Summary
Questo protocollo descrive la generazione di un espianto della fascia cutanea chiamato "SCar like tissue in A Dish" o SCAD. Questo modello consente una visualizzazione senza precedenti di singoli fibroblasti durante la formazione di cicatrici.
Abstract
La risposta globale dei mammiferi alla sigillatura delle ferite dei tessuti profondi è attraverso la formazione di cicatrici e la contrazione dei tessuti, mediata da fibroblasti della fascia specializzati. Nonostante il significato clinico della formazione di cicatrici e della compromissione della guarigione delle ferite, la nostra comprensione delle dinamiche dei fibroblasti della fascia nella guarigione delle ferite è superficiale a causa della mancanza di saggi pertinenti che consentano la visualizzazione diretta della coreografia e della dinamica dei fibroblasti in ambienti complessi come le ferite cutanee. Questo documento presenta un protocollo per generare cicatrici cutanee ex-situ utilizzando SCAD o "tessuto simile a SCar in A Dish" che emulano il complesso ambiente delle ferite cutanee. In questo test, la pelle a tutto spessore di 2 mm viene asportata e coltivata a testa in giù nei mezzi per 5 giorni, durante i quali cicatrici e contratture cutanee si sviluppano uniformemente. Questa metodologia, abbinata a modelli murini transgenici specifici per il lignaggio dei fibroblasti, consente la visualizzazione dei singoli lignaggi dei fibroblasti durante l'intero processo di riparazione della ferita. Nel complesso, questo protocollo aiuta i ricercatori a comprendere i processi e i meccanismi fondamentali della riparazione delle ferite, esplorando direttamente gli effetti dei modulatori sui risultati della guarigione delle ferite.
Introduction
La guarigione delle ferite è un processo di ripristino delle ferite violate. Le lesioni tissutali negli invertebrati provocano una rigenerazione parziale o completa. Al contrario, i mammiferi rispondono alle lesioni profonde con cicatrici, un processo su misura per sigillare rapidamente le ferite con densi tappi di fibre matriciali che riducono al minimo l'area violata e allo stesso tempo deformano permanentemente il sito ferito 1,2,3. Grandi ustioni cutanee o profonde ferite aperte nei mammiferi provocano fenotipi patologici come cicatrici ipertrofiche o cheloidi 4,5. Queste cicatrici esuberanti causano un enorme onere per i sistemi sanitari clinici e globali. Solo negli Stati Uniti, la gestione delle cicatrici costa circa $ 10 miliardi all'anno 6,7. Pertanto, è necessario lo sviluppo di metodologie pertinenti per comprendere meglio i processi e i meccanismi fundementali coinvolti nella formazione delle cicatrici.
Negli ultimi anni, una vasta gamma di studi sui topi ha rivelato popolazioni eterogenee di fibroblasti con potenze funzionali distinte in base alle loro origini in determinate località cutanee 8,9,10. Nella pelle della schiena, Rinkevich et al., 2015, hanno identificato che una specifica popolazione di fibroblasti con un'espressione embrionale precoce di Engrailed-1 (En1), chiamata EPF (engrailed positive fibroblast) contribuisce alle cicatrici cutanee sulla ferita. Al contrario, un altro lignaggio di fibroblasti senza storia di espressione engrailed, Engrailed negative fibroblast (ENF), non contribuisce alla formazione di cicatrici8. La mappatura del destino di questi lignaggi En1 utilizzando linee di topo transgenico guidate da Cre incrociate a linee di topo reporter a fluorescenza come R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) consente la visualizzazione delle popolazioni EPF ed ENF.
Lo studio della migrazione dei fibroblasti in vivo per diversi giorni è limitato da vincoli etici e tecnici. Inoltre, gli screening della libreria di anticorpi composti, virali e neutralizzanti per modulare i percorsi coinvolti nelle cicatrici sono tecnicamente impegnativi. I modelli precedentemente utilizzati in vitro o ex vivo non hanno la capacità di visualizzare la migrazione dei fibroblasti e la formazione di cicatrici in microambienti cutanei autentici, l'uniformità nello sviluppo delle cicatrici e la complessità dei tessuti che emula gli ambienti cutanei in vivo 11,12. Per superare le limitazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato un saggio di cicatrici ex vivo chiamato SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Questo semplice test può essere eseguito asportando la pelle a tutto spessore di 2 mm contenente l'epidermide, il derma e le regioni della fascia sottocutanea e coltivandole in mezzi DMSO integrati con siero per un massimo di 5 giorni. Le cicatrici generate da SCAD replicano in modo affidabile i segni trascrittomici e proteomici delle cicatrici in vivo. Inoltre, gli SCAD generati da linee di topo transgeniche rilevanti (ad esempio, topi En1) incrociati con linee di topo reporter fluorescenti consentono la visualizzazione delle dinamiche di migrazione dei fibroblasti e lo sviluppo di cicatrici a una risoluzione senza precedenti. Inoltre, questo modello può essere facilmente adattato per qualsiasi applicazione ad alto rendimento (ad esempio, libreria di composti, libreria di anticorpi o screening virale)13,14. In questo articolo, descriviamo un protocollo ottimizzato per generare SCAD e successive applicazioni di elaborazione a valle per studiare le dinamiche cellulari e matriciali nello sviluppo di cicatrici.
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Protocol
Il modello presentato di seguito fornisce una descrizione dettagliata passo-passo della generazione del test SCAD come brevemente descritto in Jiang et al., 202013. I preparati dei campioni SCAD sono stati eseguiti dopo aver sacrificato gli animali secondo le linee guida internazionali e del governo dell'Alta Baviera. Gli animali erano ospitati presso la struttura per animali del Centro Helmholtz di Monaco. Le camere sono state mantenute con umidità ottimale e temperatura costante con un ciclo di luce di 12 ore. Gli animali venivano riforniti di cibo e acqua ad libitum.
1. Preparazione del tessuto SCAD
- Sacrificare i cuccioli appena nati il giorno postnatale 0 o il giorno 1 (P0 o P1).
- Asportare con attenzione almeno 1,5 cm x 1,5 cm di pelle dorsale dorsale a tutto spessore fino allo strato muscolare scheletrico utilizzando un bisturi chirurgico sterile.
- Sbucciare la pelle con una pinza curva sterile, assicurandosi che la fascia superficiale sia intatta con il muscolo carnoso pannicolo sottostante.
- Lavare il tessuto asportato con 50-100 ml di mezzi DMEM/F-12 freddi per rimuovere il sangue contaminante.
- Lavare una volta con hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) per mantenere la vitalità dei tessuti e delle cellule.
- Posizionare la pelle a testa in giù (fascia superficiale in alto) in una capsula di Petri da 10 cm contenente dmEM/F12.
- Utilizzando un punzone monouso da 2 mm per biopsia, asportare pezzi di pelle rotonda a tutto spessore, assicurando che la fascia superficiale sia intatta con il muscolo carnoso del pannicolo sottostante fino all'epidermide per generare tessuti SCAD.
- Preparare e riempire 200 μL di DMEM/F12 (senza rosso fenolo) di media-DMEM/F12 completi integrati con il 10% di FBS, 1x GlutaMAX, 1x aminoacidi non essenziali MEM e 1x Penicillina/streptomicina in singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
- Utilizzando una pinza sterile, trasferire con cura e immergere completamente il singolo tessuto SCAD a testa in giù (fascia rivolta verso l'alto) nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
- Trasferire la piastra in un incubatore di colture cellulari mantenuto in condizioni standard (37 °C, 21% (v/v) ossigeno, 5% (v/v) C02 e 95% di umidità).
2. SCAD - Coltura tissutale
- Coltura SCAD in un incubatore per un massimo di 5 giorni.
- Il giorno 2 e il giorno 4 della coltura, sostituire il mezzo con 200 μl di mezzo completo DMEM / F12 preriscaldato fresco per garantire condizioni di vitalità cellulare e tissutale continue. Sostituire i composti di trattamento durante ogni cambio di fluido.
NOTA: Assicurarsi di lasciare 10 μL di materiale nel pozzo per evitare che i tessuti si attacchino ai pozzetti. - Preparare gli SCAD per i seguenti esperimenti: Live imaging (sezione 3) e Tissue Harvesting e colorazione a immunofluorescenza 2D/3D (sezione 4).
3. Imaging dal vivo di SCAD
- Preparare un minimo di 30 ml di soluzione di agarosio a bassa fusione al 2%-3% (p/v) in PBS in una bottiglia di vetro riscaldandola in un forno a microonde fino all'ebollizione.
- Trasferire immediatamente il flacone e raffreddare la soluzione liquida di agarosio a bagnomaria a 40 °C.
- Trasferire il tessuto SCAD con fascia/Scar rivolto verso l'alto al centro di un piatto da 35 mm.
- Incorporare l'SCAD a temperatura ambiente (RT) trasferendo lentamente agarosio liquido a 40 °C sulla parabola da 35 mm utilizzando una pipetta Pasteur. L'agarosio polimerizza entro 2 min.
- Aggiungere 2 ml di supporto completo DMEM/F12 preriscaldato (senza indicatore rosso fenolo).
- Acquisire immagini time-lapse di SCAD del giorno 0 fino a 48 ore utilizzando un microscopio confocale o multifotonico dotato di un adeguato sistema di incubazione impostato su 37 °C, 21% (v/v) ossigeno, 5% (v/v) C02 e 95% di umidità.
4. Prelievo di tessuti e colorazione immunofluorescenza 2D/3D
- Lavare i tessuti nei punti temporali rilevanti sostituendo il fluido con PBS sterile.
- Utilizzando pinze sterili, trasferire con cura i singoli SCAD in tubi microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 500 μL di paraformaldeide al 2% per fissare i tessuti durante la notte a 4 °C.
- Lavare i tessuti tre volte con PBS e procedere con la colorazione di immunofluorescenza 2D/3D.
- Colorazione immunofluorescenza 3D
- Permeabilizzare i tessuti incubando in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml contenente 500 μL di PBS integrato con 0,2% di gelatina, 0,5% di Triton-X100 e 0,01% di Thimerosal (PBSGT) a RT per 24 ore.
- Preparare una quantità adeguata di anticorpi primari secondo le istruzioni del produttore e incubare i tessuti SCAD in 150 μL di soluzione PBSGT per 24 ore a RT.
NOTA: se la concentrazione ottimale di anticorpi per la fluorescenza immunitaria non è riportata dal produttore, la titolazione preliminare degli anticorpi deve essere eseguita sui tessuti di controllo utilizzando concentrazioni variabili (ad esempio, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Lavare delicatamente gli SCAD tre volte con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
- Incubare il tessuto con anticorpi secondari Alexa Fluor rilevanti per 1:1000 in PBS durante la notte a RT.
- Lavare delicatamente il tessuto per 30 minuti in PBS tre volte per rimuovere gli anticorpi secondari non legati in eccesso.
- Trasferire il tessuto su un piatto con fondo di vetro da 35 mm per l'imaging confocale o multifotonico.
NOTA: quando si utilizzano obiettivi di immersione in acqua, incorporare gli SCAD in agarosio a basso punto di fusione al 2% per immobilizzare il tessuto per evitare la deriva durante l'acquisizione dell'immagine
- Colorazione immunofluorescenza 2D
- Trasferire il tessuto in un criostampo e riempire delicatamente con un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) per immergere completamente il tessuto.
- Regolare delicatamente l'orientamento del tessuto, assicurando l'assenza di bolle d'aria per ottenere una sezione trasversale o una sezione verticale.
- Posizionare lo stampo su ghiaccio secco per 20-30 minuti e incubare il blocco a -80 °C durante la notte.
- Impostare la temperatura della lama a -25 °C e la temperatura del blocco del campione a -17 °C. Preparare una criosezione da 6 μm utilizzando un criostato, trasferire le sezioni su un vetrino di adesione e conservare le diapositive in un congelatore a -20 °C.
- Risciacquare i vetrini tre volte in PBS e incubare i vetrini in 5% di albumina sierica bovina (BSA) c/v in PBST (PBS integrato con 0,05% di interpolazione) per 1 ora.
- Aggiungere una quantità appropriata di anticorpo primario a 150μl PGST e incubare durante la notte a 4 °C
NOTA: se la concentrazione ottimale di anticorpi per la fluorescenza immunitaria non è riportata dal produttore, la titolazione preliminare degli anticorpi deve essere eseguita su sezioni di controllo utilizzando concentrazioni variabili (ad esempio, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Lavare delicatamente le sezioni tre volte con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
- Incubare il tessuto con anticorpi secondari Alexa Fluor rilevanti per 1:1000 in PBS durante la notte a RT per 2 ore.
- Lavare delicatamente il tessuto per 5 minuti in PBS tre volte per rimuovere gli anticorpi secondari non legati in eccesso.
- Montare le diapositive con un mezzo di montaggio contenente DAPI e asciugare le diapositive al buio a RT.
- Immagina le sezioni usando un microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
La generazione di SCAD può essere suddivisa in tre passaggi essenziali: raccolta della pelle dai topi P0-P1, generazione di pugni per biopsia a tutto spessore e successiva coltura di singoli scad fino a 5 giorni in piastre a 96 pozzetti. Come lettura, questo test può essere ulteriormente applicato per analizzare gli aspetti spaziali e temporali delle cicatrici. L'analisi spaziale utilizza l'immunodetichettazione 2D e 3D dei tessuti per studiare la localizzazione spaziale dei componenti cellulari e della matrice all'interno del tessuto cicatriziale in via di sviluppo. Gli studi spaziotemporali consentono la visualizzazione di queste cicatrici ex-situ utilizzando proteine fluorescenti intrinseche o estrinseche tissutali che possono essere visualizzate utilizzando le pertinenti modalità di imaging time-lapse 3D.
I passaggi fondamentali di questo test sono l'impostazione dell'esperimento generando con cura punzoni di biopsia a tutto spessore, assicurando la presenza di uno strato fasciale di "gelatina" e coltivando il tessuto completamente sommerso a testa in giù (epidermide rivolta verso il fondo delle piastre a 96 pozzetti). Ciò consente lo sviluppo di cicatrici uniformi, dinamiche di migrazione comparabili delle popolazioni di fibroblasti rilevanti e contrazione cutanea tra gli SCAD (Figura 1A). La versatilità del test SCAD consente di raccogliere il tessuto attraverso l'intero spettro dello sviluppo delle cicatrici. Ad esempio, se lo scopo dell'esperimento è quello di studiare le prime dinamiche delle cicatrici, l'analisi spaziale e spaziotemporale può essere limitata a D1 o D2 della cultura SCAD (Figura 1B).
Le immagini rappresentative a campo luminoso a montaggio intero degli SCAD al giorno 0 e al giorno 5 sono mostrate rispettivamente nella Figura 2A e nella Figura 2A'. Per l'analisi 2D, è essenziale incorporare gli SCAD in OCT in orientamento perpendicolare privo di bolle d'aria per garantire l'integrità del tessuto dopo il sezionamento. Queste sezioni tissutali possono inoltre essere sottoposte ad analisi istologiche (ad esempio, colorazione tricroma di Masson-Figura 2B,2B') o colorazione di immunofluorescenza (Figura 2C,2C') sulle criosezioni del derma dorsale del topo En1 Cre,R26mTmG; EPF in verde e ENF in rosso fin dall'inizio (Figura 2D) e cicatrice in fase avanzata (Figura 2D').
L'imaging time-lapse 3D e 3D delle cicatrici richiede il rilevamento di segnali di fluorescenza in profondità all'interno del tessuto (400-800 μm). L'eccitazione nelle lunghezze d'onda del vicino infrarosso utilizzando l'eccitazione a due fotoni consente tali misurazioni senza la necessità di pulizia dei tessuti, una metodologia comunemente utilizzata nell'imaging 3D per rendere trasparente il tessuto riducendo al minimo la diffusione e l'assorbimento della luce 15,16,17. Abbiamo utilizzato un microscopio multifotone verticale dotato di un obiettivo di immersione in acqua 25x in combinazione con un laser sintonizzabile. I tessuti sono stati sottoposti a colorazione immunitaria 3D utilizzando sonde pertinenti. Per l'imaging 3D, il tessuto è stato incorporato in una soluzione di agarosio a bassa fusione al 2% per immobilizzare o prevenire la deriva nel tessuto (Figura 3A) sormontata da PBSGT per corrispondere all'indice di rifrazione richiesto per l'obiettivo di immersione in acqua. L'immagine rappresentativa in Figura 3B e Figura 3B' mostra la localizzazione esclusiva della proteina N-Caderina (rosa/magenta-Alexa fluor 647) nel sito cicatriziale di un giorno 5 SCAD da una pelle posteriore En1 Cre,R26mTmG; EPF in verde e ENF in rosso. Per l'imaging time-lapse 3D, è stata apportata una leggera modifica alla configurazione di cui sopra incorporando il tessuto in una soluzione di agarosio a bassa fusione al 2% sormontata da supporti DMEM / F12 senza indicatore rosso fenolo anziché PBS. Per garantire le giuste condizioni per il tessuto SCAD "vivente" durante l'imaging, è stata aggiunta un'adeguata camera di incubazione in modo che tutti i fenotipi siano correttamente registrati durante l'imaging (Figura 3C). Istantanee rappresentative dei primi sciami di fibroblasti sono mostrate in Figura 3D, Figura 3D' e Figura 3D'' nelle prime 12 h/prime fasi dello sviluppo della cicatrice.
Figura 1: Flusso di lavoro schematico del test SCAD. (A) La pelle posteriore dei cuccioli postnatali giorno 0 / giorno 1 viene asportata, garantendo l'integrità del tessuto contenente i seguenti strati dermici: epidermide (E), derma papillare e reticolare (PD e RD) e strato fasciale (F) seguiti da punzoni bioptici da 2 mm per ottenere SCAD giorno 0. (B) Gli SCAD possono quindi essere successivamente coltivati per un massimo di 5 giorni con una fase facoltativa intermittente di raccolta/fissazione dei tessuti in base alla natura dei singoli esperimenti (frecce punteggiate) con una fase di cambio del terreno di coltura il giorno 2 e il giorno 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione a immunofluorescenza 2D. Letture 2D rappresentative per studiare le cicatrici in fase iniziale e avanzata utilizzando (A e A') Immagine a montaggio intero in campo luminoso al giorno 0 (A) e al giorno 5 (A'). (B e B') Colorazione tricromatica di Masson di sezioni verticali di tessuto per rivelare le firme della contrazione tissutale cicatriziale e dell'accumulo di ECM al nucleo cicatriziale (triangolo riempito di giallo) al giorno 0 (B) e al giorno 5 (B'). (C e C') Analisi di immunofluorescenza degli SCAD giorno 0 (C) e giorno 5 (C') generati dalla pelle posteriore En1 Cre,R26mTmG. Gli EPF sono mostrati in verde, ENF in rosso e DAPI in blu dalla cicatrice iniziale (D) e in fase avanzata (D'). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Configurazione schematica e letture rappresentative degli SCAD per l'analisi spatio e spaziotemporale 3D. (A) Rappresentazione schematica dell'incorporamento degli SCAD in gel di agarosio a bassa temperatura di fusione al 2% sotto un microscopio fluorescente verticale e (B) immagine rappresentativa di un immunofluorescente 3D colorato giorno 5 SCAD generato da En1 Cre,R26mTmG derma di topo e immuno-macchiato con anticorpo N-Caderina (Magenta). Gli EPF sono mostrati in verde e gli ENF sono mostrati in rosso. (C) Rappresentazione schematica Configurazione SCAD di imaging 3D dotata di una camera di incubazione: 37 °C, 21% (v/v) ossigeno, 5% (v/v) C02 e 95% di umidità. (D) Risultati rappresentativi dell'imaging dal vivo che mostrano i primi eventi di progressione degli sciami di fibroblasti (cerchio tratteggiato bianco) nelle prime 12 ore del giorno 0 e nel giorno 1 stadio SCAD. (E) Rappresentazione grafica delle traiettorie cellulari tracciate a singola cellula dei singoli fibroblasti a D, D' e D''. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Diversi modelli sono già stati sviluppati per comprendere la formazione di cicatrici dopo l'infortunio. Mentre molti progressi sono stati fatti in questo senso, ma i meccanismi effettivi non sono ancora chiari. In contrasto con la tecnica precedente, il modello SCAD incorpora tutti i tipi di cellule e gli strati cutanei, mantenendo così la complessità della pelle nativa18,19. Questa metodologia è in grado di generare set di dati fondamentali che sono importanti per comprendere i meccanismi molecolari che guidano la formazione di cicatrici. Il test è progettato in modo semplice, minimalista, ma in grado di produrre letture fondamentali e funzionali che sono cruciali per comprendere la migrazione dei fibroblasti, la deposizione di ECM, la contrazione epidermica / muscolare13,14. È relativamente meno complesso delle configurazioni in vivo e le deviazioni rispetto al campione possono essere ridotte al minimo. Inoltre, questo test può essere facilmente accoppiato con pipeline di analisi ad alto rendimento. In cui l'intero spettro o le librerie di inibitori o attivatori come composti chimici, anticorpi neutralizzanti, siRNA o metodologie virali che riducono o promuovono cicatrici potrebbero essere applicati con relativa facilità a quantità minime di tessuti asportati. Per quanto riguarda la limitazione di questo modello di cicatrice ex vivo, questo test non può essere applicato per studiare aspetti fenotipici o dinamici di a) sciami immunitari non residenti nello sviluppo della cicatrice b) vascolarizzazione c) maturazione della cicatrice poiché il tessuto non è vitale oltre i 5 giorni dopo l'infortunio.
Prima che la biopsia punzi l'escissione, è importante che non rimanga sangue residuo nel tessuto in quanto potrebbe interferire con lo svolgimento dell'esperimento. Si consiglia di lavare il tessuto più di una volta con HBSS, se necessario, per assicurarsi che il sangue residuo dal tessuto venga eliminato. Inoltre, il cambio di media a giorni alterni deve essere eseguito con particolare attenzione, poiché gli strati dermico ed epidermico possono separarsi a causa delle piccole dimensioni del tessuto. Pertanto, è imperativo praticare correttamente la procedura in anticipo prima di iniziare esperimenti effettivi. Per evitare ripetute separazioni degli strati tissutali, suggeriamo che durante il cambio del fluido, 10 μl di mezzo residuo possano essere conservati prima di sostituirli con mezzi freschi al fine di stabilizzare il tessuto e ridurre al minimo il cambiamento di tensione superficiale sul tessuto causato dal mezzo aggiunto al pozzo.
Per le tubazioni di analisi 2D, si consiglia di equilibrare il tessuto con un composto liquido a temperatura di taglio ottimale a temperatura ambiente per alcuni minuti prima di montare il tessuto in un blocco. Ciò impedisce la separazione dei tessuti a causa della formazione di cristalli di ghiaccio durante il sezionamento. Le pipeline di imaging time-lapse 3D/3D devono essere adeguatamente modificate in base alla modalità del microscopio disponibile. Per un microscopio verticale (con o senza obiettivo di immersione in acqua), l'incorporamento del tessuto in agarosio o l'uso di supercolla impedisce lo spostamento fisico del tessuto durante l'imaging. Gli obiettivi di immersione in acqua consentono l'imaging time-lapse 3D/3D utilizzando PBS o supporti incolori (senza rosso fenolo). Per un microscopio invertito, il tessuto potrebbe essere posizionato su un fondo di vetro / piastra di imaging e immobilizzato utilizzando una goccia di agarosio a bassa temperatura di fusione e sormontato da un supporto adatto per garantire la vitalità durante l'imaging dal vivo. In entrambe le modalità, è possibile utilizzare un sistema di incubazione compatibile per garantire la giusta temperatura, umidità e alimentazione di gas durante l'imaging.
In conclusione, il modello SCAD consente l'identificazione e la caratterizzazione di nuovi segnali molecolari e percorsi meccanicistici coinvolti nella guarigione delle ferite dei mammiferi13,14. Il protocollo fornisce una descrizione dettagliata della generazione di SCAD e potenziali applicazioni e analisi a valle per fornire informazioni sullo sviluppo delle cicatrici.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Riconosciamo tutti i co-autori di Jiang et al. 2020 per aver contribuito allo sviluppo della metodologia SCAD13. Ringraziamo il Dr. Steffen Dietzel e la struttura centrale di Bioimaging presso la Ludwig-Maximilans-Universität per l'accesso al sistema Multiphoton. Y.R. è stato sostenuto dalla Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), dall'European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) e dalla LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
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