Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

المعالجة التلقائية للصور لتحديد هيكل حجم المجتمع لللافقاريات النهرية الكبيرة

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64320
Automatic Translation
1,4, 2,4, 1,4, 3,4
1Center for the Study of Mediterranean Rivers (CERM), Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya, 2Laboratoire Evolution et Diversité Biologique (EDB), UMR5174, Université Toulouse 3 Paul Sabatier, Centre national de la recherche scientifique (CNRS), Institut de Recherche pour le Développement (IRD), 3Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 4Aquatic Ecology Group, Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya

Summary

تستند المقالة إلى إنشاء بروتوكول مكيف لمسح واكتشاف وفرز وتحديد الأشياء الرقمية المقابلة لللافقاريات الكبيرة في الأنهار القاعية باستخدام إجراء تصوير شبه آلي. يسمح هذا الإجراء بالحصول على توزيعات الحجم الفردية ومقاييس الحجم لمجتمع اللافقاريات الكبيرة في حوالي 1 ساعة.

Abstract

حجم الجسم هو سمة وظيفية مهمة يمكن استخدامها كمؤشر حيوي لتقييم آثار الاضطرابات في المجتمعات الطبيعية. يستجيب هيكل حجم المجتمع للتدرجات الأحيائية وغير الحيوية ، بما في ذلك الاضطرابات البشرية المنشأ عبر الأصناف والنظم الإيكولوجية. ومع ذلك، فإن القياس اليدوي للكائنات الصغيرة الجسم مثل اللافقاريات القاعية الكبيرة (على سبيل المثال، >500 ميكرومتر إلى بضعة سنتيمترات) يستغرق وقتا طويلا. لتسريع تقدير هيكل حجم المجتمع ، قمنا هنا بتطوير بروتوكول لقياس حجم الجسم الفردي لللافقاريات النهرية المحفوظة بشكل شبه تلقائي ، والتي تعد واحدة من المؤشرات الحيوية الأكثر استخداما لتقييم الحالة البيئية للنظم الإيكولوجية للمياه العذبة. تم تكييف هذا البروتوكول من منهجية موجودة تم تطويرها لمسح العوالق البحرية المتوسطة باستخدام نظام مسح مصمم لعينات المياه. ويتألف البروتوكول من ثلاث خطوات رئيسية هي: (1) مسح العينات الفرعية (كسور حجم العينة الدقيقة والخشنة) من اللافقاريات النهرية الكبيرة ومعالجة الصور الرقمية لإضفاء الطابع الفردي على كل كائن مكتشف في كل صورة؛ و (2) مسح العينات الفرعية (كسور حجم العينات الدقيقة والخشنة) من اللافقاريات النهرية الكبيرة ومعالجة الصور الرقمية لإضفاء الطابع الفردي على كل كائن مكتشف في كل صورة؛ و (2) مسح العينات الفرعية (كسور حجم العينات الدقيقة والخشنة) من اللافقاريات النهرية الكبيرة ومعالجة الصور الرقمية لإضفاء الطابع الفردي على كل كائن مكتشف في كل صورة؛ و (2) مسح (2) إنشاء وتقييم والتحقق من صحة مجموعة التعلم من خلال الذكاء الاصطناعي لفصل الصور الفردية لللافقاريات الكبيرة بشكل شبه تلقائي عن المخلفات والتحف في العينات الممسوحة ضوئيا ؛ و (3) يصور هيكل حجم مجتمعات اللافقاريات الكبيرة. بالإضافة إلى البروتوكول ، يتضمن هذا العمل نتائج المعايرة ويعدد العديد من التحديات والتوصيات لتكييف الإجراء مع عينات اللافقاريات الكبيرة والنظر في مزيد من التحسينات. وبشكل عام، تدعم النتائج استخدام نظام المسح المقدم للقياس التلقائي لحجم جسم اللافقاريات النهرية الكبيرة وتشير إلى أن تصوير طيف حجمها هو أداة قيمة للتقييم البيولوجي السريع للنظم الإيكولوجية للمياه العذبة.

Introduction

تستخدم اللافقاريات القاعية الكبيرة على نطاق واسع كمؤشرات حيوية لتحديد الحالة البيئية للمسطحات المائية1. تركز معظم المؤشرات لوصف مجتمعات اللافقاريات الكبيرة على المقاييس التصنيفية. ومع ذلك ، يتم تشجيع أدوات التقييم البيولوجي الجديدة التي تدمج حجم الجسم لتوفير منظور بديل أو تكميلي لنهج التصنيف 2,3.

يعتبر حجم الجسم مشط شعر مرتبط بسمات حيوية أخرى مثل التمثيل الغذائي والنمو والتنفس والحركة4. علاوة على ذلك ، يمكن أن يحدد حجم الجسم الموقف الغذائي والتفاعلات5. تعرف العلاقة بين حجم الجسم الفردي والكتلة الحيوية الطبيعية (أو الوفرة) حسب فئة الحجم في المجتمع على أنها طيف الحجم6 وتتبع النمط العام للانخفاض الخطي في الكتلة الحيوية الطبيعية مع زيادة الحجم الفردي على مقياس لوغاريتمي7. تمت دراسة منحدر هذه العلاقة الخطية على نطاق واسع نظريا ، واستخدمتها الدراسات التجريبية عبر النظم الإيكولوجية كمؤشر بيئي لهيكل حجم المجتمع4. ومن المؤشرات التركيبية الأخرى لهيكل حجم المجتمع الذي تم استخدامه بنجاح في دراسات أداء النظم الإيكولوجية للتنوع البيولوجي تنوع حجم المجتمع ، والذي يتم تمثيله كمؤشر شانون لفئات الحجم في طيف الحجم أو نظيره ، والذي يتم حسابه بناء على توزيعات الحجم الفردية8.

وفي النظم الإيكولوجية للمياه العذبة، يستخدم هيكل حجم المجموعات الحيوانية المختلفة كمؤشر رننحي لتقييم استجابة المجتمعات الأحيائية للتدرجات البيئية9،10،11 والاضطرابات البشرية المنشأ12،13،14،15،16. اللافقاريات الكبيرة ليست استثناء ، ويستجيب هيكل حجمها أيضا للتغيرات البيئية17,18 والاضطرابات البشرية المنشأ ، مثل التعدين 19 ، أو استخدام الأراضي 20 ، أو تخصيب النيتروجين (N) والفوسفور (P)20,21,22. ومع ذلك ، فإن قياس مئات الأفراد لوصف هيكل حجم المجتمع هو مهمة شاقة وتستغرق وقتا طويلا وغالبا ما يتم تجنبها كقياس روتيني في المختبرات بسبب ضيق الوقت. وبالتالي ، تم تطوير العديد من طرق التصوير شبه الأوتوماتيكية أو الأوتوماتيكية لتصنيف وقياس العينات23،24،25،26. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق تركز على التصنيف التصنيفي أكثر من التركيز على الحجم الفردي للكائنات الحية وليست جاهزة للاستخدام لجميع أنواع اللافقاريات الكبيرة. في بيئة العوالق البحرية ، تم استخدام نظام تحليل صور المسح على نطاق واسع لتحديد الحجم والتكوين التصنيفي لمجتمعات العوالق الحيوانية27،28،29،30،31. يمكن العثور على هذه الأداة في العديد من المعاهد البحرية في جميع أنحاء العالم ، ويتم استخدامها لمسح عينات العوالق الحيوانية المحفوظة للحصول على صور رقمية عالية الدقة للعينة بأكملها. يكيف البروتوكول الحالي استخدام هذه الأداة لتقدير طيف مجتمع اللافقاريات الكبيرة في الأنهار بطريقة تلقائية سريعة دون الاستثمار في إنشاء جهاز جديد.

يتكون البروتوكول من مسح عينة ومعالجة الصورة بأكملها للحصول تلقائيا على صور مفردة (أي المقالات القصيرة) للكائنات الموجودة في العينة. تميز العديد من مقاييس الشكل والحجم وميزات المستوى الرمادي كل كائن وتسمح بالتصنيف التلقائي للكائنات إلى فئات ، والتي يتم التحقق من صحتها بعد ذلك بواسطة خبير. يتم حساب الحجم الفردي لكل كائن حي باستخدام الحجم الحيوي الإهليلجي (مم3) ، والذي يتم اشتقاقه من مساحة الكائن الحي المقاسة بالبكسل. هذا يسمح بالحصول على طيف حجم العينة بطريقة سريعة. على حد علمنا ، تم استخدام نظام التصوير الضوئي هذا فقط لمعالجة عينات العوالق الحيوانية المتوسطة ، ولكن من المحتمل أن يسمح الجهاز بالعمل مع اللافقاريات القاعية في المياه العذبة.

وبالتالي ، فإن الهدف العام من هذه الدراسة هو تقديم طريقة للحصول بسرعة على الحجم الفردي لللافقاريات النهرية المحفوظة من خلال تكييف بروتوكول موجود كان يستخدم سابقا مع العوالق البحرية المتوسطة27،32،33. يتكون الإجراء من استخدام نهج شبه تلقائي يعمل بجهاز مسح ضوئي لمسح عينات المياه وثلاثة برامج مفتوحة لمعالجة الصور الممسوحة ضوئيا. يتم هنا تقديم بروتوكول معدل لمسح واكتشاف وتحديد اللافقاريات النهرية الرقمية للحصول تلقائيا على هيكل حجم المجتمع ومقاييس الحجم ذات الصلة. كما يتم تقديم تقييم الإجراء والمبادئ التوجيهية لتعزيز الكفاءة بناء على 42 صورة ممسوحة ضوئيا لعينات اللافقاريات النهرية الكبيرة التي تم جمعها من ثلاثة أحواض في شبه الجزيرة الأيبيرية الشمالية الشرقية (NE) (Ter و Segre-Ebre و Besòs).

تم جمع العينات على امتدادات النهر 100 متر وفقا لبروتوكول أخذ العينات الميدانية والتحليل المختبري لللافقاريات الكبيرة في الأنهار القاعية في الأنهار القابلة للعبور من الحكومة الإسبانية34. تم جمع العينات باستخدام جهاز أخذ العينات (الإطار: 0.3 م × 0.3 م ، شبكة: 250 ميكرومتر) بعد مسح متعدد الموائل. في المختبر ، تم تنظيف العينات وغربلتها من خلال شبكة 5 مم و 500 ميكرومتر للحصول على عينتين فرعيتين: عينة فرعية خشنة (شبكة 5 مم) وعينة فرعية دقيقة (شبكة 500 ميكرومتر) ، والتي تم تخزينها في قوارير منفصلة وحفظها في 70٪ من الإيثانول. يسمح فصل العينة إلى كسرين بحجم تقدير أفضل لهيكل حجم المجتمع ، نظرا لأن الكائنات الكبيرة أكثر ندرة وأقل من الكائنات الصغيرة. خلاف ذلك ، فإن العينة الممسوحة ضوئيا لها تمثيل متحيز للجزء كبير الحجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يعتمد البروتوكول الموصوف هنا على النظام الذي طوره Gorsky et al.27 للعوالق البحرية المتوسطة. يمكن العثور على وصف محدد للماسح الضوئي (ZooSCAN) ، وبرنامج المسح الضوئي (VueScan 9x64 [9.5.09]) ، وبرنامج معالجة الصور (Zooprocess ، ImageJ) ، وبرنامج التعرف التلقائي (معرف العوالق) في المراجع السابقة32،33. لضبط أحجام اللافقاريات القاعية بشكل أفضل فيما يتعلق بالعوالق الحيوانية المتوسطة ، بمجرد إنشاء المشروع وفقا للبروتوكولالأصلي 32,33 ، قم بتغيير معلمة الحجم الأدنى (minsizeesd_mm) إلى 0.3 مم والمعلمة من الحجم الأقصى (maxsizeesd_mm) إلى 100 مم في ملف التكوين. للمساعدة في اتباع البروتوكول ، يتم تلخيص ذلك في مخطط العمل (الشكل 1). يتم تخزين المشروع الذي تم إنشاؤه في المجلد C الخاص بالكمبيوتر ويتم تنظيمه في المجلدات التالية: PID_process و Zooscan_back و Zooscan_check و Zooscan_config و Zooscan_meta و Zooscan_results و Zooscan_scan. يتكون كل مجلد من عدة مجلدات فرعية تستخدمها تطبيقات البرامج المختلفة في الخطوات التالية من البروتوكول.

1. اقتناء الصور الرقمية لعينات اللافقاريات الكبيرة

  1. مسح ومعالجة الفراغ
    ملاحظة: قم بإنشاء صورتين فارغتين يوميا قبل المسح الضوئي لاستخراج عمليات المسح الضوئي في الخلفية أثناء معالجة الصور الممسوحة ضوئيا في نفس اليوم.
    1. قم بتشغيل الماسحة الضوئية وقم بتشغيل الضوء في الوضع المزدوج لعرض الضوء الأبيض من الأعلى ومن الأسفل.
      ملاحظة: عند مسح عينات العوالق الحيوانية المتوسطة ، يتم استخدام اتجاه الضوء الصاعد ، ولكن نظرا لأن اللافقاريات الكبيرة أكثر غموضا ، فمن المستحسن تبديل الضوء إلى وضع مزدوج.
    2. نظف وشطف درج المسح بماء الصنبور.
    3. صب 110 مل من ماء الصنبور المخزن في درجة حرارة الغرفة (RT) في درج المسح الضوئي حتى يتم تغطية الزجاج. ضع الإطار الكبير (24.5 سم × 15.8 سم) على درج المسح الضوئي في الموضع الصحيح (مع وجود الزاوية في الجزء العلوي الأيسر من درج المسح الضوئي)، واملأه بماء الصنبور حتى يتم تغطية خطوة الإطار لتجنب تأثير الغضروف المفصلي، والذي من شأنه أن يغير الصورة الممسوحة ضوئيا. أغلق غطاء الماسحة الضوئية.
      ملاحظة: استخدم الماء في RT لتجنب التكثيف وتكوين الفقاعات. نظف الإطار بدون علامات أو قطرات لتجنب انعكاس الضوء.
    4. انتقل إلى برنامج معالجة الصور ، وحدد مشروع العمل ، وانقر فوق مسح (تحويل) صورة الخلفية.
    5. انتقل إلى برنامج المسح وانقر على معاينة. تأكد من معاينة الصورة الممسوحة ضوئيا ، وتحقق من عدم وجود خطوط أو بقع ، وانتظر لمدة 30 ثانية على الأقل قبل بدء مسح آخر. انقر فوق Scan (مسح ضوئي) واضغط على OK (موافق) في نافذة الإرشادات قبل الفحص الثاني لإرسال البيانات من برنامج المسح الضوئي إلى برنامج معالجة الصور.
      ملاحظة: قم بإجراء المسح الضوئي مرتين للحصول على عمليتي المسح الضوئي في الخلفية اللتين ستكونان من الفراغ. تتم هذه الخطوة مرة واحدة كل يوم قبل بدء معالجة العينة ، ويتم تخزين الصور في مجلد Zooscan_back.
    6. أغلق برنامج المسح الضوئي بعد الانتهاء من الفحص.
  2. تحضير العينات ومسحها ضوئيا
    تنبيه: الإيثانول سائل قابل للاشتعال ويمكن أن يسبب تلفا / تهيجا خطيرا للعين.
    1. املأ عينة البيانات الوصفية. انتقل إلى برنامج معالجة الصور وحدد تعبئة عينة البيانات الوصفية. أدخل نموذج الهوية، وانقر فوق موافق، واملأ البيانات الوصفية.
      ملاحظة: تم إنشاء ملف التعريف خصيصا لعينات العوالق الحيوانية المتوسطة ، لذلك لا يتناسب مع منهجية أخذ عينات اللافقاريات القاعية الكبيرة ، ومع ذلك يجب ملء جميع حقول الملف قبل الفحص ، أو ستظهر علامة خطأ.
    2. صب 110 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ في درج المسح حتى يتم تغطية الزجاج ووضع الإطار الكبير (24.5 سم × 15.8 سم) مع الزاوية في الجزء العلوي الأيسر من درج المسح.
      ملاحظة: العمل مع الإيثانول بدلا من الماء ، حيث يتم حفظ اللافقاريات الكبيرة في الإيثانول. في الماء ، تطفو وتنجرف في درج المسح الضوئي ، مما يمنع الصورة الحادة ، وبالتالي قياسات الحجم الموثوقة. يجب حفظ الإيثانول في RT لتجنب التكثيف وتكوين الفقاعات.
    3. صب عينة اللافقاريات الكبيرة في درج المسح الذي يحده الإطار ، وقم بتغطية خطوة الإطار بمزيد من الإيثانول إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: الامتناع عن إضافة الكثير من الإيثانول لتجنب الكائنات الحية العائمة والانجراف.
    4. قم بتجانس العينة في جميع أنحاء منطقة الإطار ، ووضع أكبر الأفراد في وسط الدرج لمعالجة الصور بشكل صحيح ، وإغراق الكائنات الحية العائمة باستخدام إبرة خشبية.
      ملاحظة: إذا كانت العينة الفرعية تحتوي عدديا على أكثر من 1000 فرد، فقم بتقسيم العينة الفرعية إلى كسرين أو أكثر لتقليل لمس الكائنات الحية في الصورة الممسوحة ضوئيا، وامسح الكسور ضوئيا بشكل منفصل.
    5. افصل الكائنات الحية التي تلامس والكائنات الحية التي تلامس حواف الإطار باستخدام الإبرة الخشبية.
      ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة 5-20 دقيقة. تعتبر الكائنات الحية التي تلمس كائنا واحدا بواسطة البرنامج. وبالتالي ، في هذه الحالات ، لا تتوافق الأحجام الفردية المحسوبة مع الكائنات الفردية الفعلية ويمكن أن تؤدي إلى تحيز تقدير هيكل حجم المجتمع. هناك إمكانية لتحرير الصورة باستخدام برنامج معالجة الصور لفصلها ، ولكن هذه الخطوة الإضافية تتضمن 1.5 ساعة على الأقل من إعادة المعالجة ؛ وبالتالي ، يوصى بشدة بالفصل اليدوي.
    6. لمسح العينة ضوئيا ، أغلق غطاء الماسحة الضوئية ، وانتقل إلى برنامج معالجة الصور ، وحدد مشروع العمل ، وانقر فوق SCAN Sample with Zooscan (للأرشفة ، بدون عملية).
    7. حدد العينة واتبع التعليمات.
    8. انتقل إلى برنامج المسح وانقر على معاينة. تأكد من معاينة الصورة الممسوحة ضوئيا ، وتحقق من عدم وجود خطوط أو بقع ، وانتظر 30 ثانية على الأقل قبل بدء مسح آخر.
    9. بعد 30 ثانية على الأقل ، انقر فوق الزر Scan في برنامج المسح.
      ملاحظة: اضغط على OK في برنامج معالجة الصور بعد الضغط على Scan (مسح ضوئي ) في برنامج المسح الضوئي. لا تضغط على أي مفتاح على لوحة مفاتيح الكمبيوتر ، وتجنب اهتزازات الفحص أثناء المسح. يتم إنشاء ثلاثة ملفات في مجلد Zooscan_scan > _raw : (i) تنسيق ملف صورة موسومة (.tif) (16 بت) ؛ (ii) مستند نصي قياسي يسمى LOG (.txt) يسجل معلومات عن معلمات المسح الضوئي ؛ و (iii) وثيقة نصية قياسية تسمى META (.txt) مع معلومات عن طرق أخذ العينات.
    10. تحقق من صحة الفحص الخام.
      ملاحظة: إذا كان الفحص يحتوي على خطوط ضوئية أو مشكلات مرئية أخرى، ففكر في تكرار الفحص لتجنب حدوث مشكلات في الخطوات التالية.
  3. استعادة العينة
    1. قم بإزالة الإطار وشطفه فوق درج المسح باستخدام زجاجة ضغط مملوءة بنسبة 70٪ من الإيثانول لاستعادة أي لافقاريات كبيرة متصلة.
    2. ارفع الجزء العلوي من الماسح الضوئي لاسترداد جميع الكائنات الحية والإيثانول من الدرج عبر قمع استرجاع المسح الضوئي إلى دورق. مع استمرار رفع الجزء العلوي من الماسح الضوئي ، اشطف الدرج بزجاجة الضغط لمسح أي كائنات متبقية.
    3. مرر العينات والإيثانول من الدورق عبر شبكة 500 ميكرومتر للاحتفاظ باللافقاريات في الشبكة ، وتخزينها مرة أخرى في قنينة تحتوي على 70٪ من الإيثانول.
    4. بمجرد استرداد جميع العينات في القارورة ، قم بتنظيف الدرج بماء الصنبور.
      ملاحظة: اغسل الدرج بماء الصنبور بين العينات لتقليل ترسيب الإيثانول ، مما يغير معالجة الصورة. اشطف الإطار بماء الصنبور لتجنب الأضرار المحتملة المتعلقة باستخدام الإيثانول. في نهاية اليوم ، قم بتنظيف الدرج باستخدام ماء الصنبور وجففه برفق بالورق لتجنب الخدوش.
  4. معالجة الصور
    1. انتقل إلى برنامج معالجة الصور وحدد تحويل ومعالجة الصور والكائنات الحية في وضع الدفعات ثم تحويل ومعالجة الصورة والجسيمات (الصورة في مجلد RAW). احتفظ بالإعدادات الافتراضية وانقر فوق موافق. ستظهر النهاية العادية في نهاية العملية.
      ملاحظة: سيتم إنشاء ملف PID والمقالات القصيرة المقابلة لجميع الكائنات المكتشفة في الصورة الممسوحة ضوئيا (في ملف مجموعة الصور المشتركة [.jpg]) في مجلد Zooscan_scan > _work. ملف PID هو ملف واحد يخزن جميع البيانات الوصفية (ملف التعريف) ، والبيانات الفنية المرتبطة بملف السجل ، وجدول يحتوي على 36 متغيرا مقاسا لجميع الكائنات المكتشفة في الصورة. تتوافق المتغيرات المقاسة مع تقديرات مختلفة للمستوى الرمادي والبعد الكسوري والشكل والحجم. المتغيرات التي يمكن استخدامها لتقدير الحجم هي المساحة والمحاور الرئيسية والثانوية للقطع الناقص بمساحة مساوية للكائن (انظر القسم 3 من البروتوكول). يعتمد وقت المعالجة على كثافة الصورة وخصائص الكمبيوتر ، ويمكن إطلاقها بين العينات أثناء استعادة وإعداد العينة التالية. خلاف ذلك ، يوصى ببدء معالجة العينات الممسوحة ضوئيا كل يوم في وضع الدفعات أثناء الليل والتحقق من معالجة الصور المناسبة في صباح اليوم التالي.
    2. تحقق مما إذا كانت الخلفية في الصورة المعالجة قد تم طرحها بشكل مناسب من صورة العينة باستخدام برنامج معالجة الصور أو عن طريق التحقق من صور القناع (المنتهية في MSK1.gif) الموجودة في Zooscan_scan > _work. إذا كانت الخلفية تحتوي على مناطق مشبعة أو العديد من النقاط ، ففكر في تكرار الفحص لضمان صور عالية الجودة.
      ملاحظة: لتجنب المناطق المشبعة في الخلفية ، يجب شطف درج المسح بماء الصنبور بعد كل مسح بالإيثانول. من المهم أيضا (1) تقليل عدد الأفراد الممسوحين ضوئيا (عن طريق تجزئة العينة والمسح الضوئي في طيات مختلفة) ؛ (2) تأكد من وضع الكائنات الحية الكبيرة في وسط درج المسح ؛ (3) استخدام الإيثانول النظيف والمصفى ؛ (4) تقليل الأوساخ على العينات ؛ (5) التأكد من أن حجم الإيثانول للمسح كاف ؛ و (6) تأكد من أن التأخير بين معاينة العينة والمسح الضوئي لا يقل عن 30 ثانية.
  5. فصل الكائنات الحية التي تلامس
    ملاحظة: عندما يكون هناك العديد من المقالات القصيرة مع الكائنات الحية اللامسة ، من الضروري فصل صور الكائنات الملامسة عن الكائنات الأخرى و / أو عن الألياف / الحطام لضمان تقدير مناسب لهيكل حجم المجتمع.
    1. انتقل إلى برنامج معالجة الصور لاكتشاف المقالات القصيرة ذات الكائنات المتعددة. حدد الفصل باستخدام المقالات القصيرة واضغط على موافق. في نافذة تحديد التكوين ، احتفظ بالإعدادات الافتراضية وانقر فوق موافق.
    2. في النافذة الفصل عن المقالات القصيرة ، احتفظ بالإعدادات الافتراضية، بالإضافة إلى تحديد إضافة مخططات تفصيلية على المقالات الكاملة، ثم حدد العينة المراد تحريرها.
    3. افصل الكائنات الحية المؤثرة في كل مقالة قصيرة تنبثق عن طريق رسم خط بالماوس (اضغط على زر اللفة للرسم). بمجرد اكتمال الفصل في المقالة القصيرة ، انقر فوق الزر X في الزاوية العلوية اليمنى من النافذة ، واضغط على نعم لمعالجة النافذة التالية. اضغط على NO لإنهاء التغييرات وحفظها. في نهاية العملية ، ستظهر NORMAL END إذا كان كل شيء صحيحا.
    4. بعد الفصل ، أعد معالجة الصورة للحصول على بيانات الكائن المحدثة. انتقل إلى برنامج معالجة الصور ، وانقر فوق معالجة الصورة (المحولة) (العملية الأولى) ، وحدد معالجة الجسيمات مرة أخرى من الصور المعالجة في مجلدات العمل الفرعية. حدد العينة ، وفي نافذة معالجة الصورة الواحدة ، احتفظ بالإعدادات الافتراضية ، وحدد العمل مع قناع الفصل (CREATE-EDIT-INCLUDE) ، ثم انقر فوق موافق. في نهاية العملية ، ستظهر NORMAL END إذا كان كل شيء صحيحا.
    5. في نافذة التحكم في الفصل ، اضغط على موافق لحفظ الصورة مع الخطوط قبل المعالجة ؛ في حالة وجود صورة سابقة ، سيتم استبدالها.
    6. في نافذة قناع التحكم في الفصل ، إذا لزم الأمر، حدد تحرير لإضافة خطوط فصل إلى القناع باستخدام الماوس لفصل الكائنات الحية التي لم تظهر من قبل في خطوة الفصل باستخدام المقالات القصيرة. عند الانتهاء، قم بإنهاء العملية، وفي نافذة التحكم في قناع الفصل ، حدد نعم لقبول القناع. في نهاية العملية ، ستظهر NORMAL END إذا كان كل شيء صحيحا.
      ملاحظة: تستغرق إعادة معالجة عينة باستخدام قناع فصل وقتا طويلا (قد يستغرق ذلك أكثر من 1.5 ساعة لكل عينة). يفضل تخصيص الوقت المطلوب في الخطوة 1.2.5 لتجنب هذه الخطوة الإضافية.

2. التعرف التلقائي على الكائنات

ملاحظة: قم بإنشاء مجموعة تعلم للتنبؤ تلقائيا بهوية الكائنات المكتشفة ، وبالتالي فصل الكائنات الحية عن الحطام في العينة.

  1. إنشاء مجموعة التعلم
    1. انسخ الصور وملفات .pid المقترنة بالصور التي سيتم استخدامها لإنشاء فئات مجموعة التعليم من Zooscan_scan > _work إلى PID_process > Unsorted_vignettes_pid.
      ملاحظة: اختر مجموعة فرعية من العينات ذات التنوع التصنيفي العالي ومواقع أخذ العينات المختلفة و/أو مواسم أخذ العينات لضمان أقصى قدر من التمثيل للكائنات الحية في العينات.
    2. في مجلد مجموعة التعلم PID_process >، قم بإنشاء مجلد فرعي باسم مجموعة التعلم الجديدة (أي yyyymmdd_raw_LS)، وبداخله، قم بإنشاء المجلدات الفرعية التي تتوافق مع كل فئة من فئات مجموعة التعلم (أي اللافقاريات الكبيرة والحطام واللافقاريات الأخرى).
      ملاحظة: للحصول بكفاءة على هيكل حجم المجتمع لعينات اللافقاريات الكبيرة النهرية ، يوصى باستخدام مجموعة تعليمية تستند إلى ثلاث فئات فقط: اللافقاريات الكبيرة ، واللافقاريات الأخرى ، والحطام. تفصل مجموعة التعلم هذه بشكل أساسي المقالات القصيرة للأشياء المقابلة للكائنات الحية عن تلك المقابلة للحطام (مثل الألياف أو الجسيمات أو الطحالب الخيطية).
    3. انتقل إلى برنامج معالجة الصور (الوضع المتقدم فقط) واختر EXTRACT Vignettes ل PLANKTON IDENTIFIER (المقالات القصيرة غير المصنفة للتدريب). احتفظ بالخيارات الافتراضية وحدد المربع إضافة مخططات تفصيلية .
    4. انتقل إلى برنامج التعريف التلقائي ، وانقر فوق التعلم ، وحدد من PID_process > Learning_set المجلد الفرعي الذي تم إنشاؤه لمجموعة التعلم الجديدة (الخطوة 2.1.2) ، واضغط على موافق.
    5. في القسم الأيسر (إبهام غير مفروز) من النافذة المفتوحة ، حدد المجلد غير المصنف vignettes_pid. حدد المقالات القصيرة واسحبها بالماوس من الإبهام غير المصنف إلى مجلد الفئة المقابلة لها في القسم الأيمن ، الإبهام الذي تم فرزه ، لتصنيف كل كائن إلى فئات محددة. سيتم تمييز المقالات القصيرة المنقولة بعلامة X حمراء.
      ملاحظة: حدد الفئات يدويا عن طريق إنشاء مجلدات فرعية في مجلد الإبهام الذي تم فرزه أو قم بإنشائها بالنقر فوق رمز المجلدات في البرنامج. لا تحرك أكثر من 50 مقالة قصيرة في نفس الوقت.
    6. بمجرد اكتمال جميع الفئات بالكائنات المحددة (حوالي 300 كائن لكل فئة) ، انقر فوق إنشاء ملف تعليمي واحفظه بالاسم المطلوب.
      ملاحظة: سيتم حفظ مجموعة التعليم كملف .pid في مجلد مجموعة التعلم PID_process > الخاص بالمشروع. يوصى بإنشاء واختبار عدة مجموعات تعليمية بمستويات مختلفة من الفئات (من الأشكال الخشنة إلى الأشكال الدقيقة) وبتوازن مختلف لعدد الكائنات داخل كل فئة. ابدأ بمجموعة تعلم خشنة تحتوي على عدد قليل من الفئات و 50 عنصرا على الأقل لكل فئة ، ثم قم بزيادة عدد الكائنات في كل فئة و / أو قم بإنشاء مجموعات تعلم أدق. يجب أن تكون الفئة ممثلة لتباينها في مجموعة العينات.
  2. تقييم مجموعة التعلم
    ملاحظة: قم بإجراء التحقق المتقاطع مع ثنيتين وخمس تجارب باستخدام طريقة Random Forest مع برنامج التعرف التلقائي للحصول على مصفوفة ارتباك للتصنيف الناتج للكائنات.
    1. انتقل إلى برنامج التصنيف التلقائي وانقر على تحليل البيانات.
    2. في تحديد ملف التعلم، حدد ملف مجموعة التعليم الذي تم إنشاؤه من PID_process > مجموعة التعلم.
    3. في تحديد طريقة، اختر أسلوب الغابة العشوائية للتحقق التبادلي . في المتغيرات الأصلية، قم بإلغاء تحديد متغيرات الموضع (X وY وXM وYM وBX وBY والارتفاع). في المتغيرات المخصصة ، حدد ESD فقط.
      ملاحظة: تستخدم هذه الطريقة جزءا عشوائيا واحدا من مجموعة التعلم للتعرف على الجزء الآخر (ضعفان) ، ويتكرر ذلك خمس مرات للتأكد من أنه قوي إحصائيا.
    4. انقر فوق بدء التحليل ، واحفظ النتائج كما Analysis_name.txt في مجلد التنبؤ PID_process >. عند اكتمال التحليل بنجاح، قم بإنهاء تحليل البيانات.
    5. انتقل إلى مجلد PID_process > Prediction وانقر على ملف التحقق المتبادل. ستظهر نافذة مع مصفوفة الارتباك للتصنيف الحقيقي (الصفوف) مقابل التصنيف التلقائي (الأعمدة).
      ملاحظة: الاستدعاء هو النسبة المئوية للكائنات الحية التي تنتمي إلى مجموعة تم التعرف عليها تلقائيا بشكل جيد ، في حين أن 1-precision هي النسبة المئوية للكائنات الحية المصنفة بواسطة الخوارزمية كمجموعة لم يتم التعرف عليها (التلوث في مجموعة). يجب أن يكون الاستدعاء أعلى من 70٪ ، ويجب أن يكون التلوث (1-الدقة) أقل من 20٪.
    6. كرر الخطوات 2.1-2.5 إذا تم إنشاء عدة مجموعات تعليمية ويجب الحصول على استدعاء ودقة واحدة لكل مجموعة.
      ملاحظة: إذا تم إنشاء عدة مجموعات تعلم، فاختر المجموعة التي تتمتع بأكبر قدر من التذكر (التعرف الجيد) والدقة (التلوث المنخفض) للمجموعة ذات الاهتمام (أي اللافقاريات الكبيرة) لاختبار التنبؤ التلقائي لمجموعة من العينات في الخطوة التالية.
  3. التنبؤ بتحديد اللافقاريات الكبيرة
    ملاحظة: استخدم مجموعة التعلم المحددة للتنبؤ بهوية جميع الكائنات في مجموعة فرعية من العينات باستخدام برنامج التعرف التلقائي مع خوارزمية غابة عشوائية.
    1. انتقل إلى برنامج التعريف التلقائي وانقر على تحليل البيانات.
    2. في تحديد ملف التعلم، حدد ملف مجموعة التعليم من مجموعة التعلم PID_process > التي يجب استخدامها للتنبؤ.
    3. في تحديد نموذج (ملفات) ، حدد من مجلد PID_results العينات (ملفات PID) التي سيتم التنبؤ بها.
      ملاحظة: معالجة 20 ملف .pid كحد أقصى في نفس الوقت لتجنب الأخطاء المتعلقة بمشاكل الذاكرة. إذا تمت معالجة عدد كبير جدا من ملفات .pid في نفس الوقت ، فستظهر العملية نهاية صحيحة ولكن قد لا تتم معالجتها بشكل جيد ، وقد يحدث خطأ في الخطوات التالية عند المعالجة باستخدام برنامج معالجة الصور.
    4. في تحديد طريقة، اختر أسلوب الغابة العشوائية . ضع علامة على حفظ النتائج التفصيلية لكل عينة. في المتغيرات الأصلية، قم بإلغاء تحديد متغيرات الموضع (X وY وXM وYM وBX وBY والارتفاع). في المتغيرات المخصصة ، حدد ESD فقط.
    5. انقر فوق بدء التحليل ، واحفظ النتائج كما Analysis_name.txt في مجلد التنبؤ PID_process >.
  4. التحقق اليدوي
    ملاحظة: يقوم أحد الخبراء يدويا بالتحقق من صحة التنبؤ من الخطوة السابقة لإعادة تصنيف الكائنات المصنفة بشكل خاطئ إلى الفئة الصحيحة.
    1. انسخ ملفات Analysis_sample_dat1.txt المراد التحقق من صحتها من مجلد توقع PID_process > إلى مجلد PID_process > Pid_results.
    2. انتقل إلى برنامج معالجة الصور وحدد استخراج المقالات القصيرة في المجلدات وفقا للتنبؤ أو التحقق من الصحة. ثم حدد استخدام الملفات المتوقعة من المجلد "pid_results". احتفظ بالإعدادات الافتراضية واضغط على موافق.
    3. يقوم البرنامج بإنشاء مجلد يسمى sample_yyyymmdd_hhmm_to_validate مع الكائنات المتوقعة في مجلد المقالات القصيرة PID_process > التي تم فرزها.
    4. انتقل إلى مجلد PID_process > المقالات القصيرة التي تم فرزها، وانسخ المجلد sample_yyyymmdd_ hhmm_to_validate. استبدل اسم المجلد _to التحقق من صحته ب _validated.
    5. للتحقق يدويا من صحة التصنيف التلقائي ، افتح sample_yyyymmdd_ hhmm_validated المجلد ، وراجع جميع المقالات القصيرة من كل مجلد فرعي (فئة) لتحديد ما إذا كانت هناك كائنات مصنفة بشكل خاطئ. عندما يتم تصنيف كائن واحد بشكل خاطئ ، اسحب المقالة القصيرة باستخدام الماوس إلى المجلد الصحيح (الفئة).
    6. انتقل إلى برنامج معالجة الصور وحدد LOAD Identifications من المقالات القصيرة التي تم فرزها. احتفظ بالإعدادات الافتراضية وحدد yyyymmdd_hhmm_name_validated المراد معالجتها.
    7. انتقل إلى PID_process > Pid_results > Dat1_validated، حيث تم إنشاء ملف باسم Id_from_sorted_vignettes_yyyymmdd_hhmm.txt وملف .txt واحد لكل نموذج من العينات التي تم التحقق من صحتها (sample_tot_1_dat1.txt).
      ملاحظة: تحتوي هذه الملفات .txt على عمود جديد يعرض التنبؤ ، يسمى pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm ، والذي يحدد تصنيف الخبراء لكل كائن (أي التصنيف الذي تم التحقق من صحته). ويمكن إنشاء فئات جديدة (مثل فئات تصنيفية أدق) في هذه المرحلة، أثناء عملية التحقق. ومع ذلك ، احتفظ باسم الفئة الأصلية بالاسم الجديد (على سبيل المثال ، macroinvertebrate_chironomidae). وهذا يسمح بتتبع الفئة الأصلية عند حساب الاستدعاء والدقة وتجميع جميع اللافقاريات الكبيرة بسهولة لحساب معلمات بنية حجم المجتمع (أي طيف الحجم وتنوع الحجم). يوفر الملف النصي البيانات المرتبطة بكل كائن ، بما في ذلك المحاور الثانوية والرئيسية المستخدمة للحصول على الحجم الإهليلجي لكل كائن حي كمقياس لحجم الجسم الفردي. علاوة على ذلك ، يحتوي العمودين الأخيرين من الجدول على الفئات المتوقعة والتحقق من صحتها لكل كائن (صف) ، والتي تسمح بحساب ، حسب الفئة ، استدعاء ودقة مجموعة التعلم على مجموعة فرعية من العينات.Figure 1

الشكل 1: مخطط عمل يمثل القسم 1 والقسم 2 من البروتوكول. الأوقات توضيحية ويمكن أن تتغير اعتمادا على الكمبيوتر ، ووفرة المقالات القصيرة للمعالجة ، وعدد فئات مجموعة التعلم. تتوافق هذه الحالة مع التحقق من صحة مجموعة تعليمية من ثلاث فئات على مجموعة من 42 عينة فرعية (في المجموع ، 47473 مقالة قصيرة). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. حساب توزيع الحجم الفردي وأطياف الحجم ومقاييس الحجم

ملاحظة: تم إجراء الحسابات المذكورة في هذا القسم باستخدام Matlab (انظر البرنامج النصي كملف تكميلي 1).

  1. توزيع الحجم الفردي
    1. يحتوي العمود الأخير من ملف Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt على التصنيف الذي تم التحقق من صحته للكائنات. حدد فقط العناصر المصنفة على أنها لافقاريات كبيرة لتصوير توزيع حجمها الفردي في العينة.
      ملاحظة: حجم الجسم الفردي يتوافق مع الحجم الإهليلجي للكائنات اللافقارية الكبيرة. يوفر النظام القياسات بالبكسل.
    2. قم بربط المتجهات بقياسات الحجم من كلا المسحين ، لأن كل كسر له أس أخذ عينات فرعية مختلف. قبل التسلسل ، صحح التجزئة عن طريق تكرار متجهات الحجم عدة مرات كما تم تجزئة العينة الفرعية المقابلة.
      ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة إذا كان الفحص يتوافق مع جزء من العينة (أي خشن أو ناعم).
    3. احسب الحجم الإهليلجي من المحاور الرئيسية (M) والصغرى (M) للإهليلجية البرولات بنفس مناطق البكسل مثل الكائنات الحية. قبل حساب الحجم الإهليلجي ، قم بتحويل المحاور الرئيسية (M) والثانوية (m) من وحدات البكسل إلى المليمترات (mm) باستخدام عامل التحويل التالي (cf):
      1 بكسل = 2,400 نقطة لكل بوصة
      1 بوصة = 25.4 مم
      cf = 25.4/2400
      الحجم الإهليلجي (بيضاوي الشكل مع وحدات في مم3) يتوافق مع:
      Equation 1
    4. تصوير دالة كثافة الاحتمال لتوزيع الحجم الفردي على مقياس log2 .
  2. تنوع الحجم
    1. احسب تنوع الحجم (Sd) بعد Quintana et al. (2008) 8 ، كما في García-Comas et al. (2016) 35:
      Equation 2
      حيث p x (x) هي دالة كثافة الاحتمال للحجم x ، و x تمثل log2 (ellipVol). وبالتالي ، فإن هذا المقياس هو مؤشر شانون للتنوع الذي تم تكييفه مع مقياس مستمر ، مثل توزيع الحجم الفردي في المجتمع.
  3. طيف حجم الحجم الحيوي الطبيعي (NBSS)
    1. تحديد فئات الحجم في NBSS ، وتحديد الحد الأدنى من الطيف على أنه 0.01 كمي لتوزيع حجم اللافقاريات الكبيرة في العينات وإنشاء فئات الحجم بمقياس هندسي للقاعدة 2 حتى يتم تضمين أكبر كائن حي في العينات.
      ملاحظة: يزداد عرض فئة الحجم مع الحجم لحساب التباين الأكبر المرتبط بأحجام أكبر. كان لدى NBSS لمجتمعات اللافقاريات الكبيرة التي تم تحليلها هنا 14 فئة حجم (الجدول 1).
    2. احصل على الحجم الحيوي الطبيعي بقسمة الحجم الحيوي الكلي في كل فئة حجم على عرض فئة الحجم.
  4. حجم منحدر الطيف
    1. احسب المنحدر الخطي لل NBSS.
      ملاحظة: يتم حساب المنحدر (μ) بناء على العلاقة بين log 2 (نقطة منتصف فئة الحجم) و log2 (الكتلة الحيوية الطبيعية) في فئات الحجم الأكبر من الوضع ، مع تجاهل أي فئات فارغة (في هذه الدراسة ، فئات الحجم من 3 إلى 14).
حدود فئة الحجم (مم3) فئة الحجم نقطة المنتصف (مم3)
0,1236 0,1855
0,2473 0,3709
0,4946 0,7418
0,9891 1,4837
1,9783 1,4837
3,9560 5,9348
7,9131 11,8696
15,8261 23,7392
31,6522 47,4783
63,3044 94,9567
126,6089 189,9133
253,2178 379,8267
506,4300 7597,7000
1012,9000 15193,0000
2025,7000

الجدول 1: فئات الحجم من طيف حجم الكتلة الحيوية الطبيعية (NBSS). يوضح الجدول أيضا نهايات فئة الحجم ال 15 ونقاط منتصف فئة الحجم للكائنات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

اقتناء الصور الرقمية لعينات اللافقاريات الكبيرة
الفروق الدقيقة في المسح الضوئي: ترسيب الإيثانول في درج المسح الضوئي
أثناء اختبار النظام بحثا عن اللافقاريات الكبيرة ، كانت العديد من عمليات المسح ذات جودة رديئة. منعت منطقة مشبعة داكنة في الخلفية المعالجة الطبيعية للصورة وقياس الأحجام الفردية لللافقاريات الكبيرة (الشكل 2). تم تقديم عدة أسباب لظهور مناطق مشبعة في الخلفية أو صور عالية البكسل: (1) وجود عدد كبير جدا من الكائنات الحية على درج المسح ؛ (2) وجود قذارة في العينات ؛ (3) تأخير غير كاف بين معاينة العينة ومسحها ضوئيا ؛ أو (4) استخدام صورة خلفية ذات جودة رديئة في معالجة الصورة بسبب التكثيف أو الاتساخ أو سوء جودة المياه33. في عينات مجتمع اللافقاريات الكبيرة ، يؤدي استخدام الإيثانول بدلا من الماء إلى هطول الأمطار على الدرج ، مما يشكل ظلا داكنا إذا لم يتم شطفه بشكل صحيح بالماء بين عمليات المسح. يعد هذا أمرا حيويا للحصول على صور حادة وتقليل أي تآكل ذي صلة بزجاج صينية المسح.

الفروق الدقيقة في المسح: تركيز الحطام
من تحليل مجموعة فرعية من 47473 مقالة قصيرة ، تتوافق نسبة عالية (86.1٪) مع الحطام ، بما في ذلك المخلفات أو الألياف أو أجزاء الجسم (مثل الأرجل أو الخياشيم) ، أو مسح القطع الأثرية (الشكل 3A-E). تتوافق الكائنات اللافقارية مع 13.9٪ المتبقية من الأجسام المكتشفة (الشكل 3F-L). وهكذا ، على الرغم من الفصل الدقيق السابق للكائنات الحية عن المواد العضوية في المختبر ، لا يزال هناك الكثير من الحطام الصغير في القارورة.

الفروق الدقيقة في المسح الضوئي: لمس الأشياء
يعزز الوجود الكبير للحطام اللمس بين الكائنات الحية ، وبالتالي إنشاء المقالات القصيرة ذات الركام التي تشمل كائنات متعددة ملامسة وكائنات متصلة بجزيئات أو ألياف (الشكل 4A-C). هذه المقالات القصيرة هي مصدر التحيز في تحديد شكل هيكل الحجم الفردي. في مجموعة من خمس عينات (11 عينة فرعية) ، من بين جميع المقالات القصيرة مع أي لافقاريات كبيرة ، تتوافق 10٪ مع مجموعات مع لمس الكائنات الحية أو الكائنات الحية التي تلامس الجسيمات أو الألياف. تم تحرير هذه المقالات القصيرة باستخدام برنامج معالجة الصور من أجل فصل الكائنات الحية المؤثرة والكائنات الحية ذات الجسيمات المرفقة. تضمنت إعادة معالجة العينات باستخدام قناع الفصل إنشاء مقالات قصيرة جديدة مع الكائنات المنفصلة حديثا ، والتي تم التحقق من صحتها لضمان تصنيفها بشكل صحيح.

التعرف التلقائي على الكائنات
نتائج مجموعة التعلم
مجموعة التعلم هي مجموعة من المقالات القصيرة للكائنات المصنفة إلى فئات مختلفة من قبل خبير وتستخدم في نموذج تعليمي خاضع للإشراف ، ويمكن أن يسمى هذا أيضا مجموعة التدريب27. من الممكن العمل مع مجموعة تعليم موجودة، أو تحديث مجموعة التعلم الحالية بنقوش و/أو فئات جديدة، أو إنشاء مجموعة تعلم جديدة لمشروع معين.

لتحديد أفضل مجموعة تعلم للحصول بسرعة على بنية حجم اللافقاريات الكبيرة ، تم إنشاء العديد من مجموعات التعلم واختبارها من خلال التحقق المتقاطع باستخدام خوارزمية Random Forest. تظهر مصفوفة الارتباك الناتجة التصنيف الحقيقي (الصفوف) مقابل التصنيف التلقائي (الأعمدة). الاستدعاء هو النسبة المئوية للكائنات الحية التي تنتمي إلى فئة تم تصنيفها تلقائيا بشكل جيد ، في حين أن الدقة 1 هي النسبة المئوية للكائنات الحية التي أخطأت الخوارزمية في تصنيفها على أنها تنتمي إلى فئة (تلوث في فئة)33. كقاعدة عامة ، يجب أن يكون الاستدعاء أعلى من 70٪ ، ويجب أن يكون التلوث (دقة 1) أقل من 20٪ للحفاظ على فئة في مجموعة التعلم. ثم يتم التحقق من صحة مجموعة التعلم بأكبر قدر من التذكر والدقة لللافقاريات الكبيرة مع مجموعة فرعية من العينات لتحديد دقتها الحقيقية في تحديد اللافقاريات الكبيرة.

تم اختبار ثلاثة أنواع من مجموعات التعلم الرنح (الخام والمتوسط والجيد) مع فئات تستند إلى السمات المورفولوجية للكائنات. تضمنت مجموعة التعلم الخام ثلاث فئات: اللافقاريات الكبيرة ، واللافقاريات الأخرى (القشريات الدقيقة) ، والحطام (الألياف والجسيمات والتحف مثل بقع الزجاج). تضمنت مجموعة التعلم المتوسط 16 فئة: 5 لللافقاريات الكبيرة ، و 3 لللافقاريات الأخرى ، و 8 للحطام. تضمنت مجموعة التعلم الجيد 4 فئات أخرى من اللافقاريات الكبيرة ، بإجمالي 20 فئة (الجدول 2).

بالإضافة إلى تحديد الفئات ، تم أيضا اختبار تأثير عدد المقالات القصيرة لكل فئة. تم اختبار كل مجموعة تعلم بشكل منفصل باستخدام 50 مقالة قصيرة و 100 مقالة قصيرة و 300 مقالة قصيرة في كل فئة (و 500 مقالة قصيرة لمجموعة التعلم الأولية مع ثلاث فئات). كانت جميع الفئات متوازنة في العدد باستثناء "Ostracoda" و "اللافقاريات الكبيرة المستديرة" و "اللافقاريات الكبيرة ذات القشرة المستديرة" ، والتي تضمنت عددا أقل من الأفراد في 100 مجموعة تعلم من المقالة القصيرة و 300 مجموعة تعلم من المقالة القصيرة لأنه لم يتم اكتشاف عدد كاف من الكائنات الحية من هذه الفئات في الصور الممسوحة ضوئيا.

تم النظر في استدعاء ودقة اللافقاريات الكبيرة (جميع فئات macroinverebrate معا) والكائنات الحية (اللافقاريات الكبيرة وفئات اللافقاريات الأخرى معا) لاختيار أفضل مجموعة تعلم عن طريق التحقق المتبادل (انظر الجداول في الملف التكميلي 2). كانت أفضل مجموعة تعلم هي مجموعة التعلم الخام مع ثلاث فئات (اللافقاريات الكبيرة ، واللافقاريات الأخرى ، والحطام) ، مع 300 كائن في كل فئة (الجدول 2). تم استخدام مجموعة التعلم الأولية لاحقا للتحقق من صحة التصنيف التلقائي للكائنات في المجموعة الفرعية من العينات الممسوحة ضوئيا.

مجموعة التعلم عدد الفئات الصور لكل فئة استدعاء الكائنات الحية استدعاء اللافقاريات الكبيرة 1-الكائنات الدقيقة 1-اللافقاريات الكبيرة الدقيقة
نيء 3 50 0.97 0.84 0.12 0.24
100 0.96 0.87 0.06 0.17
300 0.95 0.91 0.09 0.15
500 0.93 0.88 0.13 0.2
متوسط 16 50 0.83 0.77 0.17 0.24
100 0.84 0.79 0.15 0.21
300 0.87 0.84 0.14 0.18
غرامة 20 50 0.89 0.86 0.14 0.18
100 0.9 0.87 0.11 0.14
300 0.9 0.86 0.13 0.14

الجدول 2: مجموعات التعلم التي تم إنشاؤها واختبارها (الخام والمتوسط والجيد) مع الفئات داخل كل واحدة وعدد الكائنات لكل فئة. استدعاء ودقة 1 لمجموعات التعلم التي تم إنشاؤها. فئات مجموعة التعلم الخام: اللافقاريات الكبيرة (1) ، اللافقاريات الأخرى (2) ، الحطام (3). فئات مجموعة التعلم المتوسطة: اللافقاريات الكبيرة الطويلة (1) ، اللافقاريات الكبيرة طويلة الملساء (2) ، اللافقاريات الكبيرة الشائكة الطويلة (3) ، اللافقاريات الكبيرة المستديرة (4) ، اللافقاريات الكبيرة ذات القشرة المستديرة (5) ، كلادوكيرا (6) ، مجدافيات الأرجل (7) ، أوستراكودا (8) ، الركام (9) ، الألياف (10) ، الرؤوس (11) ، الأرجل (12) ، البقع (13) ، البقع الداكنة (14) ، البقع الرمادية الفاتحة (15) ، البقع المستديرة (16). فئات مجموعة التعلم الرفيع: اللافقاريات الكبيرة الطويلة (1) ، اللافقاريات الكبيرة الطويلة الملساء (2) ، اللافقاريات الكبيرة الداكنة الطويلة الملساء (3) ، اللافقاريات الكبيرة الطويلة المستديرة (4) ، اللافقاريات الكبيرة الشائكة الطويلة (5) ، اللافقاريات الكبيرة المستديرة (6) ، اللافقاريات الكبيرة ذات القشرة المستديرة (7) ، اللافقاريات الداكنة المستديرة (8) ، اللافقاريات الكبيرة ذات القشرة المستديرة (9) ، كلادوكيرا (10) ، مجدافيات الأرجل (11) ، أوستراكودا (12) ، الركام (13) ، الألياف (14) ، الرؤوس (15) ، الأرجل (16) ، البقع (17) ، بقع داكنة (18) ، بقع رمادية فاتحة (19) ، بقع مستديرة (20).

التحقق من صحة التعرف التلقائي مع أفضل مجموعة تعليمية
تم تصنيف الكائنات الموجودة في مجموعة فرعية مكونة من 42 عينة فرعية دقيقة وخشنة تلقائيا بواسطة مجموعة التعلم المحددة باستخدام خوارزمية Random Forest. بعد التحقق اليدوي، كان الاستدعاء لجميع الفئات مرتفعا (في المتوسط، 0.94 لللافقاريات الكبيرة، و0.95 لللافقاريات الأخرى، و0.92 للحطام)، في حين كان التلوث (1-الدقة) منخفضا إلى حد ما، باستثناء اللافقاريات الأخرى (0.25 لللافقاريات الكبيرة، و0.84 لللافقاريات الكبيرة الأخرى، و0.01 للحطام) (الشكل 5 ). كانت اللافقاريات الأخرى (القشريات الدقيقة) نادرة في العينات (موجودة في 17 من أصل 42 عينة فرعية) ؛ وبالتالي ، لم تكن المقارنة قوية. علاوة على ذلك ، تأثرت هذه الفئة بشدة بالتلوث بسبب التشابه في الشكل والمستويات الرمادية مع الأشياء الأخرى.

أظهرت المقارنة بين وفرة اللافقاريات الكبيرة التلقائية مقابل اللافقاريات الكبيرة التي تم التحقق من صحتها أن هذه كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا (Pearson's r = 0.92 ، القيمة p < 0.0001 ، n = 24 للعينات الفرعية الخشنة. بيرسون r = 0.98 ، قيمة p < 0.0001 ، n = 18 للعينات الفرعية الدقيقة) ، مع مبالغة طفيفة في تقدير الأداء التلقائي بسبب التلوث من الحطام (المنحدرات < 1) (الشكل 6). فيما يتعلق بمقارنة متوسط الحجم الإهليلجي ، كان الارتباط مرتفعا أيضا (Pearson's r = 0.96 ، قيمة p < 0.0001 ، n = 24 للعينات الخشنة. بيرسون r = 0.99 ، قيمة p < 0.0001 ، n = 18 للعينات الدقيقة) ، وكان ميل طيف الحجم قريبا من -1 (الشكل 6). يعكس الاختلاف في المنحدرات بين الكسور الدقيقة والخشنة التأثير الأكبر للتصنيف الخاطئ في الكسور كبيرة الحجم ، والذي يرتبط بانخفاض عدد الكائنات الحية فيها.

تتفق دوال كثافة الاحتمال لتوزيعات الحجم الفردية للتنبؤ التلقائي بشدة مع التنبؤات التي تم التحقق من صحتها للعينات الفرعية الدقيقة ، وكذلك للعينات الفرعية الخشنة. ومع ذلك، كانت هناك بعض الاستثناءات للعينات الفرعية الخشنة المتعلقة بعدد الكائنات الحية، وبالتالي، كان هناك تأثير أكبر لسوء التصنيف في تلك الحالات، كما هو موضح من قبل (الشكل 7).

تأثير لمس الكائنات الحية على توزيعات الحجم الفردية وأطياف الحجم ومقاييس الحجم
تم إجراء مقارنة بين توزيعات الحجم التي تم الحصول عليها قبل وبعد فصل الكائنات الحية اللامسة وقبل التحقق من الصحة في مجموعة فرعية من خمس عينات مختارة لتقييم تأثير لمس الأشياء. لمقارنة توزيعات الحجم ، تم دمج العينات الفرعية الخشنة والناعمة ، وفقا لتجزئتها ، لإعادة بناء عينة تمثل مجتمع اللافقاريات الكبيرة. في ثلاث عينات، زادت الوفرة بعد التحقق (>500 فرد) (الشكل 8 أ). على الرغم من هذه الزيادة ، فإن متوسط الحجم الإهليلجي يتناسب بشكل وثيق مع الحجم المحسوب في العينات التي تم التحقق من صحتها (الشكل 8 ب).

اختلفت توزيعات حجم العينات المصححة (بعد فصل الكائنات الحية المؤثرة) قليلا عن العينات التي تم التحقق من صحتها. وبالتالي ، كان لوجود كائنات متعددة تأثير ضئيل على توزيعات الحجم في تلك العينات (الشكل 9A-E). وفقا لذلك ، فإن تنوع الحجم المحسوب بناء على العينات المصححة يرتبط ارتباطا وثيقا بتنوع حجم العينات التي تم التحقق من صحتها (بيرسون r = 0.94 ، قيمة p = 0.017 ، n = 5) (الشكل 9F).

من الناحية النظرية ، فإن طيف حجم الحجم الحيوي الطبيعي (NBSS) لمجتمع به عدة مستويات غذائية له ميل طيف حجم في مقياس log2 يقترب من -1 في ظروف الحالة المستقرة4. غالبا ما يكون لل NBSS في المجتمعات الطبيعية نتوء بدلا من توزيع خطي ، ويعزى ذلك في الغالب إلى تحيز أخذ العينات لأصغر فئات الحجم36. في الدراسة الحالية ، كانت فئة الحجم الثالث هي الأكثر شيوعا في NBSS.

كانت NBSSs متشابهة تماما بين خطوات البروتوكول (الشكل 10A-C) ، باستثناء فئات قليلة الحجم في بضعة أطياف (الشكل 10D-E). وفقا لذلك ، فإن حجم منحدر الطيف المحسوب بناء على العينات المصححة يرتبط ارتباطا وثيقا بالميل بناء على العينات التي تم التحقق من صحتها (بيرسون r = 0.99 ، قيمة p ≤ 0.0001 ، n = 5) (الشكل 10F).

Figure 2
الشكل 2: أمثلة على الصور الممسوحة ضوئيا ذات الصفات المختلفة قبل المعالجة وبعدها. (أ ، ب) صورة أولية (يسار) وصورة معالجة (يمين) لعينة فرعية دقيقة بجودة مسح جيدة ؛ (ج، د) صورة أولية (يسار) وصورة معالجة (يمين) لعينة فرعية دقيقة بجودة مسح ضوئي سيئة (خلفية داكنة وصورة مقطوعة على الحافة اليسرى) ؛ (E، F) صورة أولية (يسار) وصورة معالجة (يمين) لعينة فرعية دقيقة بجودة مسح ضوئي سيئة (خلفية داكنة منقطة جدا). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: المقالات القصيرة الكنتورية التي تمثل أشياء مختلفة موجودة في العينات. (أ-ه) الحطام (الألياف، والبقع المستديرة، وأرجل اللافقاريات الكبيرة، والبقع، والحطام العضوي)؛ (F-I) اللافقاريات الكبيرة (غمدية الأجنحة ، Diptera ، Plecoptera ، و Trichoptera) و (J-L) اللافقاريات الأخرى (Cladocera ، Copepoda ، و Ostracoda). تشير أشرطة المقياس إلى 1 مم gma = 1.1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: أمثلة على المقالات القصيرة التي تحتوي على عناصر متعددة. (أ) اللافقاريات الكبيرة (Hydracarina) المرتبطة بالألياف ؛ (ب) كائنات متعددة (Caenidae) مجمعة بواسطة ألياف ؛ و (ج) اثنين من اللافقاريات الكبيرة الملامسة (Chironomidae و Caenidae). تشير أشرطة المقياس إلى 1 مم gma = 1.1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: مخططات مربعة للاستدعاء والتلوث (1-الدقة). تم التحقق من صحة المخططات الصندوقية للفئات الثلاث من اللافقاريات الكبيرة واللافقاريات الأخرى والحطام (300 مقالة قصيرة لكل فئة) لمجموعة التعلم المختارة على مجموعة فرعية من العينات (ن = 42). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: مقارنة بين تقديرات الوفرة ومتوسط الحجم الإهليلجي في التصنيف التلقائي مقابل التصنيف الذي تم التحقق من صحته. (أ) تقديرات الوفرة في العينات الفرعية (ن = 42) و (ب) متوسط تقديرات الحجم الإهليلجي في العينات الفرعية (ن = 42). تتوافق النقاط الداكنة مع العينات الفرعية الخشنة (شبكة >0.5 سم) ؛ تتوافق النقاط الرمادية مع العينات الفرعية الدقيقة (شبكة >500 ميكرومتر). يمثل الخط المتقطع العلاقة 1: 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: دوال كثافة الاحتمال التي تمثل المساهمة النسبية (المحور ص) للحجم الفردي في المقياس اللوغاريتمي (المحور السيني) للمقارنة بين التقديرات التلقائية وبين التقديرات التي تم التحقق من صحتها. (أ ، ب) التقديرات التلقائية والمصادق عليها للعينات الفرعية الخشنة (ن = 18) ، (ج ، د) التقديرات التلقائية والمصادق عليها للعينات الفرعية الدقيقة (ن = 24). (أ، ج) مقارنة بين التقديرات التلقائية ومقارنة (B,D) بين التقديرات التي تم التحقق من صحتها. تمثل الألوان كل عينة فرعية للمساعدة في تمييز الأطياف. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: مقارنة بين تقديرات الوفرة ومتوسط الحجم الإهليلجي في العينات الفرعية التي تم التحقق من صحتها مقابل العينات الفرعية التي تم التحقق من صحتها بعد فصل الأجسام الملامسة عن العينات الطبيعية المختارة (العينات الفرعية الدقيقة والخشنة معا). (أ) تقديرات الوفرة حسب إطار أخذ العينات (ن = 5) و (ب) متوسط تقديرات الحجم الإهليلجي (ن = 5). يمثل الخط المتقطع العلاقة 1: 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 9
الشكل 9: دوال كثافة الاحتمال التي تمثل المساهمة النسبية (المحور ص) للحجم الفردي في مقياساللوغاريتم 2 (المحور السيني ) للتنبؤ التلقائي والتنبؤ الذي تم التحقق من صحته والتنبؤ الذي تم التحقق من صحته مع قيم تنوع الحجم الخاصة بكل منها (Sd). (A-E) دوال كثافة الاحتمال لعينات طبيعية مختارة (عينات فرعية دقيقة وخشنة معا) (ن = 5)؛ يتوافق الخط الأحمر مع التنبؤ التلقائي ، ويتوافق الخط الأزرق مع التنبؤ الذي تم التحقق من صحته ، ويتوافق الخط الأخضر مع العينات المصححة (تم التحقق من صحتها بعد فصل الأشياء التي تم لمسها). (و) مقارنة تقديرات تنوع الحجم المصادق عليها مقابل تقديرات تنوع الحجم المصحح عليها؛ يتوافق الخط المتقطع مع العلاقة 1: 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 10
الشكل 10: أطياف حجم الحجم الحيوي الطبيعي (NBSS) ومقارنة منحدرات NBSS (μ) بين العلاجات. (A-E) تمثل NBSS العلاقة بين قيمة نقطة المنتصف لكل فئة حجم في مقياس اللوغاريتم (المحور x) مقابل الحجم الحيوي الطبيعي لكل إطار مسح (المحور y) للعينات الخمس المختارة للتنبؤات التلقائية (الصلبان الحمراء) ، التي تم التحقق من صحتها (المثلثات الزرقاء) ، والمصححة (الدوائر الخضراء) مع طيف الحجم الخاص بها المنحدرات (μ) المحسوبة في فئات الحجم من فئة الحجم المشروط وإلى الأعلى (يشار إلى فئة الحجم الثالث بالخط المتقطع الرأسي). (و) مقارنة المنحدرات المحسوبة على العينات التي تم التحقق من صحتها مقابل العينات المصححة (بعد فصل الأشياء الملمسة). يتوافق الخط المتقطع مع العلاقة 1: 1 ، r2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: برنامج Matlab النصي لإجراء العمليات الحسابية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: التحقق من الصحة ، والاستدعاء ، ودقة 1 لمجموعات التعلم التي تم إنشاؤها. (أ) مجموعة التعلم الخام مع 3 فئات و 50 المقالة القصيرة لكل فئة ؛ (ب) مجموعة التعلم الخام مع 3 فئات و 100 المقالة القصيرة لكل فئة ؛ (ج) مجموعة التعلم الخام مع 3 فئات و 300 المقالة القصيرة لكل فئة ؛ (د) مجموعة التعلم الخام مع 3 فئات و 500 المقالة القصيرة لكل فئة ؛ (ه) مجموعة التعلم الخام مع 5 فئات و 50 المقالة القصيرة لكل فئة ؛ (و) مجموعة التعلم الخام مع 5 فئات و 100 المقالة القصيرة لكل فئة ؛ (ز) مجموعة تعلم أولية تضم 5 فئات و 300 مقالة قصيرة لكل فئة؛ (ح) مجموعة التعليم المتوسط التي تضم 16 فئة و 50 مقالة قصيرة لكل فئة؛ (ط) مجموعة التعلم المتوسط التي تضم 16 فئة و 100 مقالة قصيرة لكل فئة؛ (ي) مجموعة التعليم المتوسط التي تضم 16 فئة و 300 مقالة قصيرة لكل فئة؛ (ك) مجموعة تعليم جيد تضم 20 فئة و 50 مقالة قصيرة لكل فئة؛ (ل) مجموعة تعليم جيد تضم 20 فئة و 100 مقالة قصيرة لكل فئة؛ و (M) مجموعة التعلم الجيد مع 20 فئة و 300 المقالة القصيرة لكل فئة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح تكييف المنهجية التي وصفها Gorsky et al. 2010 لللافقاريات النهرية الكبيرة بدقة تصنيف عالية في تقدير هيكل حجم المجتمع في اللافقاريات الكبيرة للمياه العذبة. تشير النتائج إلى أن البروتوكول يمكن أن يقلل من الوقت اللازم لتقدير بنية الحجم الفردية في العينة إلى حوالي 1 ساعة. وهكذا، فإن البروتوكول المقترح يهدف إلى تعزيز الاستخدام الروتيني لأطياف حجم اللافقاريات الكبيرة كمؤشر بيولوجي سريع وتكاملي لتقييم أثر الاضطرابات في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة. تم بالفعل استخدام طيف حجم اللافقاريات الكبيرة كمؤشر ناجح لتقييم الحالة البيئية للبحيرات الساحلية22. ومع تطور البروتوكول، يمكن إجراء مسوحات مكثفة على اللافقاريات لتمكين حملات الرصد الميداني التي تغطي نطاقات مكانية وزمانية كبيرة.

نظرا لأن الهدف من هذا البروتوكول هو الحصول على توزيع الحجم الفردي لمجتمع العينة بطريقة سريعة ، بغض النظر عن التصنيف ، يوصى بإنشاء مجموعة تعلم بسيطة مثل تلك المقترحة هنا. تعطي اختبارات مجموعات التعلم الدقيقة ، مع عدد أكبر من الفئات ، استرجاع ودقة أقل لللافقاريات الكبيرة ككل (الجدول 2) ، وتستغرق خطوة التحقق وقتا أطول.

اتفق التنبؤ التلقائي بشدة مع التنبؤ الذي تم التحقق من صحته ل 42 عينة فرعية طبيعية من مواقع أخذ عينات مختلفة ، مما يشير إلى أن الطريقة في الوضع التلقائي مناسبة لحساب وقياس اللافقاريات الكبيرة في العينات الطبيعية (الشكل 6). علاوة على ذلك ، فإن التشابه في NBSSs بين التنبؤات التلقائية والمصادق عليها والملاءمة العالية للنموذج النظري الخطي يشير إلى أن الوضع التلقائي هو طريقة واعدة لمتابعة الدراسات البيئية النظرية (الشكل 10).

أثناء تكييف هذا البروتوكول ، تمت مواجهة العديد من المشكلات ، وتم حلها أو تقليلها بطرق مختلفة. هناك مشكلة يجب مراعاتها عند مسح عينات اللافقاريات الكبيرة وهي ظهور المناطق المشبعة الداكنة. وبالتالي ، من المهم التحقق من الصور المعالجة والممسوحة ضوئيا في أقرب وقت ممكن لاكتشاف هذه المشكلة وتكرار الفحص إذا لزم الأمر. تم العثور على هذه المشكلة أيضا عند مسح العوالق33 ، ولكن يتم زيادتها باستخدام الإيثانول بدلا من ماء الصنبور. لا ينصح باستخدام ماء الصنبور ، لأن الكائنات الحية المحفوظة في 70٪ من الإيثانول سوف تنجرف على السطح. على الرغم من أن الجهاز مصمم لمقاومة الإيثانول المخفف (5٪) ، يتم الاحتفاظ بعينات اللافقاريات بنسبة 70٪ من الإيثانول. لا ينصح أيضا بالعمل بتركيزات أقل من الإيثانول ، حيث يمكن أن تتلف الكائنات الحية من خلال عمليات الإماهة والجفاف37. الحل المقترح ، الذي يوصى به بشدة ، هو شطف صينية المسح بالماء العذب عدة مرات بعد كل فحص يتم إجراؤه باستخدام الإيثانول. هذا يتجنب تراكم الرواسب التي قد تغير خلفية الصورة ويحمي زجاج درج المسح من التآكل.

هناك مشكلة أخرى تم اكتشافها وهي وجود المقالات القصيرة مع كائنات متعددة ، والتي يمكن أن تغير طيف الحجم بسبب التقليل من تقدير الأفراد من أحجام معينة. عندما يكون عدد المقالات القصيرة ذات الكائنات المتعددة منخفضا (<10٪) ، كما في هذه الدراسة ، يكون لوجود كائنات متعددة تأثير صغير على توزيعات الحجم و NBSSs في تلك العينات (الشكل 9 والشكل 10). يشير هذا إلى أنه للحصول على بنية حجم تمثيلية لمجتمع اللافقاريات الكبيرة ، ليس من الضروري استثمار الوقت في الخطوة 1.5 من البروتوكول (فصل الكائنات الحية اللمسية) ، والتي تستغرق إعادة معالجة الصورة حوالي 1.5 ساعة. بدلا من ذلك ، يوصى بشدة بقضاء بعض الوقت في الخطوة 2.5 من البروتوكول (فصل الكائنات الحية أو الركام باستخدام إبرة خشبية) ، وهو أقل استهلاكا للوقت (بحد أقصى 30 دقيقة) ويضمن تقديرا مناسبا لتوزيعات الحجم في الوضع التلقائي30. يتمثل أحد خيارات تقليل عدد الكائنات الحية التي تلمس في العمل مع عدد أقل من الكائنات الحية لكل مسح ، ولكن يجب مراعاة الالتزام بالوقت المستثمر في مسح عينة واحدة في عدد كبير من الكسور وإمكانية تجميع الكائنات الحية. وثمة حل آخر يتمثل في الاحتفاظ فقط بعينة فرعية تسمح بحساب طيف الحجم التمثيلي عند فرز الكائنات الحية في المختبر بدلا من الحفاظ على جميع الكائنات الحية التي أخذت منها العينات، كما حدث في هذا العمل. إن تقليل عدد الكائنات الحية لكل عينة من شأنه أن يقلل من احتمال لمس الكائنات الحية. علاوة على ذلك ، عندما يتم تخزين عدد أقل من الأفراد ، تحتوي العينة على حطام أقل ، مما يسهل الفصل ، خاصة إذا كان من الممكن تجنب الألياف.

يرتبط الحد الملحوظ لطريقة التصنيف التلقائي بانخفاض وجود القشريات الدقيقة (الفئة: اللافقاريات الكبيرة) في العينات المستخدمة. يمكن أن يؤثر عدم تمثيل القشريات الدقيقة على تصنيفها الصحيح ويحد من دقة التنبؤ التلقائي لهذه الفئة. ومع ذلك ، فإن الفئات الأخرى ، الحطام واللافقاريات الكبيرة ، والتي هي الهدف الرئيسي لهذا العمل ، تقدم تذكرا ودقة عالية. تتمثل بدائل استخدام جهاز الماسح الضوئي هذا في تكييف ماسح ضوئي مشترك لحمل إطارات المياه ، وتعزيز الرموز مفتوحة المصدر لمعالجة العينات والتعلم الآلي مثل تلك المتوفرة هنا ، وكتابة رموز لقياس الكائنات الحية تحت المجهر بكاميرا أو من خلال التدفق باستخدام مجموعة من الكاميرات. تم ذلك في عدة مناسبات23،24،25،26،38،39،40 ، لكن الطريقة التي نقترحها تنظم معلمات المسح من أجل الحصول على تقديرات حجم قابلة للمقارنة ، والتي يصعب التحكم فيها مع الأنظمة الأخرى. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول وجهاز المسح المقترح جاهزان للاستخدام ، ومفتوحان المصدر ، وقد تم تأسيسهما بالفعل في مجتمع العوالق البحرية المتوسطة. وبشكل عام، يوضح تكييف هذا البروتوكول وسيلة واعدة لاستخدام طريقة التصوير الآلي هذه للحصول على بنية حجم اللافقاريات الكبيرة للمياه العذبة بكفاءة ولاختبار إمكانات مقاييس الحجم للتقييم الحيوي للمياه العذبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة محتملة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية (رقم المنحة RTI2018-095363-B-I00). نشكر أعضاء CERM-UVic-UCC إيليا بريتكسا ، وآنا كوستاروسا ، ولايا خيمينيز ، وماريا إيزابيل غونزاليس ، ومارتا جوتجلار ، وفرانسيسك لاخ ، ونوريا سيلاريس على عملهم في أخذ العينات الميدانية لللافقاريات الكبيرة والفرز المختبري وديفيد ألبيسا على التعاون في مسح العينات. وأخيرا نشكر جوزيب ماريا جيلي ومعهد علوم مار (ICM-CSIC) على استخدام مرافق المختبر وجهاز الماسح الضوئي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker Labbox Other containers could be used
Dionized water Icopresa  8420239600123 To dilute the ethanol
Funnel Vitlab 41094
Glass vials 8 ml Labbox SVSN-C10-195 1 vial/subsample
ImageJ Software  Free access Version 4.41o/ Image processing software
Large frame Hydroptic  Provided by ZooScan 24.5 cm x 15.8 cm
Monalcol 96 (Ethanol 96) Montplet 1050JE001
Plankton Identifier Software Free access Version 1.2.6/ Automatic identification software
Sieve Cisa 26852.2 Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm
Tweezers Bondline B5SA Stainless, anti-magnetic, anti-acid
VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software Hydroptic Version 9.0.51/ Sacn software
Wooden needle Any plastic or wood needle can be used
Zooprocess Software  Free access Version 7.14/Image processing software
ZooScan  Hydroptic 54 Version III/ Scanner

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe's surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
  2. Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
  3. Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
  4. Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
  5. Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
  6. Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
  7. White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
  8. Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography - Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
  9. Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
  10. Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
  11. Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
  12. Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
  13. Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l, Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
  14. Benejam, L. l, Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
  15. Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
  16. Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
  17. Townsend, C. R., Thompson, R. M. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  18. Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
  19. Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
  20. García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
  21. Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
  22. Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
  23. Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
  24. Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
  25. Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
  26. Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
  27. Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
  28. Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
  29. Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
  30. Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
  31. Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
  32. García-Comas, C., Picheral, E. Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting. , Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013).
  33. Picheral, E. ZooSCAN: Manual to scan and process samples. Quantitative Imaging Platform of Villefranche sur Mer (PlQv). , Available from: http://www.hydroptic.com/assets/uploads/files/documentations/ae4e0-zooscan_user_manual.pdf (2020).
  34. Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. , Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013).
  35. García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
  36. García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
  37. Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
  38. Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
  39. Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
  40. Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).

Tags

العلوم البيئية ، العدد 191 ،
المعالجة التلقائية للصور لتحديد هيكل حجم المجتمع لللافقاريات النهرية الكبيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gurí, R., Arranz, I., Ordeix,… More

Gurí, R., Arranz, I., Ordeix, M., García-Comas, C. Automatic Image Processing to Determine the Community Size Structure of Riverine Macroinvertebrates. J. Vis. Exp. (191), e64320, doi:10.3791/64320 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter