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नदी के मैक्रोअकशेरुकी जीवों की सामुदायिक आकार संरचना निर्धारित करने के लिए स्वचालित छवि प्रसंस्करण

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64320
Automatic Translation
1,4, 2,4, 1,4, 3,4
1Center for the Study of Mediterranean Rivers (CERM), Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya, 2Laboratoire Evolution et Diversité Biologique (EDB), UMR5174, Université Toulouse 3 Paul Sabatier, Centre national de la recherche scientifique (CNRS), Institut de Recherche pour le Développement (IRD), 3Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 4Aquatic Ecology Group, Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya

Summary

यह लेख अर्ध-स्वचालित इमेजिंग प्रक्रिया का उपयोग करके बेंटिक नदी मैक्रोअकशेरुकी के अनुरूप डिजिटल वस्तुओं को स्कैन करने, पता लगाने, सॉर्ट करने और पहचानने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के निर्माण पर आधारित है। यह प्रक्रिया लगभग 1 घंटे में मैक्रोअकशेरुकी समुदाय के व्यक्तिगत आकार वितरण और आकार मैट्रिक्स के अधिग्रहण की अनुमति देती है।

Abstract

शरीर का आकार एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक विशेषता है जिसका उपयोग प्राकृतिक समुदायों में गड़बड़ी के प्रभावों का आकलन करने के लिए बायोइंडिकेटर के रूप में किया जा सकता है। समुदाय आकार संरचना जैविक और अजैविक ग्रेडिएंट्स का जवाब देती है, जिसमें टैक्सा और पारिस्थितिक तंत्र में मानवजनित गड़बड़ी शामिल है। हालांकि, छोटे शरीर वाले जीवों जैसे कि बेंटिक मैक्रोअकशेरुकी जीवों का मैनुअल माप (उदाहरण के लिए, >500 μm से कुछ सेंटीमीटर लंबा) समय लेने वाला है। सामुदायिक आकार संरचना के आकलन में तेजी लाने के लिए, यहां, हमने संरक्षित नदी मैक्रोअकशेरुकी जीवों के व्यक्तिगत शरीर के आकार को अर्ध-स्वचालित रूप से मापने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है, जो मीठे पानी के पारिस्थितिक तंत्र की पारिस्थितिक स्थिति का आकलन करने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले जैव संकेतकों में से एक है। यह प्रोटोकॉल पानी के नमूनों के लिए डिज़ाइन की गई स्कैनिंग प्रणाली के साथ समुद्री मेसोज़ोप्लांकटन को स्कैन करने के लिए विकसित एक मौजूदा पद्धति से अनुकूलित है। प्रोटोकॉल में तीन मुख्य चरण होते हैं: (1) नदी मैक्रोअकशेरुकी जीवों के सूक्ष्म (ठीक और मोटे नमूना आकार अंश) को स्कैन करना और प्रत्येक छवि में प्रत्येक पता लगाई गई वस्तु को अलग करने के लिए डिजिटल छवियों को संसाधित करना; (2) स्कैन किए गए नमूनों में डेट्रिटस और कलाकृतियों से मैक्रोअकशेरुकी की व्यक्तिगत छवियों को अर्ध-स्वचालित रूप से अलग करने के लिए कृत्रिम बुद्धि के माध्यम से एक सीखने के सेट का निर्माण, मूल्यांकन और सत्यापन करना; और (3) मैक्रोअकशेरुकी समुदायों की आकार संरचना को दर्शाता है। प्रोटोकॉल के अलावा, इस काम में अंशांकन परिणाम शामिल हैं और मैक्रोअकशेरुकी नमूनों के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करने और आगे के सुधारों पर विचार करने के लिए कई चुनौतियों और सिफारिशों की गणना करता है। कुल मिलाकर, परिणाम नदी मैक्रोअकशेरुकी जीवों के स्वचालित शरीर के आकार के माप के लिए प्रस्तुत स्कैनिंग सिस्टम के उपयोग का समर्थन करते हैं और सुझाव देते हैं कि उनके आकार स्पेक्ट्रम का चित्रण मीठे पानी के पारिस्थितिक तंत्र के तेजी से जैव मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण है।

Introduction

बेंटिक मैक्रोअकशेरुकी जीवों को मोटे तौर पर जल निकायों की पारिस्थितिक स्थिति निर्धारित करने के लिए जैव संकेतक के रूप में उपयोग किया जाताहै। मैक्रोअकशेरुकी समुदायों का वर्णन करने के लिए अधिकांश सूचकांक टैक्सोनोमिक मैट्रिक्स पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, शरीर के आकार को एकीकृत करने वाले नए बायोएसेसमेंट टूल को टैक्सोनोमिक दृष्टिकोण 2,3 के लिए एक वैकल्पिक या पूरक परिप्रेक्ष्य प्रदान करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।

शरीर के आकार को एक मेटाट्रेट माना जाता है जो चयापचय, विकास, श्वसन और आंदोलन जैसे अन्य महत्वपूर्णलक्षणों से संबंधित है। इसके अलावा, शरीर का आकार ट्रॉफिक स्थिति और इंटरैक्शन निर्धारित करसकता है। एक समुदाय में आकार वर्ग द्वारा व्यक्तिगत शरीर के आकार और सामान्यीकृत बायोमास (या बहुतायत) के बीच संबंध को आकार स्पेक्ट्रम 6 के रूप में परिभाषित कियागया है और सामान्यीकृत बायोमास में रैखिक कमी के सामान्य पैटर्न का पालन करता है क्योंकि व्यक्तिगत आकार लघुगणकीय पैमाने7 पर बढ़ता है। इस रैखिक संबंध के ढलान का सैद्धांतिक रूप से बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और पारिस्थितिक तंत्र में अनुभवजन्य अध्ययनों ने इसे समुदाय आकार संरचना के पारिस्थितिक संकेतक के रूप में उपयोग कियाहै। समुदाय आकार संरचना का एक और सिंथेटिक संकेतक जो जैव विविधता-पारिस्थितिकी तंत्र के कामकाज के अध्ययन में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, वह सामुदायिक आकार विविधता है, जिसे आकार स्पेक्ट्रम या इसके एनालॉग के आकार वर्गों के शैनन सूचकांक के रूप में दर्शाया गया है, जिसकी गणना व्यक्तिगत आकार वितरण8 के आधार पर की जाती है।

मीठे पानी के पारिस्थितिक तंत्र में, विभिन्न जीव समूहों की आकार संरचना का उपयोग पर्यावरणीय ग्रेडिएंट9,10,11 और मानवजनित गड़बड़ी 12,13,14,15,16 के लिए जैविक समुदायों की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक एटैक्सिक संकेतक के रूप में किया जाता है। मैक्रोअकशेरुकी एक अपवाद नहीं हैं, और उनकी आकार संरचना पर्यावरणीयपरिवर्तनों 17,18 और मानवजनित गड़बड़ी का भी जवाब देती है, जैसे खनन19, भूमि उपयोग20, या नाइट्रोजन (एन) और फास्फोरस (पी) संवर्धन20,21,22। हालांकि, समुदाय के आकार की संरचना का वर्णन करने के लिए सैकड़ों व्यक्तियों को मापना एक थकाऊ और समय लेने वाला कार्य है जिसे अक्सर समय की कमी के कारण प्रयोगशालाओं में नियमित माप के रूप में टाला जाता है। इस प्रकार, नमूनों को वर्गीकृत करने और मापने के लिए कई अर्ध-स्वचालित या स्वचालित इमेजिंग विधियां विकसित की गई हैं 23,24,25,26। हालांकि, इनमें से अधिकांश विधियां जीवों के व्यक्तिगत आकार की तुलना में टैक्सोनोमिक वर्गीकरण पर केंद्रित हैं और सभी प्रकार के मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए उपयोग करने के लिए तैयार नहीं हैं। समुद्री प्लवक पारिस्थितिकी में, ज़ोप्लांकटन समुदायों27,28,29,30,31 के आकार और वर्गीकरण संरचना को निर्धारित करने के लिए एक स्कैनिंग छवि विश्लेषण प्रणाली का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। यह उपकरण दुनिया भर में कई समुद्री संस्थानों में पाया जा सकता है, और इसका उपयोग पूरे नमूने की उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिजिटल छवियों को प्राप्त करने के लिए संरक्षित ज़ोप्लांकटन नमूनों को स्कैन करने के लिए किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक नया उपकरण बनाने में निवेश किए बिना तेजी से स्वचालित तरीके से नदियों में मैक्रोअकशेरुकी समुदाय आकार स्पेक्ट्रम का अनुमान लगाने के लिए इस उपकरण के उपयोग को अनुकूलित करता है।

प्रोटोकॉल में एक नमूना स्कैन करना और नमूने में वस्तुओं की एकल छवियों (यानी, विगनेट्स) को स्वचालित रूप से प्राप्त करने के लिए पूरी छवि को संसाधित करना शामिल है। आकार, आकार और ग्रे-स्तरीय विशेषताओं के कई उपाय प्रत्येक वस्तु को चिह्नित करते हैं और वस्तुओं के स्वचालित वर्गीकरण को श्रेणियों में अनुमति देते हैं, जिन्हें बाद में एक विशेषज्ञ द्वारा मान्य किया जाता है। प्रत्येक जीव के व्यक्तिगत आकार की गणना दीर्घवृत्तीय बायोवॉल्यूम (मिमी3) का उपयोग करके की जाती है, जो पिक्सेल में मापा जाने वाले जीव के क्षेत्र से प्राप्त होता है। यह तेजी से तरीके से नमूने के आकार स्पेक्ट्रम को प्राप्त करने की अनुमति देता है। हमारे ज्ञान के अनुसार, इस स्कैनिंग इमेजिंग सिस्टम का उपयोग केवल मेसोज़ोप्लांकटन नमूनों को संसाधित करने के लिए किया गया है, लेकिन डिवाइस संभावित रूप से मीठे पानी के बेंटिक मैक्रोअकशेरुकी जीवों के साथ काम करने की अनुमति दे सकता है।

इसलिए, इस अध्ययन का समग्र लक्ष्य समुद्री मेसोज़ोप्लांकटन27,32,33 के साथ पहले उपयोग किए जाने वाले मौजूदा प्रोटोकॉल को अनुकूलित करके संरक्षित नदी मैक्रोअकशेरुकी जीवों के व्यक्तिगत आकार को तेजी से प्राप्त करने के लिए एक विधि पेश करना है। प्रक्रिया में एक अर्ध-स्वचालित दृष्टिकोण का उपयोग करना शामिल है जो पानी के नमूनों को स्कैन करने के लिए स्कैनिंग डिवाइस और स्कैन की गई छवियों को संसाधित करने के लिए तीन खुले सॉफ्टवेयर के साथ संचालित होता है। समुदाय आकार संरचना और संबंधित आकार मैट्रिक्स को स्वचालित रूप से प्राप्त करने के लिए डिजिटाइज्ड नदी मैक्रोअकशेरुकी को स्कैन, पता लगाने और पहचानने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। दक्षता बढ़ाने के लिए प्रक्रिया और दिशानिर्देशों का मूल्यांकन उत्तर-पूर्वी (एनई) इबेरियन प्रायद्वीप (टेर, सेग्रे-एब्रे और बेसोस) में तीन बेसिनों से एकत्र किए गए नदी के मैक्रोअकशेरुकी नमूनों की 42 स्कैन की गई छवियों के आधार पर भी प्रस्तुत किया गया है।

स्पेनसरकार से फोर्डेबल नदियों में बेंटिक नदी मैक्रोअकशेरुकी जीवों के फील्ड सैंपलिंग और प्रयोगशाला विश्लेषण के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 100 मीटर नदी के हिस्सों में नमूने एकत्र किए गए थे। नमूने एक बहु-निवास सर्वेक्षण के बाद एक सुरबर सैंपलर (फ्रेम: 0.3 मीटर x 0.3 मीटर, जाल: 250 μm) के साथ एकत्र किए गए थे। प्रयोगशाला में, नमूनों को 5 मिमी और 500 μm जाल के माध्यम से साफ किया गया और छलनी किया गया ताकि दो अवशेष प्राप्त किए जा सकें: एक मोटा जाल (5 मिमी जाल) और एक महीन जाल (500 μm जाल), जिसे अलग-अलग शीशियों में संग्रहीत किया गया था और 70% इथेनॉल में संरक्षित किया गया था। नमूने को दो आकार के अंशों में अलग करने से समुदाय के आकार की संरचना का बेहतर अनुमान लगाया जा सकता है, क्योंकि बड़े जीव दुर्लभ होते हैं और छोटे जीवों की तुलना में कम होते हैं। अन्यथा, स्कैन किए गए नमूने में बड़े आकार के अंश का पक्षपाती प्रतिनिधित्व होता है।

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Protocol

नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल समुद्री मेसोज़ोप्लांकटन के लिए गोर्स्की एट अल .27 द्वारा विकसित प्रणाली पर आधारित है। स्कैनर (ZooSCAN), स्कैनिंग सॉफ्टवेयर (VueScan 9x64 [9.5.09]), छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (Zooprocess, ImageJ), और स्वचालित पहचान सॉफ्टवेयर (प्लैंकटन पहचानकर्ता) चरणों का एक विशिष्ट विवरण पिछले संदर्भ32,33 में पाया जा सकता है। मेसोज़ोप्लांकटन के संबंध में बेंटिक मैक्रोअकशेरुकी जीवों के आकार को सर्वोत्तम रूप से समायोजित करने के लिए, एक बार मूल प्रोटोकॉल32,33 का पालन करते हुए परियोजना बनाई जाती है, तो कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल में न्यूनतम आकार (minsizeesd_mm) के पैरामीटर को 0.3 मिमी और अधिकतम आकार (maxsizeesd_mm) के पैरामीटर को 100 मिमी में बदलें। प्रोटोकॉल का पालन करने में मदद करने के लिए, यह एक कार्य चार्ट (चित्रा 1) में संक्षेपित है। बनाया गया प्रोजेक्ट कंप्यूटर के C फ़ोल्डर में संग्रहीत है और निम्न फ़ोल्डरों में व्यवस्थित है: PID_process, Zooscan_back, Zooscan_check, Zooscan_config, Zooscan_meta, Zooscan_results, और Zooscan_scan. प्रत्येक फ़ोल्डर कई सबफ़ोल्डर्स से बना है जो विभिन्न सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोग प्रोटोकॉल के निम्न चरणों में उपयोग करते हैं।

1. मैक्रोअकशेरुकी नमूनों के लिए डिजिटल छवियों का अधिग्रहण

  1. रिक्त स्थान को स्कैन और संसाधित करना
    नोट: स्कैन करने से पहले प्रतिदिन दो रिक्त छवियां बनाएं ताकि उसी दिन स्कैन की गई छवियों को संसाधित करते समय पृष्ठभूमि स्कैन निकाला जा सके।
    1. स्कैनर चालू करें और ऊपर से और नीचे से सफेद प्रकाश को प्रोजेक्ट करने के लिए दोहरी स्थिति में प्रकाश चालू करें।
      नोट: मेसोज़ोप्लांकटन नमूनों को स्कैन करते समय, ऊपर की ओर प्रकाश दिशा का उपयोग किया जाता है, लेकिन क्योंकि मैक्रोअकशेरुकी अधिक अपारदर्शी होते हैं, इसलिए प्रकाश को दोहरी स्थिति में स्विच करने की सिफारिश की जाती है।
    2. स्कैन ट्रे को नल के पानी से साफ और कुल्ला करें।
    3. कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत 110 एमएल नल का पानी स्कैन ट्रे में डालें जब तक कि ग्लास कवर न हो जाए। स्कैन ट्रे पर बड़े फ्रेम (24.5 सेमी x 15.8 सेमी) को सही स्थिति में रखें (स्कैन ट्रे के शीर्ष-बाएं हिस्से में कोने के साथ), और इसे नल के पानी से भरें जब तक कि मेनिस्कस प्रभाव से बचने के लिए फ्रेम का चरण कवर न हो जाए, जो स्कैन की गई छवि को बदल देगा। स्कैनर का ढक्कन बंद करें।
      नोट: संक्षेपण और बुलबुला गठन से बचने के लिए आरटी में पानी का उपयोग करें। प्रकाश प्रतिबिंब से बचने के लिए निशान या बूंदों के बिना फ्रेम को साफ करें।
    4. छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर पर जाएं, कार्य परियोजना का चयन करें, और स्कैन (कनवर्ट) पृष्ठभूमि छवि पर क्लिक करें।
    5. स्कैनिंग सॉफ्टवेयर पर जाएं और पूर्वावलोकन पर क्लिक करें। स्कैन की गई छवि का पूर्वावलोकन करना सुनिश्चित करें, जांचें कि कोई लाइन या धब्बे नहीं हैं, और एक और स्कैन शुरू करने से पहले कम से कम 30 सेकंड तक प्रतीक्षा करें। स्कैनिंग सॉफ्टवेयर से छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में डेटा भेजने के लिए स्कैन पर क्लिक करें और दूसरे स्कैन से पहले निर्देश विंडो में ओके दबाएं।
      नोट: दो पृष्ठभूमि स्कैन प्राप्त करने के लिए दो बार स्कैन करें जिसमें रिक्त स्थान शामिल होगा। नमूना प्रसंस्करण शुरू करने से पहले यह चरण हर दिन एक बार किया जाता है, और छवियों को Zooscan_back फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जाता है।
    6. स्कैन समाप्त करने के बाद स्कैनिंग सॉफ़्टवेयर बंद करें।
  2. नमूना तैयार करना और स्कैनिंग
    चेतावनी: इथेनॉल एक ज्वलनशील तरल है और गंभीर आंखों की क्षति / जलन पैदा कर सकता है।
    1. नमूना मेटाडेटा भरें। छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर पर जाएँ और नमूना मेटाडेटा भरें का चयन करें। नमूना पहचान दर्ज करें, ओके पर क्लिक करें, और मेटाडेटा भरें।
      नोट: मेटाफाइल विशेष रूप से मेसोज़ोप्लांकटन नमूनों के लिए बनाया गया है, इसलिए यह बेंटिक मैक्रोअकशेरुकी नमूना पद्धति में फिट नहीं होता है, फिर भी फ़ाइल के सभी क्षेत्रों को स्कैन से पहले भरने की आवश्यकता होती है, या एक त्रुटि ध्वज पॉप अप होगा।
    2. ग्लास को कवर होने तक स्कैन ट्रे में 70% इथेनॉल का 110 एमएल डालें और स्कैन ट्रे के शीर्ष-बाएं हिस्से में कोने के साथ बड़े फ्रेम (24.5 सेमी x 15.8 सेमी) रखें।
      नोट: पानी के बजाय इथेनॉल के साथ काम करें, क्योंकि मैक्रोअकशेरुकी इथेनॉल में संरक्षित हैं। पानी में, वे स्कैन ट्रे में तैरते हैं और बहते हैं, एक तेज छवि को रोकते हैं और इस प्रकार, विश्वसनीय आकार माप करते हैं। संक्षेपण और बुलबुला गठन से बचने के लिए इथेनॉल को आरटी में संरक्षित किया जाना चाहिए।
    3. मैक्रोअकशेरुकी नमूने को फ्रेम द्वारा धारित स्कैन ट्रे में डालें, और यदि आवश्यक हो तो फ्रेम चरण को अधिक इथेनॉल के साथ कवर करें।
      नोट: तैरते और बहने वाले जीवों से बचने के लिए बहुत अधिक इथेनॉल जोड़ने से बचें।
    4. पूरे फ्रेम क्षेत्र में नमूने को समरूप करें, उचित छवि प्रसंस्करण के लिए ट्रे के केंद्र में सबसे बड़े व्यक्तियों को रखें, और लकड़ी की सुई का उपयोग करके तैरते जीवों को डुबोएं।
      नोट: यदि संख्यात्मक रूप से किसी समूह में 1,000 से अधिक व्यक्ति होते हैं, तो स्कैन की गई छवि में स्पर्श करने वाले जीवों को कम करने के लिए नमूने को दो या दो से अधिक अंशों में विभाजित करें, और अंशों को अलग से स्कैन करें।
    5. लकड़ी की सुई का उपयोग करके स्पर्श करने वाले जीवों और फ्रेम किनारों को छूने वाले जीवों को अलग करें।
      नोट: इस चरण के लिए 5-20 मिनट की आवश्यकता है। स्पर्श करने वाले जीवों को सॉफ्टवेयर द्वारा एक एकल वस्तु माना जाता है; इस प्रकार, उन मामलों में, गणना किए गए व्यक्तिगत आकार वास्तविक एकल जीवों के अनुरूप नहीं होते हैं और समुदाय आकार संरचना के अनुमान को पूर्वाग्रह कर सकते हैं। उन्हें अलग करने के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ छवि को संपादित करने की संभावना है, लेकिन इस अतिरिक्त चरण में कम से कम 1.5 घंटे का पुनर्संसाधन शामिल है; इस प्रकार, मैनुअल पृथक्करण अत्यधिक अनुशंसित है।
    6. नमूना स्कैन करने के लिए, स्कैनर ढक्कन बंद करें, छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर पर जाएं, कार्य परियोजना का चयन करें, और Zooscan के साथ SCAN नमूना पर क्लिक करें (पुरालेख के लिए, कोई प्रक्रिया नहीं)।
    7. नमूना का चयन करें और निर्देशों का पालन करें।
    8. स्कैनिंग सॉफ्टवेयर पर जाएं और पूर्वावलोकन पर क्लिक करें। स्कैन की गई छवि का पूर्वावलोकन करना सुनिश्चित करें, जांचें कि कोई लाइन या धब्बे नहीं हैं, और एक और स्कैन शुरू करने से पहले कम से कम 30 सेकंड प्रतीक्षा करें।
    9. कम से कम 30 सेकंड के बाद, स्कैनिंग सॉफ्टवेयर में स्कैन बटन पर क्लिक करें।
      नोट: स्कैनिंग सॉफ़्टवेयर में स्कैन दबाने के बाद छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में ओके दबाएं। कंप्यूटर कीबोर्ड पर कोई कुंजी न दबाएं, और स्कैनिंग के दौरान स्कैन के कंपन से बचें। Zooscan_scan > _raw फ़ोल्डर में तीन फ़ाइलें उत्पन्न होती हैं: (i) एक टैग की गई छवि फ़ाइल प्रारूप (.tif) (16 बिट); (ii) LOG (.txt) नामक एक मानक पाठ दस्तावेज़ जो स्कैनिंग पैरामीटर पर जानकारी रिकॉर्ड करता है; और (iii) नमूना विधियों पर जानकारी के साथ मेटा (.txt) नामक एक मानक पाठ दस्तावेज।
    10. सत्यापित करें कि कच्चा स्कैन सही है।
      नोट: यदि स्कैन में हल्की धारियां या अन्य दृश्यमान मुद्दे हैं, तो निम्नलिखित चरणों में समस्याओं से बचने के लिए स्कैन को दोहराने पर विचार करें।
  3. नमूना पुनर्प्राप्ति
    1. फ्रेम को हटा दें और किसी भी संलग्न मैक्रोअकशेरुकी को पुनर्प्राप्त करने के लिए 70% इथेनॉल से भरी निचोड़ बोतल का उपयोग करके स्कैन ट्रे के ऊपर कुल्ला करें।
    2. स्कैन पुनर्प्राप्ति फ़नल के माध्यम से ट्रे से सभी जीवों और इथेनॉल को प्राप्त करने के लिए स्कैनर के ऊपरी हिस्से को उठाएं। स्कैनर के ऊपरी हिस्से को अभी भी उठाए जाने के साथ, ट्रे को निचोड़ बोतल से धोएं ताकि किसी भी शेष जीवों के साथ झाड़ू लगाया जा सके।
    3. जाल में अकशेरुकी जीवों को बनाए रखने के लिए बीकर से नमूने और इथेनॉल को 500 μm जाल के माध्यम से पास करें, और उन्हें 70% इथेनॉल के साथ एक शीशी में वापस स्टोर करें।
    4. एक बार जब सभी नमूने शीशी में बरामद हो जाते हैं, तो नल के पानी से ट्रे को साफ करें।
      नोट: इथेनॉल वर्षा को कम करने के लिए नमूनों के बीच नल के पानी के साथ ट्रे को धोएं, जो छवि प्रसंस्करण को बदल देता है। इथेनॉल उपयोग से संबंधित संभावित नुकसान से बचने के लिए फ्रेम को नल के पानी से धोएं। दिन के अंत में, नल के पानी का उपयोग करके ट्रे को साफ करें और खरोंच से बचने के लिए इसे कागज से धीरे से सुखाएं।
  4. छवि प्रसंस्करण
    1. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पर जाएं और बैच मोड में कन्वर्ट एंड प्रोसेस इमेज और ऑर्गेनिज्म का चयन करें और फिर इमेज और पार्टिकल्स (रॉ फोल्डर में इमेज) को कनवर्ट करें और प्रोसेस करें। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें और ओके पर क्लिक करें। प्रक्रिया के अंत में सामान्य अंत दिखाई देगा।
      नोट: स्कैन की गई छवि में सभी पता लगाए गए ऑब्जेक्ट्स के अनुरूप एक पीआईडी फ़ाइल और विगनेट्स (एक संयुक्त फोटोग्राफिक समूह फ़ाइल [.jpg]) Zooscan_scan > _work फ़ोल्डर में बनाए जाएंगे। एक पीआईडी फ़ाइल एक एकल फ़ाइल है जो सभी मेटाडेटा (मेटाफ़ाइल), लॉग फ़ाइल से जुड़े तकनीकी डेटा और छवि में पाए गए सभी ऑब्जेक्ट्स के 36 मापा चर के साथ एक तालिका संग्रहीत करती है। मापा चर ग्रे स्तर, फ्रैक्टल आयाम, आकार और आकार के विभिन्न अनुमानों के अनुरूप हैं। आकार आकलन के लिए उपयोग किए जा सकने वाले चर वस्तु के समान क्षेत्र के साथ दीर्घवृत्त के क्षेत्र और प्रमुख और छोटे अक्ष हैं (प्रोटोकॉल का खंड 3 देखें)। प्रसंस्करण समय छवि घनत्व और कंप्यूटर विशेषताओं पर निर्भर करता है, और अगले नमूने को पुनर्प्राप्त करने और तैयार करने के दौरान नमूनों के बीच लॉन्च किया जा सकता है। अन्यथा, रात के दौरान बैच मोड में प्रत्येक दिन स्कैन किए गए नमूनों के प्रसंस्करण को शुरू करने और अगली सुबह उचित छवि प्रसंस्करण की जांच करने की सिफारिश की जाती है।
    2. जांचें कि क्या संसाधित छवि में पृष्ठभूमि को छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके नमूना छवि से उचित रूप से घटाया गया है या Zooscan_scan > _work में स्थित मास्क छवियों (एमएसके 1.gif में समाप्त) की जांच करके। यदि पृष्ठभूमि में संतृप्त क्षेत्र या कई बिंदु हैं, तो उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को सुनिश्चित करने के लिए स्कैन को दोहराने पर विचार करें।
      नोट: पृष्ठभूमि में संतृप्त क्षेत्रों से बचने के लिए, इथेनॉल के साथ हर स्कैन के बाद स्कैन ट्रे को नल के पानी से धोया जाना चाहिए। (1) स्कैन किए गए व्यक्तियों की संख्या को कम करना भी महत्वपूर्ण है (नमूना को अलग-अलग सिलवटों में विभाजित करके और स्कैनिंग करके); (2) सुनिश्चित करें कि बड़े जीवों को स्कैन ट्रे के केंद्र में रखा गया है; (3) स्वच्छ, फ़िल्टर किए गए इथेनॉल का उपयोग करें; (4) नमूनों पर गंदगी को कम करना; (5) सुनिश्चित करें कि स्कैनिंग के लिए इथेनॉल की मात्रा पर्याप्त है; और (6) सुनिश्चित करें कि नमूने के पूर्वावलोकन और स्कैन के बीच देरी कम से कम 30 सेकंड है।
  5. स्पर्श करने वाले जीवों का पृथक्करण
    नोट: जब स्पर्श करने वाले जीवों के साथ कई विगनेट्स होते हैं, तो समुदाय के आकार की संरचना का उचित अनुमान सुनिश्चित करने के लिए अन्य जीवों और / या फाइबर / मलबे से स्पर्श करने वाले जीवों की छवियों को अलग करना आवश्यक है।
    1. एकाधिक ऑब्जेक्ट्स के साथ विगनेट्स का पता लगाने के लिए इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पर जाएं। विगनेट्स का उपयोग करके पृथक्करण का चयन करें और ठीक पर दबाएं। कॉन्फ़िगरेशन चयन विंडो में, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें और ठीक पर क्लिक करें।
    2. विगनेट्स से पृथक्करण विंडो में, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें, विगनेट्स पर अतिरिक्त रूप से ADD रेखांकन का चयन करें, और तब संपादित करने के लिए नमूना का चयन करें।
    3. माउस के साथ एक रेखा खींचकर पॉप अप होने वाले प्रत्येक विगनेट में स्पर्श करने वाले जीवों को अलग करें (खींचने के लिए रोल बटन दबाएं)। एक बार विगनेट में पृथक्करण पूरा हो जाने के बाद, विंडो के ऊपरी-दाएं कोने में एक्स बटन पर क्लिक करें, और अगले को संसाधित करने के लिए हां दबाएं। परिवर्तनों को समाप्त करने और सहेजने के लिए NO दबाएँ . प्रक्रिया के अंत में, सामान्य अंत दिखाई देगा यदि सब कुछ सही है।
    4. पृथक्करण के बाद, अद्यतन ऑब्जेक्ट डेटा प्राप्त करने के लिए छवि को पुन: संसाधित करें। छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर पर जाएं, प्रक्रिया (परिवर्तित) छवि (प्रक्रिया एक) पर क्लिक करें, और कार्य उप-फ़ोल्डरों में संसाधित छवियों से प्रक्रिया फिर से कणों का चयन करें। नमूना का चयन करें, और एकल छवि प्रक्रिया विंडो में, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें, पृथक्करण मास्क के साथ कार्य की जाँच करें (Create-modify-include), और तब OK पर क्लिक करें। प्रक्रिया के अंत में, सामान्य अंत दिखाई देगा यदि सब कुछ सही है।
    5. पृथक्करण नियंत्रण विंडो में, प्रसंस्करण से पहले आकृति के साथ छवि को सहेजने के लिए ओके दबाएं; यदि कोई पिछली छवि मौजूद है, तो इसे बदल दिया जाएगा।
    6. पृथक्करण नियंत्रण मास्क विंडो में, यदि आवश्यक हो, तो माउस का उपयोग करके मास्क में पृथक्करण लाइनों को जोड़ने के लिए संपादित करें ताकि उन स्पर्श जीवों को अलग किया जा सके जो विगनेट्स चरण का उपयोग करके पृथक्करण में पहले दिखाई नहीं दिए हैं। समाप्त होने पर, प्रक्रिया समाप्त करें, और पृथक्करण मास्क नियंत्रण विंडो में, मास्क स्वीकार करने के लिए हाँ का चयन करें। प्रक्रिया के अंत में, सामान्य अंत दिखाई देगा यदि सब कुछ सही है।
      नोट: एक पृथक्करण मास्क के साथ एक नमूने को पुन: संसाधित करना समय लेने वाला है (इसमें प्रति नमूना 1.5 घंटे से अधिक समय लग सकता है)। इस अतिरिक्त चरण से बचने के लिए चरण 1.2.5 में आवश्यक समय समर्पित करना बेहतर है।

2. वस्तुओं की स्वचालित पहचान

नोट: पता लगाए गए वस्तुओं की पहचान की स्वचालित रूप से भविष्यवाणी करने के लिए एक शिक्षण सेट बनाएं, इस प्रकार नमूने में मलबे से जीवों को अलग करें।

  1. सीखना सेट निर्माण
    1. छवियों और छवियों से जुड़ी .pid फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ जिनका उपयोग Zooscan_scan > _work से PID_process > Unsorted_vignettes_pid तक सीखने के सेट की श्रेणियाँ बनाने के लिए किया जाएगा।
      नोट: नमूनों में जीवों के अधिकतम प्रतिनिधित्व को सुनिश्चित करने के लिए उच्च टैक्सा विविधता और विभिन्न नमूना साइटों और / या नमूना करण मौसमों के साथ नमूनों के एक उप-समूह का चयन करें।
    2. PID_process > लर्निंग सेट फ़ोल्डर में, नए लर्निंग सेट (यानी, yyyymmdd_raw_LS) के नाम के साथ एक सबफ़ोल्डर बनाएं, और इसके अंदर, सबफ़ोल्डर बनाएं जो सीखने के सेट की प्रत्येक श्रेणी (यानी, मैक्रोअकशेरुकी, मलबे, अन्य अकशेरुकी) के अनुरूप होंगे।
      नोट: नदी मैक्रोअकशेरुकी नमूनों की सामुदायिक आकार संरचना को कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए, केवल तीन श्रेणियों के आधार पर एक सीखने के सेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है: मैक्रोअकशेरुकी, अन्य अकशेरुकी और मलबे। यह शिक्षण सेट मूल रूप से जीवों के अनुरूप वस्तुओं के विगनेट्स को मलबे (जैसे, फाइबर, कण, या फिलामेंटस शैवाल) के अनुरूप लोगों से अलग करता है।
    3. छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर (केवल उन्नत मोड) पर जाएं और PLANKTON IDENTIFIER (प्रशिक्षण के लिए मिश्रित विगनेट्स) के लिए EXTRACT विगनेट्स चुनें। डिफ़ॉल्ट विकल्प रखें और रूपरेखा जोड़ें बॉक्स की जाँच करें ।
    4. स्वचालित पहचान सॉफ़्टवेयर पर जाएं, लर्निंग पर क्लिक करें, नए लर्निंग सेट (चरण 2.1.2) के लिए बनाए गए सबफ़ोल्डर PID_process > Learning_set से चुनें, और ठीक दबाएँ।
    5. खुली विंडो के बाएँ अनुभाग (मिश्रित अंगूठे) में, vignettes_pid फ़ोल्डर का चयन करें. विगनेट्स का चयन करें और प्रत्येक ऑब्जेक्ट को परिभाषित श्रेणियों में वर्गीकृत करने के लिए उन्हें मिश्रित अंगूठे से माउस के साथ दाएं अनुभाग, क्रमबद्ध थम्स में उनकी संबंधित श्रेणी के फ़ोल्डर में खींचें। स्थानांतरित विगनेट्स को लाल एक्स के साथ चिह्नित किया जाएगा।
      नोट: क्रमबद्ध थंब्स फ़ोल्डर में सबफ़ोल्डर बनाकर श्रेणियों को मैन्युअल रूप से परिभाषित करें या सॉफ़्टवेयर में फ़ोल्डर आइकन पर क्लिक करके उन्हें बनाएं। एक ही समय में 50 से अधिक विगनेट्स को स्थानांतरित न करें।
    6. एक बार जब सभी श्रेणियां चयनित ऑब्जेक्ट्स (प्रति श्रेणी लगभग 300 ऑब्जेक्ट्स) के साथ पूरी हो जाती हैं, तो क्रिएट लर्निंग फाइल पर क्लिक करें और इसे वांछित नाम के साथ सहेजें।
      नोट: लर्निंग सेट प्रोजेक्ट के PID_process > लर्निंग सेट फ़ोल्डर में .pid फ़ाइल के रूप में सहेजा जाएगा। श्रेणियों के विभिन्न स्तरों (मोटे से ठीक रूपों तक) और प्रत्येक श्रेणी के भीतर वस्तुओं की संख्या के एक अलग संतुलन के साथ कई शिक्षण सेट बनाने और परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। श्रेणियों की कम संख्या और प्रति श्रेणी कम से कम 50 वस्तुओं के साथ एक मोटे शिक्षण सेट से शुरू करें, और फिर प्रत्येक श्रेणी में वस्तुओं की संख्या बढ़ाएं और / या बेहतर शिक्षण सेट बनाएं। एक श्रेणी नमूने के सेट में इसकी परिवर्तनशीलता का प्रतिनिधि होना चाहिए।
  2. सीखने के सेट का मूल्यांकन
    नोट: वस्तुओं के परिणामी वर्गीकरण के भ्रम मैट्रिक्स को प्राप्त करने के लिए स्वचालित पहचान सॉफ्टवेयर के साथ रैंडम फॉरेस्ट विधि का उपयोग करके दो गुना और पांच परीक्षणों के साथ क्रॉस-सत्यापन करें।
    1. स्वचालित वर्गीकरण सॉफ्टवेयर पर जाएं और डेटा विश्लेषण पर क्लिक करें।
    2. लर्निंग फ़ाइल का चयन करें में, PID_process > लर्निंग सेट से बनाई गई लर्निंग सेट फ़ाइल का चयन करें.
    3. किसी विधि का चयन करें में, क्रॉस-सत्यापन रैंडम फ़ॉरेस्ट विधि चुनें. मूल चर में, स्थिति चर (एक्स, वाई, एक्सएम, वाईएम, बीएक्स, बीवाई, और ऊंचाई) को हटा दें। अनुकूलित चर में, केवल ईएसडी टिक करें।
      नोट: यह विधि दूसरे भाग (दो सिलवटों) को पहचानने के लिए सीखने के सेट के एक यादृच्छिक भाग का उपयोग करती है, और यह सुनिश्चित करने के लिए पांच बार दोहराया जाता है कि यह सांख्यिकीय रूप से मजबूत है।
    4. विश्लेषण प्रारंभ करें पर क्लिक करें, और परिणामों को PID_process > पूर्वानुमान फ़ोल्डर में Analysis_name.txt के रूप में सहेजें। जब विश्लेषण सफलतापूर्वक पूरा हो जाता है, तो डेटा विश्लेषण छोड़ दें।
    5. PID_process > पूर्वानुमान फ़ोल्डर पर जाएँ और क्रॉस-सत्यापन फ़ाइल पर क्लिक करें। एक विंडो सच्चे वर्गीकरण (पंक्तियों) बनाम स्वचालित वर्गीकरण (कॉलम) के भ्रम मैट्रिक्स के साथ पॉप अप करेगी।
      नोट: रिकॉल एक समूह से संबंधित जीवों का प्रतिशत है जो स्वचालित रूप से अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त था, जबकि 1-परिशुद्धता एल्गोरिथ्म द्वारा वर्गीकृत जीवों का प्रतिशत है जो एक समूह के रूप में वर्गीकृत है जिसे मान्यता प्राप्त नहीं है (एक समूह में संदूषण)। रिकॉल 70% से ऊपर होना चाहिए, और संदूषण (1-परिशुद्धता) 20% से कम होना चाहिए।
    6. चरण 2.1-2.5 दोहराएं यदि कई शिक्षण सेट बनाए गए थे और प्रत्येक की याद और 1-परिशुद्धता प्राप्त करने की आवश्यकता है।
      नोट: यदि कई शिक्षण सेट बनाए गए हैं, तो अगले चरण में नमूनों के एक सेट की स्वचालित भविष्यवाणी का परीक्षण करने के लिए रुचि के समूह (यानी, मैक्रोअकशेरुकी) के सबसे बड़े रिकॉल (अच्छी मान्यता) और परिशुद्धता (कम संदूषण) वाले एक को चुनें।
  3. मैक्रोअकशेरुकी जीवों की पहचान की भविष्यवाणी
    नोट: यादृच्छिक वन एल्गोरिथ्म के साथ स्वचालित पहचान सॉफ्टवेयर का उपयोग करके नमूनों के उप-समूह में सभी वस्तुओं की पहचान की भविष्यवाणी करने के लिए चयनित शिक्षण सेट का उपयोग करें।
    1. स्वचालित पहचान सॉफ्टवेयर पर जाएं और डेटा विश्लेषण पर क्लिक करें।
    2. लर्निंग फ़ाइल का चयन करें में, PID_process > लर्निंग सेट से लर्निंग सेट फ़ाइल का चयन करें जिसका उपयोग भविष्यवाणी के लिए किया जाना चाहिए।
    3. नमूना फ़ाइल (फ़ाइलों) का चयन करें, PID_results फ़ोल्डर से उन नमूनों (PID फ़ाइलों) का चयन करें जिनकी भविष्यवाणी की जा रही है।
      नोट: स्मृति समस्याओं से संबंधित त्रुटियों से बचने के लिए एक ही समय में अधिकतम 20 .pid फ़ाइलों को संसाधित करें। यदि एक ही समय में बहुत सारी .pid फ़ाइलें संसाधित की जाती हैं, तो प्रक्रिया एक सही अंत दिखाएगी लेकिन अच्छी तरह से संसाधित नहीं हो सकती है, और छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर के साथ प्रसंस्करण करते समय अगले चरणों में एक त्रुटि हो सकती है।
    4. विधि का चयन करें में, यादृच्छिक वन विधि चुनें. प्रत्येक नमूने के लिए विस्तृत परिणाम सहेजें पर टिक करें. मूल चर में, स्थिति चर (एक्स, वाई, एक्सएम, वाईएम, बीएक्स, बीवाई और ऊंचाई) को हटा दें। अनुकूलित चर में, केवल ईएसडी टिक करें।
    5. विश्लेषण प्रारंभ करें पर क्लिक करें, और परिणामों को PID_process > पूर्वानुमान फ़ोल्डर में Analysis_name.txt के रूप में सहेजें।
  4. मैन्युअल सत्यापन
    नोट: एक विशेषज्ञ गलत वर्गीकृत वस्तुओं को सही श्रेणी में पुन: वर्गीकृत करने के लिए पिछले चरण से भविष्यवाणी को मैन्युअल रूप से मान्य करता है।
    1. PID_process > पूर्वानुमान फ़ोल्डर से PID_process > Pid_results फ़ोल्डर में मान्य की जाने वाली Analysis_sample_dat1.txt फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ।
    2. छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर पर जाएं और भविष्यवाणी या सत्यापन के अनुसार फ़ोल्डरों में एक्सट्रैक्ट विगनेट्स का चयन करें। उसके बाद, "pid_results" फ़ोल्डर से पूर्वानुमानित फ़ाइलों का उपयोग करें का चयन करें। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें और ठीक दबाएँ.
    3. सॉफ्टवेयर PID_process > सॉर्ट किए गए विगनेट्स फ़ोल्डर में अनुमानित ऑब्जेक्ट्स के साथ sample_yyyymmdd_hhmm_to_validate नामक एक फ़ोल्डर बनाता है।
    4. PID_process > सॉर्ट किए गए विगनेट्स फ़ोल्डर पर जाएँ, और sample_yyyymmdd_ hhmm_to_validate फ़ोल्डर की प्रतिलिपि बनाएँ। फ़ोल्डर नाम बदलें _to _validated के साथ मान्य करें।
    5. स्वचालित वर्गीकरण को मैन्युअल रूप से मान्य करने के लिए, sample_yyyymmdd_ hhmm_validated फ़ोल्डर खोलें, और प्रत्येक सबफ़ोल्डर (श्रेणी) से सभी विगनेट्स की समीक्षा करें ताकि यह पता लगाया जा सके कि क्या गलत वर्गीकृत ऑब्जेक्ट हैं। जब एक ऑब्जेक्ट गलत वर्गीकृत हो जाता है, तो माउस का उपयोग करके विगनेट को सही फ़ोल्डर (श्रेणी) में खींचें।
    6. छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर पर जाएं और सॉर्टेड विगनेट्स से लोड पहचान का चयन करें। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें और संसाधित किए जाने वाले yyyymmdd_hhmm_name_validated का चयन करें।
    7. PID_process > Pid_results > Dat1_validated पर जाएं, जहां Id_from_sorted_vignettes_yyyymmdd_hhmm.txt नामक एक फ़ाइल और प्रत्येक मान्य नमूने (sample_tot_1_dat1.txt) के लिए एक .txt फ़ाइल बनाई गई है।
      नोट: इन .txt फ़ाइलों में एक नया कॉलम होता है जो भविष्यवाणी प्रस्तुत करता है, जिसे pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm कहा जाता है, जो प्रत्येक ऑब्जेक्ट के विशेषज्ञ वर्गीकरण (यानी, मान्य वर्गीकरण) को निर्दिष्ट करता है। सत्यापन के दौरान इस बिंदु पर नई श्रेणियां (जैसे, बेहतर टैक्सोनोमिक श्रेणियां) बनाई जा सकती हैं। हालाँकि, मूल श्रेणी का नाम नए नाम में रखें (उदाहरण के लिए, macroinvertebrate_chironomidae). यह रिकॉल और परिशुद्धता की गणना करते समय मूल श्रेणी को फिर से ट्रैक करने और समुदाय आकार संरचना मापदंडों (यानी, आकार स्पेक्ट्रम और आकार विविधता) की गणना करने के लिए सभी मैक्रोअकशेरुकी जीवों को आसानी से समूहीकृत करने की अनुमति देता है। टेक्स्ट फ़ाइल प्रत्येक ऑब्जेक्ट से जुड़े डेटा प्रदान करती है, जिसमें मामूली और प्रमुख अक्ष शामिल हैं जिनका उपयोग व्यक्तिगत शरीर के आकार के माप के रूप में प्रत्येक जीव के दीर्घवृत्तीय आयतन को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, तालिका के अंतिम दो स्तंभों में प्रत्येक वस्तु (पंक्ति) की अनुमानित और मान्य श्रेणियां होती हैं, जो श्रेणी द्वारा, नमूनों के उप-समूह पर निर्धारित सीखने की याद और परिशुद्धता की गणना करने की अनुमति देती हैं।Figure 1

चित्रा 1: प्रोटोकॉल के अनुभाग 1 और खंड 2 का प्रतिनिधित्व करने वाला कार्य चार्ट। समय उदाहरणात्मक है और कंप्यूटर, प्रक्रिया के लिए विगनेट्स की प्रचुरता और सीखने के सेट की श्रेणियों की संख्या के आधार पर बदल सकता है। यह मामला 42 उपग्रहों (कुल मिलाकर, 47,473 विगनेट्स) के एक सेट पर तीन श्रेणियों के सीखने के सेट के सत्यापन से मेल खाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. व्यक्तिगत आकार वितरण, आकार स्पेक्ट्रा और आकार मैट्रिक्स की गणना

नोट: इस खंड में उल्लिखित गणना मैटलैब का उपयोग करके की गई थी (पूरक फ़ाइल 1 के रूप में स्क्रिप्ट देखें)।

  1. व्यक्तिगत आकार वितरण
    1. Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt फ़ाइल के अंतिम स्तंभ में ऑब्जेक्ट्स का मान्य वर्गीकरण होता है. नमूने में उनके व्यक्तिगत आकार वितरण को चित्रित करने के लिए केवल मैक्रोअकशेरुकी के रूप में वर्गीकृत वस्तुओं का चयन करें।
      नोट: व्यक्तिगत शरीर का आकार मैक्रोअकशेरुकी जीवों के दीर्घवृत्तीय मात्रा से मेल खाता है। सिस्टम पिक्सेल में माप प्रदान करता है।
    2. दोनों स्कैन से आकार माप के साथ वैक्टर को कॉन्केटेट करें, क्योंकि प्रत्येक अंश में एक अलग उप-नमूना प्रतिपादक होता है। संयोजन से पहले, आकार वैक्टर को जितनी बार संबंधित वैक्टर को अलग किया गया है, उतनी बार नकल करके विभाजन के लिए सही करें।
      नोट: इस चरण की आवश्यकता है यदि स्कैन एक नमूने के एक अंश (यानी, मोटे या ठीक) से मेल खाता है।
    3. जीवों के समान पिक्सेल क्षेत्रों के साथ प्रोलेट दीर्घवृत्त के प्रमुख (एम) और मामूली (एम) अक्षों से दीर्घवृत्तीय आयतन की गणना करें। दीर्घवृत्तीय आयतन की गणना करने से पहले, प्रमुख (एम) और मामूली (एम) अक्षों को पिक्सेल से मिलीमीटर (मिमी) में निम्नलिखित रूपांतरण कारक (सीएफ) के साथ परिवर्तित करें:
      1 पिक्सेल = 2,400 dpi
      1 इंच = 25.4 मिमी
      cf = 25.4/2400
      दीर्घवृत्तीय आयतन (मिमी3 में इकाइयों के साथ एलिपोल) किससे मेल खाता है?
      Equation 1
    4. लॉग2 पैमाने पर व्यक्तिगत आकार वितरण के संभाव्यता घनत्व फ़ंक्शन को चित्रित करें।
  2. आकार विविधता
    1. (2008)8 के बाद आकार विविधता (एसडी) की गणना करें, जैसा कि गार्सिया-कोमास एट अल ( 2016) 35 में है:
      Equation 2
      जहां px(x) आकार x का संभाव्यता घनत्व फलन है, और x लॉग2 (ellipVol) का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, यह उपाय शैनन विविधता सूचकांक है जो एक निरंतर माप के लिए अनुकूलित है, जैसे कि एक समुदाय में व्यक्तिगत आकार वितरण।
  3. सामान्यीकृत बायोवॉल्यूम आकार स्पेक्ट्रम (NBSS)
    1. एनबीएस के आकार वर्गों को परिभाषित करें, नमूनों में मैक्रोअकशेरुकी आकार वितरण के 0.01 परिमाण के रूप में स्पेक्ट्रम की निचली सीमा को स्थापित करें और आधार 2 के ज्यामितीय पैमाने द्वारा आकार वर्ग बनाएं जब तक कि नमूनों में सबसे बड़ा जीव शामिल न हो।
      नोट: आकार वर्ग की चौड़ाई आकार के साथ बढ़ती है ताकि अधिक आकार से जुड़ी अधिक परिवर्तनशीलता को ध्यान में रखा जा सके। यहां विश्लेषण किए गए मैक्रोअकशेरुकी समुदायों के एनबीएस में 14 आकार वर्ग थे (तालिका 1)।
    2. आकार वर्ग की चौड़ाई से प्रत्येक आकार वर्ग में कुल बायोवॉल्यूम को विभाजित करके सामान्यीकृत बायोवॉल्यूम प्राप्त करें।
  4. आकार स्पेक्ट्रम ढलान
    1. NBSS के रैखिक ढलान की गणना करें।
      नोट: ढलान (μ) की गणना किसी भी खाली लोगों को अनदेखा करते हुए मोड से अधिक आकार वर्गों में लॉग2 (आकार वर्ग मध्य-बिंदु) और लॉग2 (सामान्यीकृत बायोमास) के बीच संबंधों के आधार पर की जाती है (इस अध्ययन में, आकार वर्ग 3 से 14 तक)।
आकार वर्ग सीमा (मिमी3) आकार वर्ग मध्य बिंदु (मिमी3)
0,1236 0,1855
0,2473 0,3709
0,4946 0,7418
0,9891 1,4837
1,9783 1,4837
3,9560 5,9348
7,9131 11,8696
15,8261 23,7392
31,6522 47,4783
63,3044 94,9567
126,6089 189,9133
253,2178 379,8267
506,4300 7597,7000
1012,9000 15193,0000
2025,7000

तालिका 1: सामान्यीकृत बायोमास आकार स्पेक्ट्रम (NBSS) के आकार वर्ग। तालिका जीवों के 15 आकार वर्ग सीमाओं और आकार वर्ग के मध्य-बिंदुओं को भी दर्शाती है।

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Representative Results

मैक्रोअकशेरुकी नमूनों की डिजिटल छवियों का अधिग्रहण
स्कैनिंग बारीकियां: स्कैन ट्रे में इथेनॉल का जमाव
मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए सिस्टम का परीक्षण करते समय, कई स्कैन खराब गुणवत्ता के थे। पृष्ठभूमि में एक गहरे संतृप्त क्षेत्र ने छवि के सामान्य प्रसंस्करण और मैक्रोअकशेरुकी जीवों के व्यक्तिगत आकार के माप को रोका (चित्रा 2)। पृष्ठभूमि या अत्यधिक पिक्सेल वाली छवियों में संतृप्त क्षेत्रों की उपस्थिति के लिए कई कारण दिए गए हैं: (1) स्कैन ट्रे पर बहुत सारे जीवों की उपस्थिति; (2) नमूनों में गंदगी की उपस्थिति; (3) नमूने के पूर्वावलोकन और इसके स्कैन के बीच अपर्याप्त देरी; या (4) संक्षेपण, गंदगी, या खराब पानी की गुणवत्ता के कारण खराब गुणवत्ता की पृष्ठभूमि छवि को संसाधित करने वाली छवि का उपयोग करना। मैक्रोअकशेरुकी समुदाय के नमूनों में, पानी के बजाय इथेनॉल का उपयोग ट्रे पर वर्षा का कारण बनता है, जो स्कैन के बीच पानी से ठीक से धोया नहीं जाने पर एक अंधेरी छाया बनाता है। यह तेज छवियों को प्राप्त करने और स्कैन ट्रे ग्लास के किसी भी संबंधित संक्षारण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।

स्कैनिंग बारीकियों: मलबे की एकाग्रता
47,473 विगनेट्स के उप-समूह के विश्लेषण से, एक उच्च प्रतिशत (86.1%) मलबे से मेल खाता है, जिसमें डेट्राइटस, फाइबर या शरीर के अंग (जैसे पैर या गलफड़े), या स्कैनिंग कलाकृतियां शामिल हैं (चित्रा 3 ए-ई)। अकशेरुकी जीव पता लगाए गए वस्तुओं के शेष 13.9% से मेल खाते हैं (चित्रा 3 एफ-एल)। इस प्रकार, प्रयोगशाला में कार्बनिक पदार्थों से जीवों के पिछले सावधानीपूर्वक पृथक्करण के बावजूद, बहुत सारे छोटे मलबे अभी भी शीशी में बने हुए हैं।

स्कैनिंग बारीकियां: वस्तुओं को छूना
मलबे की महत्वपूर्ण उपस्थिति जीवों के बीच स्पर्श को बढ़ाती है, और इसलिए, समुच्चय के साथ विगनेट्स का निर्माण जिसमें कणों या तंतुओं से जुड़े कई स्पर्श करने वाले जीव और जीव शामिल हैं (चित्रा 4 ए-सी)। ये विगनेट्स व्यक्तिगत आकार संरचना के आकार को निर्धारित करने में पूर्वाग्रह का एक स्रोत हैं। पांच नमूनों (11 नमूनों) के एक सेट में, किसी भी मैक्रोअकशेरुकी जीवों के साथ सभी विगनेट्स में से, 10% स्पर्श करने वाले जीवों या कणों या तंतुओं को छूने वाले जीवों वाले समूहों के अनुरूप थे। उन विगनेट्स को छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ संपादित किया गया था ताकि स्पर्श करने वाले जीवों और कणों के साथ जीवों को अलग किया जा सके। पृथक्करण मास्क के साथ नमूनों को पुन: संसाधित करने में नई अलग-अलग वस्तुओं के साथ नए विगनेट्स का निर्माण शामिल था, जिन्हें उनके उचित वर्गीकरण को सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया गया था।

ऑब्जेक्ट्स की स्वचालित पहचान
सीखने के सेट परिणाम
एक लर्निंग सेट एक विशेषज्ञ द्वारा विभिन्न श्रेणियों में वर्गीकृत वस्तुओं के विगनेट्स का एक सेट है और एक पर्यवेक्षित शिक्षण मॉडल में उपयोग किया जाता है, और इसे प्रशिक्षण सेट27 भी कहा जा सकता है। मौजूदा लर्निंग सेट के साथ काम करना, मौजूदा लर्निंग सेट को नए विगनेट्स और / या श्रेणियों के साथ अपडेट करना, या एक विशिष्ट प्रोजेक्ट के लिए एक नया लर्निंग सेट बनाना संभव है।

मैक्रोअकशेरुकी आकार संरचना को तेजी से प्राप्त करने के लिए सर्वोत्तम शिक्षण सेट निर्धारित करने के लिए, रैंडम फॉरेस्ट एल्गोरिदम के साथ क्रॉस-सत्यापन के माध्यम से कई शिक्षण सेट बनाए और परीक्षण किए गए। परिणामी भ्रम मैट्रिक्स सही वर्गीकरण (पंक्तियों) बनाम स्वचालित वर्गीकरण (कॉलम) को दर्शाता है। रिकॉल एक श्रेणी से संबंधित जीवों का प्रतिशत है जिसे स्वचालित रूप से अच्छी तरह से वर्गीकृत किया गया था, जबकि 1-परिशुद्धता एल्गोरिथ्म द्वारा गलत वर्गीकृत जीवों का प्रतिशत है जो एक श्रेणी (एक श्रेणी में संदूषण) से संबंधित है। अंगूठे के नियम के रूप में, रिकॉल 70% से ऊपर होना चाहिए, और सीखने के सेट में एक श्रेणी रखने के लिए संदूषण (1-परिशुद्धता) 20% से कम होना चाहिए। मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए सबसे बड़ी याद और परिशुद्धता के साथ सीखने के सेट को फिर मैक्रोअकशेरुकी पहचान में इसकी वास्तविक सटीकता निर्धारित करने के लिए नमूनों के उप-समूह के साथ मान्य किया जाता है।

वस्तुओं की रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर श्रेणियों के साथ तीन प्रकार के एटैक्सिक लर्निंग सेट (कच्चे, मध्यवर्ती और ठीक) का परीक्षण किया गया था। कच्चे सीखने के सेट में तीन श्रेणियां शामिल थीं: मैक्रोअकशेरुकी, अन्य अकशेरुकी (माइक्रोक्रस्टेशियन), और मलबे (फाइबर, कण और कांच के दाग जैसे कलाकृतियां)। मध्यवर्ती शिक्षण सेट में 16 श्रेणियां शामिल थीं: मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए 5, अन्य अकशेरुकी जीवों के लिए 3 और मलबे के लिए 8। फाइन लर्निंग सेट में मैक्रोअकशेरुकी जीवों की 4 और श्रेणियां शामिल थीं, जिसमें कुल 20 श्रेणियां थीं (तालिका 2)।

श्रेणियों को परिभाषित करने के अलावा, प्रति श्रेणी विगनेट्स की संख्या के प्रभाव का भी परीक्षण किया गया था। प्रत्येक शिक्षण सेट को प्रत्येक श्रेणी में 50 विगनेट्स, 100 विगनेट्स और 300 विगनेट्स का उपयोग करके अलग से परीक्षण किया गया था (और तीन श्रेणियों के साथ कच्चे सीखने के सेट के लिए 500 विगनेट्स)। "ओस्ट्राकोडा", "लंबे दौर के मैक्रोअकशेरुकी" और "राउंड शेल मैक्रोअकशेरुकी" को छोड़कर सभी श्रेणियों को संख्या में संतुलित किया गया था, जिसमें 100 विगनेट और 300 विगनेट लर्निंग सेट में कम व्यक्ति शामिल थे क्योंकि स्कैन की गई छवियों में इन श्रेणियों के पर्याप्त जीवों का पता नहीं चला था।

मैक्रोअकशेरुकी (सभी मैक्रोअवेरेब्रेट श्रेणियां एक साथ) और जीवों (मैक्रोअकशेरुकी और अन्य अकशेरुकी श्रेणियों को एक साथ) के लिए रिकॉल और परिशुद्धता को क्रॉस-सत्यापन द्वारा निर्धारित सर्वोत्तम शिक्षण का चयन करने के लिए माना जाता था ( पूरक फ़ाइल 2 में तालिकाएं देखें)। सबसे अच्छा शिक्षण सेट तीन श्रेणियों (मैक्रोअकशेरुकी, अन्य अकशेरुकी जीवों और मलबे) के साथ कच्चे सीखने का सेट था, जिसमें प्रत्येक श्रेणी में 300 वस्तुएं थीं (तालिका 2)। कच्चे सीखने के सेट का उपयोग बाद में स्कैन किए गए नमूनों के उप-समूह में वस्तुओं के स्वचालित वर्गीकरण को मान्य करने के लिए किया गया था।

लर्निंग सेट श्रेणियों की संख्या प्रति श्रेणी छवियाँ जीवों को याद करें मैक्रो-अकशेरुकी जीवों को याद करें 1-सटीक जीव 1-सटीक मैक्रोअकशेरुकी जीव
कच्चा 3 50 0.97 0.84 0.12 0.24
100 0.96 0.87 0.06 0.17
300 0.95 0.91 0.09 0.15
500 0.93 0.88 0.13 0.2
मध्यम 16 50 0.83 0.77 0.17 0.24
100 0.84 0.79 0.15 0.21
300 0.87 0.84 0.14 0.18
अच्छा 20 50 0.89 0.86 0.14 0.18
100 0.9 0.87 0.11 0.14
300 0.9 0.86 0.13 0.14

तालिका 2: प्रत्येक के भीतर श्रेणियों और प्रति श्रेणी वस्तुओं की संख्या के साथ बनाए गए और परीक्षण किए गए शिक्षण सेट (कच्चे, मध्यवर्ती और ठीक)। बनाए गए शिक्षण सेटों की याद और 1-परिशुद्धता। कच्चे सीखने के सेट की श्रेणियाँ: मैक्रोअकशेरुकी (1), अन्य अकशेरुकी (2), मलबे (3)। मध्यम शिक्षण सेट की श्रेणियाँ: लंबे मैक्रोअकशेरुकी (1), लंबे चिकनी मैक्रोअकशेरुकी (2), लंबे स्पाइकी मैक्रोअकशेरुकी (3), गोल मैक्रोअकशेरुकी (4), गोल शेल मैक्रोअकशेरुकी (5), क्लैडोसेरा (6), कोपपोडा (7), ओस्ट्राकोडा (8), समुच्चय (9), फाइबर (10), हेड्स (11), पैर (12), दाग (13), काले दाग (14), हल्के भूरे दाग (15), गोल दाग (16)। फाइन लर्निंग सेट की श्रेणियां: लंबे मैक्रोअकशेरुकी (1), लंबे चिकनी मैक्रोअकशेरुकी (2), लंबे चिकने मैक्रोअकशेरुकी (3), लंबे दौर के मैक्रोअकशेरुकी (4), लंबे स्पाइकी मैक्रोअकशेरुकी (5), राउंड मैक्रोअकशेरुकी (6), राउंड शेल मैक्रोअकशेरुकी (7), राउंड डार्क मैक्रोअकशेरुकी (8), राउंड शेल मैक्रोअकशेरुकी (9), क्लैडोसेरा (10), कोपपोडा (11), ओस्ट्राकोडा (12), कोपपोडा (13), फाइबर (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), फाइबर (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), फाइबर्स (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), फाइबर्स (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), फाइबर (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), फाइबर (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), फाइबर (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), फाइबर (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (13), फाइबर (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14), हेड्स (15), कोपपोडा (14 गहरे दाग (18), हल्के भूरे रंग के दाग (19), गोल दाग (20)।

सर्वश्रेष्ठ शिक्षण सेट के साथ स्वचालित मान्यता का सत्यापन
रैंडम फॉरेस्ट एल्गोरिदम के साथ चयनित लर्निंग सेट द्वारा 42 महीन और मोटे समूहों के उप-समूह में वस्तुओं को स्वचालित रूप से वर्गीकृत किया गया था। मैनुअल सत्यापन के बाद, सभी श्रेणियों के लिए रिकॉल अधिक था (औसतन, मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए 0.94, अन्य अकशेरुकी जीवों के लिए 0.95, और मलबे के लिए 0.92), जबकि संदूषण (1-परिशुद्धता) अन्य अकशेरुकी जीवों (मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए 0.25, अन्य मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए 0.84, और मलबे के लिए 0.01) को छोड़कर कम था (चित्र 5)। ). अन्य अकशेरुकी (माइक्रोक्रस्टेशियन) नमूनों में दुर्लभ थे (42 में से 17 में मौजूद); इस प्रकार, तुलना मजबूत नहीं थी। इसके अलावा, यह श्रेणी अन्य वस्तुओं के आकार और ग्रे स्तरों में समानता के कारण संदूषण से अत्यधिक प्रभावित थी।

स्वचालित बनाम मान्य मैक्रोअकशेरुकी बहुतायत की तुलना से पता चला है कि ये अत्यधिक सहसंबद्ध थे (पियर्सन का आर = 0.92, पी-वैल्यू < 0.0001, एन = 24 मोटे मॉडल के लिए; पियर्सन का आर = 0.98, पी-वैल्यू < 0.0001, एन = 18 महीन सुरंगों के लिए), मलबे से संदूषण के कारण स्वचालित प्रदर्शन द्वारा मामूली अतिवृद्धि के साथ (ढलान < 1) (चित्रा 6)। औसत दीर्घवृत्तीय आयतन की तुलना के संबंध में, सहसंबंध भी अधिक था (पियर्सन का आर = 0.96, पी-मान < 0.0001, एन = 24 मोटे नमूनों के लिए; पियर्सन का आर = 0.99, पी-वैल्यू < 0.0001, एन = 18 महीन नमूनों के लिए), और आकार स्पेक्ट्रम ढलान -1 (चित्रा 6) के करीब था। महीन और मोटे अंशों के बीच ढलानों में अंतर बड़े आकार के अंशों में गलत वर्गीकरण के अधिक प्रभाव को दर्शाता है, जो उनके कम जीवों की गिनती से संबंधित है।

स्वचालित भविष्यवाणी के व्यक्तिगत आकार वितरण के संभाव्यता घनत्व कार्यों ने ठीक भविष्यवाणियों के साथ-साथ मोटे आकार के लिए मान्य भविष्यवाणियों के साथ दृढ़ता से सहमति व्यक्त की। हालांकि, जीवों की संख्या से संबंधित मोटे समूहों के लिए कुछ अपवाद थे और इस प्रकार, उन मामलों में गलत वर्गीकरण का अधिक प्रभाव था, जैसा कि पहले हाइलाइट किया गया था (चित्रा 7)।

व्यक्तिगत आकार वितरण, आकार स्पेक्ट्रा और आकार मैट्रिक्स पर जीवों को छूने का प्रभाव
स्पर्श करने वाले जीवों के पृथक्करण से पहले और बाद में प्राप्त आकार वितरण की तुलना और पांच चयनित नमूनों के उप-समूह में सत्यापन से पहले वस्तुओं को छूने के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया गया था। आकार वितरण की तुलना करने के लिए, मोटे और महीन समूहों को उनके विभाजन के अनुसार, मैक्रोअकशेरुकी समुदाय का प्रतिनिधित्व करने वाले नमूने का पुनर्निर्माण करने के लिए जोड़ा गया था। तीन नमूनों में, सत्यापन के बाद बहुतायत में वृद्धि हुई (>500 व्यक्ति) (चित्रा 8 ए)। इस वृद्धि के बावजूद, औसत दीर्घवृत्तीय मात्रा मान्य नमूनों (चित्रा 8 बी) में गणना की गई एक के लिए बहुत बारीकी से फिट होती है।

सही नमूनों का आकार वितरण (स्पर्श करने वाले जीवों के पृथक्करण के बाद) मान्य नमूनों से थोड़ा भिन्न था। इस प्रकार, कई वस्तुओं की उपस्थिति का उन नमूनों में आकार वितरण पर एक छोटा सा प्रभाव पड़ा (चित्रा 9 ए-ई)। तदनुसार, सही नमूनों के आधार पर गणना की गई आकार विविधता मान्य लोगों की आकार विविधता के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है (पियरसन का आर = 0.94, पी-मान = 0.017, एन = 5) (चित्रा 9 एफ)।

सैद्धांतिक रूप से, कई ट्रॉफिक स्तरों वाले समुदाय के सामान्यीकृत बायोवॉल्यूम आकार स्पेक्ट्रम (एनबीएस) में स्थिरअवस्था स्थितियों में -1 के करीब आने वाले लॉग2 पैमाने में एक आकार स्पेक्ट्रम ढलान होता है। प्राकृतिक समुदायों में NBSS में अक्सर रैखिक वितरण के बजाय एक टक्कर होती है, और यह ज्यादातर सबसे छोटे आकारवर्गों 36 के नमूना पूर्वाग्रह के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, तीसरे आकार का वर्ग NBSS में सबसे आम था।

एनबीएस प्रोटोकॉल (चित्रा 10 ए-सी) के चरणों के बीच काफी समान थे, कुछ स्पेक्ट्रा (चित्रा 10 डी-ई) में कुछ आकार वर्गों को छोड़कर। तदनुसार, सही नमूनों के आधार पर गणना की गई आकार स्पेक्ट्रम ढलान मान्य नमूनों के आधार पर ढलान के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है (पियरसन का आर = 0.99, पी-मान ≤ 0.0001, एन = 5) (चित्रा 10 एफ)।

Figure 2
चित्रा 2: संसाधित होने से पहले और बाद में विभिन्न गुणों के साथ स्कैन की गई छवियों के उदाहरण। (ए, बी) अच्छी स्कैन गुणवत्ता के साथ एक अच्छी छवि की कच्ची छवि (बाएं) और संसाधित छवि (दाएं); (C, D) खराब स्कैन गुणवत्ता (अंधेरे पृष्ठभूमि और बाएं किनारे पर कट छवि) के साथ एक अच्छी छवि की कच्ची छवि (बाएं) और संसाधित छवि (दाएं); (ई, एफ) खराब स्कैन गुणवत्ता (बहुत पिक्सेल वाले अंधेरे पृष्ठभूमि) के साथ एक अच्छी छवि की कच्ची छवि (बाएं) और संसाधित छवि (दाएं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: नमूनों में मौजूद विभिन्न वस्तुओं का प्रतिनिधित्व करने वाले कंटूर विगनेट्स। (ए-ई) मलबा (फाइबर, गोल दाग, मैक्रोअकशेरुकी पैर, दाग और कार्बनिक मलबे); (एफ-आई) मैक्रोअकशेरुकी (कोलोप्टेरा, डिप्टेरा, प्लेकोप्टेरा और ट्राइकोप्टेरा) और (जे-एल) अन्य अकशेरुकी (क्लैडोसेरा, कोपपोडा और ओस्ट्राकोडा)। स्केल सलाखों से 1 मिमी जीएमए = 1.1 का संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एकाधिक वस्तुओं वाले विगनेट्स के उदाहरण. (A) एक फाइबर से जुड़ा एक मैक्रोअकशेरुकी (हाइड्राकेरिना); (बी) एक फाइबर द्वारा एकत्रित कई जीव (केनिडे); और (सी) दो स्पर्श करने वाले मैक्रोअकशेरुकी (चिरोनोमिडे और केनिडे)। स्केल सलाखों से 1 मिमी जीएमए = 1.1 का संकेत मिलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: रिकॉल और संदूषण के बॉक्सप्लॉट (1-परिशुद्धता)। नमूने के उप-समूह (एन = 42) पर मान्य चयनित शिक्षण सेट के मैक्रोअकशेरुकी, अन्य अकशेरुकी जीवों और मलबे (प्रति श्रेणी 300 विगनेट्स) की तीन श्रेणियों के लिए बॉक्सप्लॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: स्वचालित बनाम मान्य वर्गीकरण में बहुतायत और औसत दीर्घवृत्तीय आयतन अनुमानों के बीच तुलना। (A) समूहों में बहुतायत अनुमान (n = 42) और (B) का औसत दीर्घवृत्तीय आयतन अनुमान (n = 42)। गहरे बिंदु मोटे पिंडों (>0.5 सेमी जाल) के अनुरूप हैं; ग्रे डॉट्स बारीक लेंस (>500 μm जाल) के अनुरूप होते हैं। धराशायी रेखा 1: 1 संबंध का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: स्वचालित अनुमानों और मान्य अनुमानों के बीच तुलना के लिए लॉग-स्केल (x-अक्ष) में व्यक्तिगत आकार के सापेक्ष योगदान (y-अक्ष) का प्रतिनिधित्व करने वाले संभाव्यता घनत्व फ़ंक्शन। (A, B) मोटे अनुमानों के लिए स्वचालित और मान्य अनुमान (n = 18), (C, D) ठीक अनुमानों के लिए स्वचालित और मान्य अनुमान (n = 24)। (ए, सी) स्वचालित अनुमानों के बीच तुलना और मान्य अनुमानों के बीच (बी, डी) तुलना। स्पेक्ट्रा को समझने में मदद करने के लिए रंग प्रत्येक उपग्रह का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: चयनित प्राकृतिक नमूनों (बारीक और मोटे नमूनों को एक साथ) से स्पर्श करने वाली वस्तुओं को अलग करने के बाद मान्य नमूनों में बहुतायत और औसत दीर्घवृत्तीय आयतन अनुमानों के बीच तुलना। (A) नमूना फ्रेम (n = 5) और (B) माध्य दीर्घवृत्त आयतन अनुमान (n = 5) द्वारा बहुतायत अनुमान। धराशायी रेखा 1: 1 संबंध का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र 9: संभाव्यता घनत्व फ़ंक्शन लॉग2-स्केल (x-अक्ष) में व्यक्तिगत आकार के सापेक्ष योगदान (y-अक्ष) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो स्वचालित भविष्यवाणी, मान्य भविष्यवाणी, और उनके संबंधित आकार विविधता मूल्यों (Sd) के साथ मान्य भविष्यवाणी के लिए है। लाल रेखा स्वचालित भविष्यवाणी से मेल खाती है, नीली रेखा मान्य भविष्यवाणी से मेल खाती है, और हरी रेखा सही नमूनों से मेल खाती है (छूने वाली वस्तुओं के पृथक्करण के बाद मान्य)। (च) मान्य बनाम सही आकार विविधता अनुमानों की तुलना; धराशायी रेखा 1: 1 संबंध से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्र 10: सामान्यीकृत बायोवॉल्यूम आकार स्पेक्ट्रा (NBSS) और उपचारों के बीच NBSS ढलानों (μ) की तुलना। (A-E) NBSS लॉग-स्केल (x-अक्ष) में प्रत्येक आकार वर्ग के मध्य-बिंदु मान बनाम स्वचालित (लाल क्रॉस), मान्य (नीले त्रिकोण), और उनके संबंधित आकार स्पेक्ट्रम के साथ सही (हरे वृत्त) भविष्यवाणियों के लिए पांच चयनित नमूनों के सामान्यीकृत बायोवॉल्यूम प्रति स्कैनिंग फ्रेम (y-अक्ष) के बीच संबंध का प्रतिनिधित्व करता है। ढलानों (μ) की गणना मॉडल आकार वर्ग से और ऊपर की ओर आकार वर्गों में की जाती है (तीसरे आकार वर्ग को ऊर्ध्वाधर डैश लाइन द्वारा इंगित किया जाता है)। (च) मान्य नमूनों पर गणना की गई ढलानों की तुलना सही नमूनों की तुलना में (स्पर्श वस्तुओं को अलग करने के बाद)। धराशायी रेखा 1: 1 संबंध से मेल खाती है, आर2। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: गणना करने के लिए मैटलैब स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: बनाए गए शिक्षण सेटों की क्रॉस-सत्यापन, याद और 1-परिशुद्धता। (ए) 3 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 50 विगनेट्स के साथ रॉ लर्निंग सेट; (बी) 3 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 100 विगनेट्स के साथ कच्ची शिक्षा सेट; (ग) प्रति श्रेणी 3 श्रेणियों और 300 विगनेट्स के साथ कच्ची शिक्षा सेट; (डी) 3 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 500 विगनेट्स के साथ कच्ची शिक्षा सेट; (ई) प्रति श्रेणी 5 श्रेणियों और 50 विगनेट्स के साथ कच्ची शिक्षा सेट; (च) प्रति श्रेणी 5 श्रेणियों और 100 विगनेट्स के साथ कच्ची शिक्षा सेट; (छ) 5 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 300 विगनेट्स के साथ कच्ची शिक्षा सेट; (ज) 16 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 50 विगनेट्स के साथ मध्यवर्ती शिक्षण सेट; (i) 16 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 100 विगनेट्स के साथ मध्यवर्ती शिक्षण सेट; (जे) 16 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 300 विगनेट्स के साथ इंटरमीडिएट लर्निंग सेट; (के) प्रति श्रेणी 20 श्रेणियों और 50 विगनेट्स के साथ फाइन लर्निंग सेट; (एल) 20 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 100 विगनेट्स के साथ फाइन लर्निंग सेट; और (एम) 20 श्रेणियों और प्रति श्रेणी 300 विगनेट्स के साथ फाइन लर्निंग सेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

नदी के मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए गोर्स्की एट अल 2010 द्वारा वर्णित पद्धति का अनुकूलन मीठे पानी के मैक्रोअकशेरुकी जीवों में सामुदायिक आकार संरचना का अनुमान लगाने में उच्च वर्गीकरण सटीकता की अनुमति देता है। परिणाम बताते हैं कि प्रोटोकॉल एक नमूने में व्यक्तिगत आकार संरचना का अनुमान लगाने के समय को लगभग 1 घंटे तक कम कर सकता है। इस प्रकार, प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उद्देश्य मीठे पानी के पारिस्थितिक तंत्र में गड़बड़ी के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक तेज और एकीकृत बायोइंडिकेटर के रूप में मैक्रोअकशेरुकी आकार स्पेक्ट्रा के नियमित उपयोग को बढ़ावा देना है। तटीय लैगूनकी पारिस्थितिक स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए मैक्रोअकशेरुकी आकार स्पेक्ट्रम का उपयोग पहले ही एक सफल सूचकांक के रूप में किया जा चुका है। प्रोटोकॉल के विकास के साथ, बड़े स्थानिक और अस्थायी पैमानों को कवर करने वाले क्षेत्र निगरानी अभियानों को सक्षम करने के लिए अकशेरुकी जीवों पर गहन सर्वेक्षण किए जा सकते हैं।

चूंकि इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वर्गीकरण की अवहेलना करते हुए, नमूना समुदाय के व्यक्तिगत आकार वितरण को त्वरित तरीके से प्राप्त करना है, इसलिए यहां प्रस्तावित एक की तरह सरल शिक्षण सेट बनाने की सिफारिश की जाती है। श्रेणियों की अधिक संख्या के साथ बेहतर शिक्षण सेटों के परीक्षण, समग्र रूप से मैक्रोअकशेरुकी जीवों के लिए कम याद और सटीकता देते हैं (तालिका 2), और सत्यापन चरण अधिक समय लेने वाला है।

स्वचालित भविष्यवाणी ने विभिन्न नमूना साइटों से 42 प्राकृतिक अवशेषों की मान्य भविष्यवाणी के साथ दृढ़ता से सहमति व्यक्त की, यह सुझाव देते हुए कि स्वचालित मोड में विधि प्राकृतिक नमूनों में मैक्रोअकशेरुकी जीवों की गिनती और मापने के लिए उपयुक्त है (चित्रा 6)। इसके अलावा, स्वचालित और मान्य भविष्यवाणियों और रैखिक सैद्धांतिक मॉडल के लिए उच्च फिट के बीच एनबीएस में समानता से पता चलता है कि स्वचालित मोड सैद्धांतिक पारिस्थितिक अध्ययन (चित्रा 10) को आगे बढ़ाने के लिए एक आशाजनक तरीका है।

इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, कई मुद्दों का सामना करना पड़ा, और उन्हें विभिन्न तरीकों से हल या कम किया गया। मैक्रोअकशेरुकी नमूनों को स्कैन करते समय ध्यान में रखने के लिए एक मुद्दा अंधेरे संतृप्त क्षेत्रों की उपस्थिति है। इस प्रकार, इस समस्या का पता लगाने और यदि आवश्यक हो तो स्कैन को दोहराने के लिए जितनी जल्दी हो सके संसाधित, स्कैन की गई छवियों की जांच करना महत्वपूर्ण है। प्लवक33 को स्कैन करते समय भी यह समस्या पाई गई है, लेकिन नल के पानी के बजाय इथेनॉल के उपयोग से यह बढ़ जाती है। नल के पानी का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि 70% इथेनॉल में संरक्षित जीव सतह पर बह जाएंगे। भले ही डिवाइस को पतला इथेनॉल (5%) का विरोध करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, अकशेरुकी नमूने 70% इथेनॉल के साथ संरक्षित हैं। इथेनॉल की कम सांद्रता के साथ संचालन की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि जीवों को पुनर्जलीकरण और निर्जलीकरण प्रक्रियाओं के माध्यम से क्षतिग्रस्त किया जा सकताहै। प्रस्तावित समाधान, जो अत्यधिक अनुशंसित है, इथेनॉल के साथ किए गए प्रत्येक स्कैन के बाद स्कैन ट्रे को ताजे पानी से कई बार कुल्ला करना है। यह अवक्षेप के संचय से बचता है जो छवि पृष्ठभूमि को बदल सकता है और स्कैन ट्रे के ग्लास को संक्षारण से बचाता है।

एक और पता लगाया गया मुद्दा कई जीवों के साथ विगनेट्स की उपस्थिति है, जो कुछ आकारों के व्यक्तियों के कम आंके जाने के कारण आकार स्पेक्ट्रम को बदल सकता है। जब कई वस्तुओं के साथ विगनेट्स की संख्या कम होती है (<10%), जैसा कि इस अध्ययन में है, कई वस्तुओं की उपस्थिति का उन नमूनों में आकार वितरण और एनबीएस पर एक छोटा प्रभाव पड़ता है (चित्रा 9 और चित्रा 10)। यह इंगित करता है कि, मैक्रोअकशेरुकी समुदाय की प्रतिनिधि आकार संरचना प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल के चरण 1.5 (स्पर्श करने वाले जीवों का पृथक्करण) में समय का निवेश करना आवश्यक नहीं है, जिसके लिए छवि पुनर्संसाधन लगभग 1.5 घंटे तक रहता है। इसके बजाय, प्रोटोकॉल के चरण 2.5 (लकड़ी की सुई का उपयोग करके जीवों या समुच्चय को अलग करना) में समय लेने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, जो बहुत कम समय लेने वाला (अधिकतम 30 मिनट) है और स्वचालित मोड30 में आकार वितरण का उचित अनुमान सुनिश्चित करता है। स्पर्श करने वाले जीवों की संख्या को कम करने का एक विकल्प प्रति स्कैन कम जीवों के साथ काम करना है, लेकिन उच्च संख्या में अंशों में एक नमूने को स्कैन करने में निवेश की गई समय प्रतिबद्धता और जीवों के एकत्रीकरण की संभावना को ध्यान में रखा जाना चाहिए। एक अन्य समाधान केवल एक नमूना को संरक्षित करना होगा जो सभी नमूना जीवों को संरक्षित करने के बजाय प्रयोगशाला में जीवों को क्रमबद्ध करते समय एक प्रतिनिधि आकार स्पेक्ट्रम की गणना करने की अनुमति देगा, जैसा कि इस काम में किया गया है। प्रति नमूने जीवों की संख्या में कमी जीवों को छूने की संभावना को कम कर देगी। इसके अलावा, जब कम व्यक्तियों को संग्रहीत किया जाता है, तो नमूने में कम मलबा होता है, जो पृथक्करण की सुविधा प्रदान करता है, खासकर अगर फाइबर से बचा जा सकता है।

स्वचालित वर्गीकरण विधि की देखी गई सीमा उपयोग किए गए नमूनों में माइक्रोक्रस्टेशियन (श्रेणी: अन्य मैक्रोअकशेरुकी) की कम उपस्थिति से संबंधित है। माइक्रोक्रस्टेशियन के प्रतिनिधित्व की कमी उनके सही वर्गीकरण को प्रभावित कर सकती है और इस श्रेणी के लिए स्वचालित भविष्यवाणी की सटीकता को सीमित कर सकती है। फिर भी, अन्य श्रेणियां, मलबे और मैक्रोअकशेरुकी, जो इस काम का मुख्य उद्देश्य हैं, उच्च स्मरण और परिशुद्धता प्रस्तुत करते हैं। इस स्कैनर डिवाइस का उपयोग करने के विकल्प पानी के फ्रेम को पकड़ने के लिए एक सामान्य स्कैनर को अनुकूलित करना होगा, नमूना प्रसंस्करण और मशीन सीखने के लिए ओपन-सोर्स कोड को बढ़ावा देना होगा, और कैमरे के साथ माइक्रोस्कोप के नीचे या कैमरों के एक सेट के साथ फ्लक्स के माध्यम से जीवों को मापने के लिए कोड लिखना होगा। यह कई अवसरों पर किया गया है 23,24,25,26,38,39,40, लेकिन हम जिस विधि का प्रस्ताव करते हैं वह तुलनीय आकार के अनुमान प्राप्त करने के लिए स्कैनिंग पैरामीटराइजेशन को नियंत्रित करता है, जिसे अन्य प्रणालियों के साथ नियंत्रित करना मुश्किल है। इसके अलावा, प्रस्तावित प्रोटोकॉल और स्कैनिंग डिवाइस उपयोग करने के लिए तैयार हैं, ओपन-सोर्स, और पहले से ही समुद्री मेसोज़ोप्लांकटन समुदाय में स्थापित हैं। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन मीठे पानी के मैक्रोअकशेरुकी जीवों की आकार संरचना को कुशलतापूर्वक प्राप्त करने और मीठे पानी के जैव मूल्यांकन के लिए आकार मैट्रिक्स की क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस स्वचालित इमेजिंग विधि का उपयोग करने के लिए एक आशाजनक एवेन्यू प्रदर्शित करता है।

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Disclosures

लेखक कोई संभावित प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को स्पेनिश विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालयों के मंत्रालय (अनुदान संख्या आरटीआई 2018-095363-बी-आई00) द्वारा समर्थित किया गया था। हम सीईआरएम-यूविक-यूसीसी सदस्यों एलिया ब्रेटेक्सा, अन्ना कोस्टारोसा, लाइया जिमनेज़, मारिया इसाबेल गोंजालेज, मार्टा जुत्गलार, फ्रांसेस्क लाच और नुरिया सेलारेस को मैक्रोअकशेरुकी फील्ड सैंपलिंग और प्रयोगशाला छंटाई में उनके काम के लिए और डेविड अल्बेसा को नमूना स्कैनिंग में सहयोग करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम अंततः प्रयोगशाला सुविधाओं और स्कैनर डिवाइस के उपयोग के लिए जोसेफ मारिया गिली और इंस्टीट्यूट डी सिएन्सीज़ डेल मार (आईसीएम-सीएसआईसी) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker Labbox Other containers could be used
Dionized water Icopresa  8420239600123 To dilute the ethanol
Funnel Vitlab 41094
Glass vials 8 ml Labbox SVSN-C10-195 1 vial/subsample
ImageJ Software  Free access Version 4.41o/ Image processing software
Large frame Hydroptic  Provided by ZooScan 24.5 cm x 15.8 cm
Monalcol 96 (Ethanol 96) Montplet 1050JE001
Plankton Identifier Software Free access Version 1.2.6/ Automatic identification software
Sieve Cisa 26852.2 Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm
Tweezers Bondline B5SA Stainless, anti-magnetic, anti-acid
VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software Hydroptic Version 9.0.51/ Sacn software
Wooden needle Any plastic or wood needle can be used
Zooprocess Software  Free access Version 7.14/Image processing software
ZooScan  Hydroptic 54 Version III/ Scanner

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 191
नदी के मैक्रोअकशेरुकी जीवों की सामुदायिक आकार संरचना निर्धारित करने के लिए स्वचालित छवि प्रसंस्करण
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Gurí, R., Arranz, I., Ordeix, M., García-Comas, C. Automatic Image Processing to Determine the Community Size Structure of Riverine Macroinvertebrates. J. Vis. Exp. (191), e64320, doi:10.3791/64320 (2023).

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