen mit hohem Durchsatz angepasst werden (z. B. Substanzbibliothek, Antikörperbibliothek oder virales Screening)13,14. In diesem Artikel beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SCADs und nachgelagerten Verarbeitungsanwendungen zur Untersuchung der Zell- und Matrixdynamik bei der Narbenentwicklung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das unten vorgestellte Modell bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Generierung des SCAD-Assays, wie in Jiang et al., 202013, kurz beschrieben. SCAD-Probenvorbereitungen wurden nach der Opferung der Tiere gemäß den internationalen und der Regierung von Oberbayern durchgeführt. Tiere wurden in der Tieranlage des Helmholtz-Zentrums München untergebracht. Die Räume wurden mit optimaler Luftfeuchtigkeit und konstanter Temperatur mit einem Lichtzyklus von 12 h gepflegt. Die Tiere wurden ad libitum mit Futter und Wasser versorgt.
1. SCAD-Gewebepräparation
- Opfern Sie neugeborene Welpen ampostnatalen Tag 0 oder Tag 1 (P0 oder P1).
- Entfernen Sie vorsichtig mindestens 1,5 cm x 1,5 cm dicke dorsale Rückenhaut bis zur Skelettmuskelschicht mit einem sterilen chirurgischen Skalpell.
- Schälen Sie die Haut mit sterilen gekrümmten Pinzetten und stellen Sie sicher, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus intakt ist.
- Waschen Sie das ausgeschnittene Gewebe mit 50-100 ml kalten DMEM/F-12-Medien, um kontaminierendes Blut zu entfernen.
- Einmal mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) waschen, um die Lebensfähigkeit von Gewebe und Zellen zu erhalten.
- Die Haut kopfüber (oberflächliche Faszie oben) in eine 10 cm große Petrischale mit DMEM/F12-Medien geben.
- Schneiden Sie mit einem Einweg-2-mm-Biopsiestempel runde Hautstücke in voller Dicke aus, um sicherzustellen, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus bis zur Epidermis intakt ist, um SCAD-Gewebe zu erzeugen.
- Bereiten Sie 200 μL DMEM/F12 (ohne Phenolrot) komplette Medien-DMEM/F12-Medien vor und füllen Sie sie mit 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1x Penicillin/Streptomycin in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
- Verwenden Sie sterile Pinzetten, übertragen und tauchen Sie vorsichtig einzelnes SCAD-Gewebe kopfüber (Faszie nach oben) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
- Überführung der Platte in einen Zellkulturinkubator, der unter Standardbedingungen (37 °C, 21 %(v/v) Sauerstoff, 5 % (v/v) C02 und 95 % Luftfeuchtigkeit) gewartet wird.
2. SCAD - Gewebekultur
- Kultur-SCADs in einem Inkubator für bis zu 5 Tage.
- Ersetzen Sie an Tag 2 und Tag 4 der Kultur die Medien durch 200 μl frische, vorgewärmte DMEM/F12-Vollmedien, um die Lebensfähigkeit von Zellen und Geweben weiterhin zu gewährleisten. Ersetzen Sie die Behandlungsverbindungen bei jedem Medienwechsel.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie 10 μL Medien im Brunnen belassen, um zu vermeiden, dass Gewebe an den Vertiefungen haftet. - Bereiten Sie SCADs für die folgenden Experimente vor: Lebendbildgebung (Abschnitt 3) und Gewebeentnahme und 2D/3D-Immunfluoreszenzfärbung (Abschnitt 4).
3. Live-Imaging von SCADs
- Bereiten Sie mindestens 30 ml 2%-3% (w/v) niedrig schmelzende Agaroselösung in PBS in einer Glasflasche vor, indem Sie sie in einer Mikrowelle bis zum Kochen erhitzen.
- Sofort die Flasche umfüllen und die flüssige Agaroselösung in einem 40 °C warmen Wasserbad abkühlen.
- Übertragen Sie das SCAD-Gewebe mit Faszien / Narben nach oben auf die Mitte einer 35-mm-Schale.
- Betten Sie das SCAD bei Raumtemperatur (RT) ein, indem Sie mit einer Pasteur-Pipette langsam 40 °C flüssige Agarose auf die 35-mm-Schale übertragen. Agarose polymerisiert innerhalb von 2 min.
- Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes DMEM/F12-Komplettmedium hinzu (ohne Phenolrot-Indikator).
- Erfassen Sie Zeitrafferbilder von Tag 0 SCADs bis zu 48 h mit einem konfokalen oder einem Multiphotonenmikroskop, das mit einem geeigneten Inkubationssystem ausgestattet ist, das auf 37 °C, 21% (v/v) Sauerstoff, 5% (v/v) C02 und 95% Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.
4. Gewebeentnahme und 2D/3D-Immunfluoreszenzfärbung
- Waschen Sie die Taschentücher zu relevanten Zeitpunkten, indem Sie die Medien durch steriles PBS ersetzen.
- Übertragen Sie einzelne SCADS vorsichtig mit steriler Pinzette auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 500 μL 2% Paraformaldehyd enthalten, um das Gewebe über Nacht bei 4 °C zu fixieren.
- Waschen Sie die Taschentücher dreimal mit PBS und fahren Sie mit der 2D / 3D-Immunfluoreszenzfärbung fort.
- 3D-Immunfluoreszenzfärbung
- Permeabilisieren Sie das Gewebe durch Inkubation in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL PBS, ergänzt mit 0,2% Gelatine, 0,5% Triton-X100 und 0,01% Thimerosal (PBSGT) bei RT für 24 h.
- Bereiten Sie eine ausreichende Menge an primären Antikörpern gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und inkubieren Sie SCAD-Gewebe in 150 μL PBSGT-Lösung für 24 Stunden bei RT.
HINWEIS: Wenn der Hersteller nicht die optimale Antikörperkonzentration für die Immunfluoreszenz angibt, muss eine vorherige Antikörpertitration an Kontrollgeweben mit unterschiedlichen Konzentrationen (z. B. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000) durchgeführt werden. - Waschen Sie die SCADs dreimal vorsichtig mit PBS, um den ungebundenen primären Antikörper zu entfernen.
- Inkubieren Sie Gewebe mit 1:1000 relevanten Alexa Fluor Sekundärantikörpern in PBS über Nacht bei RT.
- Waschen Sie das Gewebe 30 Minuten lang dreimal vorsichtig in PBS, um überschüssige ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
- Übertragen Sie das Gewebe auf eine 35 mm Glasbodenschale für konfokale oder Multiphotonen-Bildgebung.
HINWEIS: Wenn Sie Wassertauchobjektive verwenden, betten Sie die SCADs in 2 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ein, um das Gewebe zu immobilisieren und ein Abdriften während der Bildaufnahme zu verhindern.
- 2D-Immunfluoreszenzfärbung
- Überführen Sie das Gewebe in eine Kryoform und füllen Sie es vorsichtig mit einer optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT), um das Gewebe vollständig einzutauchen.
- Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes vorsichtig ein und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind, um einen Querschnitt oder einen vertikalen Schnitt zu erhalten.
- Legen Sie die Form für 20-30 min auf Trockeneis und inkubieren Sie den Block bei -80 °C über Nacht.
- Stellen Sie die Blatttemperatur auf -25 °C und die Probenblocktemperatur auf -17 °C ein. Bereiten Sie den 6-μm-Kryoschnitt mit einem Kryostaten vor, geben Sie die Abschnitte auf einen Haftobjektträger und lagern Sie die Objektträger in einem Gefrierschrank von -20 °C.
- Spülen Sie die Objektträger dreimal in PBS und inkubieren Sie die Objektträger in 5% Rinderserumalbumin (BSA) w/v in PBST (PBS ergänzt mit 0,05% Tween) für 1 h.
- Eine geeignete Menge primärer Antikörper zu 150 μl PGST geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren
HINWEIS: Wenn der Hersteller nicht die optimale Antikörperkonzentration für die Immunfluoreszenz angibt, muss eine vorherige Antikörpertitration an Kontrollabschnitten mit unterschiedlichen Konzentrationen (z. B. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000) durchgeführt werden. - Waschen Sie die Abschnitte dreimal vorsichtig mit PBS, um den ungebundenen primären Antikörper zu entfernen.
- Inkubieren Sie Gewebe mit 1:1000 relevanten Alexa Fluor Sekundärantikörpern in PBS über Nacht bei RT für 2 h.
- Waschen Sie das Gewebe vorsichtig für 5 Minuten in PBS dreimal, um überschüssige ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
- Montieren Sie die Dias mit einem DAPI-haltigen Montagemedium und trocknen Sie die Dias im Dunkeln bei RT.
- Bilden Sie die Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Generierung von SCADs kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden: Ernte der Rückenhaut von P0-P1-Mäusen, Erzeugung von Biopsiestempeln in voller Dicke und anschließende Kultur einzelner Scads bis zu 5 Tage in 96-Well-Platten. Als Auslesung kann dieser Assay weiter angewendet werden, um die räumlichen und zeitlichen Aspekte der Narbenbildung zu analysieren. Die räumliche Analyse verwendet 2D- und 3D-Immunmarkierung von Geweben, um die räumliche Lokalisation von Zell- und Matrixkomponenten innerhalb des sich entwickelnden Narbengewebes zu untersuchen. Raumzeitliche Studien ermöglichen die Visualisierung dieser Ex-situ-Narben unter Verwendung von gewebeintrinsischen oder extrinsischen fluoreszierenden Proteinen, die mit relevanten 3D-Zeitraffer-Bildgebungsmodalitäten visualisiert werden können.
Die entscheidenden Schritte in diesem Assay sind die Einrichtung des Experiments durch sorgfältige Erzeugung von Biopsiestempeln in voller Dicke, die Sicherstellung des Vorhandenseins einer faszialen "Gelee" -Schicht und die Kultivierung des vollständig auf den Kopf gestellten Gewebes (Epidermis mit Blick auf den Boden der 96-Well-Platten). Dies ermöglicht die Entwicklung einheitlicher Narben, vergleichbare Migrationsdynamiken relevanter Fibroblastenpopulationen und Hautkontraktion über SCADs hinweg (Abbildung 1A). Die Vielseitigkeit des SCAD-Assays ermöglicht die Ernte des Gewebes über das gesamte Spektrum der Narbenentwicklung. Wenn das Ziel des Experiments beispielsweise darin besteht, die frühe Dynamik der Narbenbildung zu untersuchen, kann die räumliche und räumlich-zeitliche Analyse auf D1 oder D2 der SCAD-Kultur beschränkt werden (Abbildung 1B).
Repräsentative Ganzkörper-Hellfeldbilder von SCADs an Tag 0 und Tag 5 sind in Abbildung 2A bzw. Abbildung 2A' dargestellt. Für die 2D-Analyse ist es wichtig, die SCADs in OCT in senkrechter Ausrichtung ohne Luftblasen einzubetten, um die Intaktheit des Gewebes nach dem Schneiden sicherzustellen. Diese Gewebeschnitte können außerdem einer histologischen Analyse (z. B. Masson trichrome Färbung - Abbildung 2B, 2B') oder einer Immunfluoreszenzfärbung (Abbildung 2C, 2C') an den Kryoabschnitten von En1Cre, R26mTmG Maus-Rückendermis unterzogen werden; EPF in Grün und ENF in Rot ab Früh- (Abbildung 2D) und Narbe im Spätstadium (Abbildung 2D').
Die 3D- und 3D-Zeitrafferbildgebung von Narben erfordert die Erkennung von Fluoreszenzsignalen tief im Inneren des Gewebes (400-800 μm). Die Anregung in Wellenlängen im nahen Infrarot unter Verwendung der Zwei-Photonen-Anregung ermöglicht solche Messungen, ohne dass eine Gewebereinigung erforderlich ist, eine Methodik, die häufig in der 3D-Bildgebung verwendet wird, um Gewebe durch Minimierung der Lichtstreuung und -absorption transparent zu machen15,16,17. Wir verwendeten ein aufrechtes Multiphotonenmikroskop, das mit einem 25-fachen Wassertauchobjektiv in Kombination mit einem abstimmbaren Laser ausgestattet war. Gewebe wurden mit relevanten Sonden einer 3D-Immunfärbung unterzogen. Für die 3D-Bildgebung wurde das Gewebe in eine 2% niedrig schmelzende Agaroselösung eingebettet, um die Drift im Gewebe zu immobilisieren oder zu verhindern (Abbildung 3A), die mit PBSGT überzogen ist, um dem für das Wassertauchziel erforderlichen Brechungsindex zu entsprechen. Repräsentatives Bild in Abbildung 3B und Abbildung 3B' zeigt die exklusive Lokalisation des N-Cadherin-Proteins (rosa/magenta-Alexa fluor 647) an der Narbenstelle eines Tag 5 SCAD aus einer En1 Cre,R26mTmG Rückenhaut; EPF in Grün und ENF in Rot. Für die 3D-Zeitrafferbildgebung wurde eine leichte Modifikation des obigen Aufbaus vorgenommen, indem das Gewebe in eine 2% niedrig schmelzende Agaroselösung eingebettet wurde, die mit DMEM / F12-Medien ohne Phenolrotindikator anstelle von PBS belegt war. Um die richtigen Bedingungen für "lebendes" SCAD-Gewebe während der Bildgebung zu gewährleisten, wurde eine geeignete Inkubationskammer hinzugefügt, damit alle Phänotypen während der Bildgebung korrekt erfasst werden (Abbildung 3C). Repräsentative Momentaufnahmen früher Fibroblastenschwärme sind in Abbildung 3D, Abbildung 3D' und Abbildung 3D'' über die ersten 12 h/frühen Stadien der Narbenentwicklung dargestellt.
Abbildung 1: Schematischer Ablauf des SCAD-Assays. (A) Rückenhaut von postnatalen Tag 0 / Tag 1 Welpen werden entfernt, um die Gewebeintegrität zu gewährleisten, die die folgenden Hautschichten enthält: Epidermis (E), papilläre und retikuläre Dermis (PD und RD) und Faszienschicht (F), gefolgt von 2-mm-Biopsiestanzen, um Tag 0 SCADs zu erhalten. (B) SCADs können dann anschließend für bis zu 5 Tage mit einem optionalen intermittierenden Ernte-/Gewebefixierungsschritt kultiviert werden, der auf der Art der einzelnen Experimente (gepunktete Pfeile) mit einem Kulturmedienwechselschritt am Tag 2 und Tag 4 basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: 2D-Immunfluoreszenzfärbung. Repräsentative 2D-Auslesungen zur Untersuchung von Narben im Früh- und Spätstadium mit (A und A') Hellfeld-Ganzkörperbild an Tag 0 (A) und Tag 5 (A'). (B und B') Massons trichrome Färbung vertikaler Gewebeabschnitte, um Signaturen der Gewebenarben-Gewebekontraktion und Akkumulation von ECM am Narbenkern (gelb gefülltes Dreieck) am Tag 0 (B) und Tag 5 (B') zu zeigen. (C und C') Immunfluoreszenzanalyse von Tag 0 (C) und Tag 5 (C') SCADs, die aus En1 Cre,R26mTmG Rückenhaut generiert wurden. EPFs werden in Grün, ENF in Rot und DAPI in Blau von der Narbe im frühen (D) und späten Stadium (D') angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Schematischer Aufbau und repräsentative Auslesungen von SCADs für die räumliche und raumzeitliche 3D-Analyse. (A) Schematische Darstellung der Einbettung der SCADs in 2% Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur unter einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop und (B) repräsentatives Bild eines 3D-immunfluoreszierenden gefärbten Tag 5 SCAD, generiert aus En1 Cre,R26mTmG Mausdermis und immungefärbt mit N-Cadherin-Antikörper (Magenta). EPFs werden grün und ENFs rot angezeigt. (C) Schematische Darstellung 3D-Bildgebung SCAD-Setup mit einer Inkubationskammer ausgestattet: 37 °C, 21% (v/v) Sauerstoff, 5% (v/v) C02 und 95% Luftfeuchtigkeit. (D) Repräsentative Ergebnisse der Live-Bildgebung, die frühe Ereignisse des Fortschreitens von Fibroblastenschwärmen (weiß gestrichelter Kreis) in den ersten 12 Stunden des SCAD-Stadiums von Tag 0 und Tag 1 zeigen. (E) Grafische Darstellung von einzelzellverfolgten zellulären Trajektorien einzelner Fibroblasten bei D, D' und D''. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mehrere Modelle wurden bereits entwickelt, um die Narbenbildung nach Verletzungen zu verstehen. Während in dieser Hinsicht viele Fortschritte erzielt wurden, sind die tatsächlichen Mechanismen noch nicht klar. Im Gegensatz zur bisherigen Technik bezieht das SCAD-Modell alle Zelltypen und Hautschichten mit ein, wodurch die Komplexität der nativen Haut18,19 erhalten bleibt. Diese Methodik ist in der Lage, grundlegende Datensätze zu generieren, die für das Verständnis molekularer Mechanismen, die die Narbenbildung vorantreiben, wichtig sind. Der Assay ist einfach, minimalistisch und dennoch in der Lage, grundlegende und funktionelle Messwerte zu erzeugen, die für das Verständnis der Fibroblastenmigration, der ECM-Ablagerung und der epidermalen / Muskelkontraktion von entscheidender Bedeutung sind13,14. Es ist relativ weniger komplex als In-vivo-Setups, und Abweichungen in Bezug auf die Probe können minimiert werden. Darüber hinaus kann dieser Assay leicht mit Analysepipelines mit hohem Durchsatz gekoppelt werden. Dabei könnten das gesamte Spektrum oder die Bibliotheken von Inhibitoren oder Aktivatoren wie chemische Verbindungen, neutralisierende Antikörper, siRNA oder virale Methoden, die die Narbenbildung reduzieren oder fördern, relativ einfach auf minimale Mengen an ausgeschnittenem Gewebe angewendet werden. In Bezug auf die Einschränkung dieses Ex-vivo-Narbenmodells kann dieser Assay nicht angewendet werden, um phänotypische oder dynamische Aspekte von a) nicht residenten Immunschwärmen in der Narbenentwicklung b) Vaskularisierung c) Narbenreifung zu untersuchen, da Gewebe über 5 Tage nach der Verletzung hinaus nicht lebensfähig ist.
Bevor die Biopsie die Exzision stanzt, ist es wichtig, dass kein Restblut im Gewebe verbleibt, da dies den Ablauf des Experiments beeinträchtigen könnte. Wir empfehlen, das Gewebe bei Bedarf mehr als einmal mit HBSS zu waschen, um sicherzustellen, dass Reste von Blut aus dem Gewebe entfernt werden. Auch der Medienwechsel an wechselnden Tagen muss mit besonderer Sorgfalt durchgeführt werden, da sich die Haut- und Epidermisschichten aufgrund der geringen Größe des Gewebes trennen können. Daher ist es unerlässlich, das Verfahren im Voraus richtig zu üben, bevor Sie mit den eigentlichen Experimenten beginnen. Um eine wiederholte Trennung der Gewebeschichten zu vermeiden, empfehlen wir, dass während des Medienwechsels 10 μl Restmedien aufbewahrt werden können, bevor sie durch frische Medien ersetzt werden, um das Gewebe zu stabilisieren und die Änderung der Oberflächenspannung auf dem Gewebe zu minimieren, die durch die dem Bohrloch hinzugefügten Medien verursacht wird.
Für 2D-Analysepipelines empfehlen wir, das Gewebe einige Minuten lang mit einer flüssigen optimalen Schnitttemperaturverbindung bei Raumtemperatur auszugleichen, bevor das Gewebe in einem Block montiert wird. Dies verhindert die Gewebetrennung durch Eiskristallbildung während der Schnittarbeit. 3D/3D-Zeitraffer-Bildgebungspipelines sollten auf der Grundlage der verfügbaren Mikroskopmodalität angemessen modifiziert werden. Bei einem aufrechten Mikroskop (mit oder ohne Wassertauchobjektiv) verhindert die Einbettung des Gewebes in Agarose oder die Verwendung von Sekundenkleber die physische Verschiebung des Gewebes während der Bildgebung. Wassertauchobjektive ermöglichen 3D/3D-Zeitraffer-Bildgebung mit PBS oder farblosen Medien (ohne Phenolrot). Für ein inverses Mikroskop könnte das Gewebe auf eine Glasboden-/Bildplatte gelegt und mit einem Tropfen Agarose mit niedriger Schmelztemperatur immobilisiert und mit geeigneten Medien belegt werden, um die Lebensfähigkeit während der Live-Bildgebung zu gewährleisten. In beiden Modalitäten kann ein kompatibles Inkubationssystem verwendet werden, um die richtige Temperatur, Feuchtigkeit und Gasversorgung während der Bildgebung sicherzustellen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das SCAD-Modell die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger molekularer Hinweise und mechanistischer Signalwege ermöglicht, die an der Wundheilung von Säugetieren beteiligt sind13,14. Das Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Generierung von SCADs und potenzieller nachgelagerter Anwendungen und Analysen, um einen Einblick in die Narbenentwicklung zu geben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken allen Co-Autoren von Jiang et al. 2020 für ihren Beitrag zur Entwicklung der SCAD-Methodik13. Wir danken Dr. Steffen Dietzel und der Bioimaging Core Facility der Ludwig-Maximilans-Universität für den Zugang zum Multiphotonensystem. Y.R. wurde gefördert durch die Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), den European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) und die LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
