Summary
我々は、送信シグナル検出を備えた直立刺激ラマン散乱顕微鏡を用いた生細胞のタイムラプスイメージングのためのステージトップの柔軟な環境チャンバーについて報告する。脂肪滴は、オレイン酸で処理したSKOV3細胞で最大24時間、3分の時間間隔で画像化されました。
Abstract
誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です。SRSを用いた生細胞イメージングは、多くの生物学的および生物医学的用途で実証されています。しかし、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。SRS顕微鏡では、高解像度のイメージングを実現するために、高開口数(NA)水浸対物レンズと高NA油浸コンデンサーを使用することがよくあります。この場合、対物レンズとコンデンサーの間のギャップはわずか数ミリメートルです。したがって、ほとんどの市販のステージトップ環境チャンバーは、剛性のあるガラスカバーで厚さが大きいため、SRSイメージングには使用できません。この論文では、正立顕微鏡フレーム上で送信されたSRS信号検出を備えたタイムラプスライブセルイメージングに使用できる柔軟なチャンバーの設計と製造について説明します。チャンバーの柔軟性は、柔らかい素材(薄い天然ゴムフィルム)を使用することで実現されます。新しいエンクロージャとチャンバーの設計は、既存のSRSイメージングセットアップに簡単に追加できます。試験と予備的な結果は、フレキシブルチャンバーシステムにより、生細胞の安定した長期タイムラプスSRSイメージングを可能にし、将来のさまざまなバイオイメージングアプリケーションに使用できることを示しています。
Introduction
光学顕微鏡は、サンプルの微細構造を観察するために使用されます。光学イメージングは、他の技術よりも迅速で、侵襲性が低く、破壊的ではありません1。光学顕微鏡による生細胞イメージングは、培養生細胞の動態を長期間にわたって捉えるために開発されています2。異なるタイプの光学コントラストは、生物学的サンプルに関する異なる情報を提供します。例えば、光学位相顕微鏡は、試料3全体の屈折率の微妙な違いを示す。蛍光顕微鏡は、特定の生体分子や細胞小器官の画像化に広く使用されています。しかしながら、蛍光の広帯域励起スペクトルおよび発光スペクトルは、通常、多色イメージングが行われるときにスペクトルオーバーラップをもたらす4。蛍光分子は光に敏感であり、長期間の定期的な光曝露後に漂白することができます。さらに、蛍光標識は、細胞5における分子の生体分布を変化させ得る。SRS顕微鏡は、ラベルフリーの化学イメージング技術です6。SRSのコントラストは、特定の化学結合の振動遷移に依存しています。化学結合の振動周波数は狭いスペクトル帯域幅を示すことが多く、同じサンプル内の複数のラマンバンドを画像化することが可能になります7。SRS顕微鏡は、生細胞イメージングのためのユニークなツールであり、ラベルフリーの方法で複数の化学的コントラストを提供します8。
染色されていない細胞のSRSイメージングは多くの研究に使用されていますが、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングは広く採用されていません。その理由の1つは、市販のオープンチャンバーは厚さ9,10,11,12が大きいため、SRSイメージングに直接使用できないことです。ガラス蓋付きのこれらのチャンバーは、主に、後方検出スキームを備えた単一の高NA対物レンズを使用した明視野または蛍光イメージング用に設計されています。ただし、SRSイメージングでは、高NA対物レンズと高NAコンデンサーの両方を使用した透過検出が好まれるため、対物レンズとコンデンサーの間に非常に短いギャップ(通常は数ミリメートル)しか残されません。この問題を克服するために、我々は、正立顕微鏡フレームを使用して生細胞のタイムラプスSRSイメージングを可能にするために、柔らかい材料を使用して柔軟なチャンバーを設計しました。この設計では、水浸対物レンズはソフトチャンバーに封入されており、焦点合わせとイメージングの目的で3次元で自由に移動できます。
ほとんどの哺乳類細胞を培養するのに最適な温度は37°Cですが、室温は常にこれより10°C低くなっています。37°Cより高いまたは低い温度は、細胞増殖速度に劇的な影響を及ぼします13。そのため、生細胞イメージングシステムにおいては細胞培養環境の温度制御が求められている。温度の不安定性は、長期イメージング中に焦点ぼけの問題につながることが知られています14。37°Cの安定した環境を実現するため、顕微鏡下の断熱層を含む顕微鏡フレーム全体を覆う大型の筐体チャンバーを構築しました(図1)。大きな温度制御チャンバー内では、小さな柔軟なチャンバーは、5%CO2を補充した調整された空気の流れを介して生理学的湿度とpHを正確に維持するのに役立ちます(図2)。チャンバーの温度と湿度を測定し、ダブルチャンバー設計が長期の定期的なSRSイメージング下での細胞増殖に最適な細胞培養条件を提供することを確認しました(図3)。次に、SKOV3がん細胞のタイムラプスイメージングと脂肪滴(LD)の追跡へのシステムの応用を実証しました(図4、図5、および図6)。
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Protocol
1.顕微鏡環境エンクロージャを構築する
注:この大型顕微鏡環境エンクロージャは、顕微鏡本体の温度とイメージング環境を37°Cで安定させるために使用されます(図1A)。
- SRS顕微鏡フレームの足の位置と電動ステージの位置を、光学テーブルのマーカーペンでマークします。顕微鏡のガルバノスキャナーの前に2つのアイリスダイアフラムを取り付け、ポンプとストークスのレーザービームがアイリスダイアフラムの中心を通過するように調整します。
- 顕微鏡フレームとステージを光学テーブルから取り外します。
- シリコーンゴムシート(サイズ:31 x 29インチ、厚さ:1/8インチ)を光学テーブルに置きます(図1B)。
- ナイフを使用してマークに沿ってシリコーンゴムを切断し、小さなゴム片を取り除き、正方形のMICAセラミックシート(サイズ:6 x 6インチ、厚さ:1/4インチ)を同じ場所に配置します。
注:MICAセラミックは機械加工が容易な材料です15。アルミニウムと同じくらい硬いですが、優れた断熱材です。MICAセラミックシートを使用して、金属顕微鏡フレームとステージからステンレス鋼の光学テーブルへの熱伝達を停止しました。フレームとステージの脚を取り付けるために1 / 4-20ネジを使用できるように、MICAシートにいくつかの貫通穴を開ける必要があります。 - 顕微鏡フレームとステージを光学テーブルに戻し、マーカーラインに沿って脚をMICAセラミックシートに慎重に合わせます。1 / 4-20ネジを使用して、フレームとステージをテーブルに取り付けます。
- SRS 光路を再調整します。ミラー1とミラー2のミラーマウントを調整して、レーザービームが2つの事前に取り付けられたアイリスダイアフラムの中央を通過するようにします(図2)。
注:現在の生細胞イメージング作業に使用されているラボ製のSRS顕微鏡の技術的な詳細は、前述の16に記載されています。ポンプとストークスビームのパルス幅は、ガラスロッド分散で~3-4psです。システムは、ScanImage17 ソフトウェアを使用して制御されます。 - この断熱基礎の上に、5枚の大きなポリカーボネートシート(サイズ:31 x 29 x 28インチ、厚さ:0.25インチ)を使用して、顕微鏡フレーム全体を覆うように環境エンクロージャを組み立てます。
注意: エンクロージャボックスのサイズは、顕微鏡フレームとステージの寸法に基づいて決定されます。顕微鏡エンクロージャボックスのフロントパネルは、フレキシブルチャンバーを設置し、細胞培養皿をロードするために一時的に取り外す必要があります。- エンクロージャーを組み立てるには、ポリカーボネートシートの両端にねじ穴を開ける、穴あけ、タッピングなどの簡単な機械加工作業を実行します。エンクロージャーの右側と左側のシートに直径2.6インチの2つの大きな穴を開けて、それぞれ入口チューブと出口チューブに合います。背面シートに直径5 mmの小さな穴を開けて、レーザービームがエンクロージャーに入るようにします。
- アルミホイルテープを使用してボックスの端とインターフェースをシールします。
- フレキシブルダクトホースをエンクロージャボックスの入口ポートと出口ポートに接続して、ヒーターモジュールによってポンプで送られて制御される温風の流れを循環させます。ヒーターモジュールの熱センサーを、細胞を培養して画像化するフレキシブルチャンバーに配置します。目標温度を37°Cに設定します。
注意: ディフューザーを使用して、環境エンクロージャ内の気流分布をより均一にすることができます。
2.フレキシブルチャンバーを組み立てます
- 3本の止めネジを使用して、機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片1(材質:アルミニウム6061)を対物レンズのノーズピースに取り付けます(図2)。
- 機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片2を、4本の1 / 4-20ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます(図2)。
注:サンプルホルダーは、50 mmのカバーガラス底細胞培養皿を保持するように変更する必要があります。1-7 / 8インチのホールソーを使用して、サンプルホルダーの中央に貫通穴を開けます。50mmのホールソーを使用して穴をぐるぐりし、貫通穴の深さを~1mmに保ちます。 - アルミニウム片2を備えたサンプルホルダーを電動ステージに取り付け、ネジを使用して取り付けます。
- 天然ゴムフィルムスリーブ(厚さ:0.01インチ、シアノアクリレート接着剤で接着)を2つの機械加工されたアルミニウム片の間に置き、両端に輪ゴムを使用して取り付けます。
- 適切なチューブとコネクタを使用して、圧縮されたCO2シリンダーをガスミキサーモジュールに接続します。CO2入力圧力を20〜25psiに設定します。内蔵のCO 2センサーとコントローラーを使用して、エアミキサーモジュールが5%のCO2を調整して気流に混合できるようにします。インライン フィルタを使用して、エアフローをクリーンアップします。
- 適切なチューブとコネクタを使用して、混合空気(5%CO2を含む)をホットプレートに置かれた滅菌済みウォーターボトルに導き、加湿された空気をフレキシブルチャンバーに導きます。ホットプレートを37°Cに設定します。 温水で気流を泡立てて、気流の湿度を上げます。
3. タイムラプス生細胞SRSイメージング実験の準備
- ノーズピース、水浸対物レンズ、サンプルホルダーなど、フレキシブルチャンバーのすべての部分を70%エタノールで拭きます。
- エンクロージャー内に20〜30分間配置したUVランプを使用して、エンクロージャシステム全体を除染します。
注意: 安全のため、UV消毒プロセス中は実験室にとどまらないでください。 - SKOV3細胞を50mmガラス底シャーレに入れて、通常のインキュベーター内で通常の生理条件下で12時間培養します。
注:SKOV3細胞培養18 は、標準のバイオセーフティキャビネットで開始します。 - ネジを外して、機械加工されたアルミニウム片2をサンプルホルダーから外します。
注:これは、細胞培養皿をロードするために柔軟なチャンバーを開く方法です。 - 細胞培養皿をロードします。細胞培養皿を置く前に、コンデンサーの上部に浸漬油を追加することを忘れないでください。皿のカバーを取り外し、クランプを使用して皿を固定します。
注意: 汚染を避けるために、すべての操作は手袋で実行する必要があります。 - 対物レンズを細胞培養培地に下げて、粗い焦点を合わせます。アルミニウム片2を下げてフレキシブルチャンバーを囲み、ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます。
注意: 2 mmのシリコーンゴムクッションパッドがアルミニウム片2の底に取り付けられ、隙間をしっかりと密閉します。 - 通常の細胞培養用に5%CO2および19%O2の空気供給を200cc/minのエアフローレートで設定します。
注意: より低い空気流量を使用できます。それは、フレキシブルチャンバーがどれだけうまく密閉されているかによって異なります。
4. タイムラプス生細胞SRSイメージング実験の実施
- レーザー波長を805 nmに調整して、CH2化学結合の振動に起因する2854 cm-1ラマンシフトをターゲットにします。低レーザー出力を使用して、細胞への光損傷を減らします。このプロトコルに従うには、ポンプレーザーの平均出力~15 mWとストークスレーザーの~7.5 mW(1,045 nmに固定)を使用して、長期の生細胞イメージングを行います。
注意: レーザー出力が高いほど、SRSイメージング品質が向上します。ただし、レーザー出力が高すぎると、生細胞に光損傷が誘発されます。画質とフォトダメージの間にはトレードオフがあります。 - 対物レンズを調整して焦点を合わせ、ソフトウェアのメインコントロールパネルにあるFOCUSボタンを使用して、細胞の良好なSRSイメージングを実現します。高速フォーカスを実行するには、CONFIGURATIONパネルでピクセル数を512ピクセル×512ピクセルに設定し、ピクセル滞留時間を4.8μsに設定します。
- ロックイン・アンプの入力範囲(通常5mV)を最大信号電圧の2倍に設定します。ローパスフィルタをピクセル滞留時間(4.8μs)と同じに設定します。
注意: ラボで構築されたSRSシステムが異なれば、使用するデータ取得設定も異なる場合があります。 - 良好なピント合わせを実現した後、175μm2の視野に対して2,048×2,048ピクセルの画像解像度に設定して、高品質の画像を取得します。メインコントロールパネルのSAVE機能を確認し、チャンネルパネルのSRSチャンネルを確認します。 メインコントロールチャンネルで2つのフレーム間の間隔時間を180秒(3分)に設定します。取得番号を480に設定して、24時間以上のタイムラプスイメージングを行います。
注:実験の目的に基づいて、より低い画像解像度を使用できます。 - メインコントロールパネルのLOOP機能を使用して自動画像取得を開始します。
注意: イメージングの最初の1時間に温度の不安定性による焦点ドリフトがあるかどうかを確認してください。最初の1時間のイメージングは安定していない可能性があります。タイムラプスイメージングセッション中は、2〜3時間ごとにフォーカスを確認してください。 - 収集した画像をImageJ19で処理します。LDの定量化には、(i)LD /細胞体面積比、および(ii)総LDの平均SRS強度の2つの方法を使用します。 SRS画像の非細胞ピクセルを2,854 cm-1で閾値化およびゼロにすることにより、細胞本体面積を測定します。SRS画像の非LDピクセルをしきい値化およびゼロにして、LD面積と強度を測定します。
注:SRS画像処理の詳細については、以前に報告されています16。
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Representative Results
タイムラプスSRSイメージング用のフレキシブルチャンバーシステムを作製して組み立て(図1 、 図2)、システムの性能を評価しました。顕微鏡環境エンクロージャ内の温度は1時間以内に予想される37°Cに達し、室温に大きな影響を与えませんでした(図3A)。フレキシブルチャンバー内の温度は1.5時間で37°Cに達し、少なくとも24時間37°Cで安定に維持されました(図3B)。フレキシブルチャンバー内の相対湿度は、1時間で85%に達し、その後少なくとも24時間維持される可能性があります(図3C)。測定された温度と湿度のデータは、このシステムが長期的な細胞増殖に最適な環境を提供できることを裏付けています。
SRSを用いた生細胞イメージングは、多くの生物学的および生物医学的研究に適用されている20,21,22,23,24。特に、がんにおける脂質代謝を理解するための生細胞におけるラベルフリーLDのSRSイメージングは、多くの注目を集めています16,25,26。設計されたフレキシブルチャンバーシステムを使用して、まず、生きたSKOV3細胞のタイムラプスSRSイメージングを3分の時間間隔で24時間実行しました(図4)。ビデオデータは、細胞内LDの急速かつ活発な動きを3分の時間分解能で示しました。24時間のイメージングセッションの終わりまでに、細胞はまだ正常な形態と密度を示し、細胞が健康であることを示しています。次に、オレイン酸(OA)で処理したSKOV3細胞を画像化し、10時間以内のLD蓄積の動的プロセスを追跡しました(図5A)。
OA処理SKOV3細胞におけるLD量を、ImageJ19を用いて2つの方法(LD対細胞体面積比およびLDの総SRS強度)で定量した。結果は、LDの量(サイズと数)が10時間にわたって増加し続けたことを示しています(図5B)。また、蛍光色素DND-189で標識したLD(擬似色緑)の順方向SRSイメージングと、ライソソーム(擬似色赤色)の逆方2光子蛍光(TPF)イメージングを同時に実証しました(図6)。SRS/TPFデュアルモダリティイメージングは、2つの細胞コンパートメントの共局在を解析するために使用することができることに留意されたい。この実験では、LDとリソソームの非常に低い程度の共局在が観察され、これは小さな黄色の領域によって示されました。これらの結果は、フレキシブルチャンバーシステムにより、生細胞の安定した長期タイムラプスSRSイメージングを可能にし、将来的にさまざまなイメージングアプリケーションに使用できることを示しています。
図1:生細胞のタイムラプスSRSイメージングのためのフレキシブルチャンバーシステム 。 (A)生細胞のタイムラプスSRSイメージングのためのフレキシブルチャンバーシステムの概略図。(B)左の画像は、顕微鏡フレームとステージの下にシリコーンゴムシートとMICAセラミックパッドを使用した断熱層を示しています。右の画像は、環境顕微鏡の筐体とフレキシブルチャンバーを示しています。略語:SRS =誘導ラマン散乱;CCM = 立方センチメートル/分。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SRS光路を備えたフレキシブルチャンバーの概略図と画像で、焦点を合わせ、イメージングのための水浸漬対物レンズの3次元自由移動を可能にします。 左の画像は、市販の対物レンズノーズピースと改造されたサンプルホルダーに接続された2つの機械加工アルミニウムモジュールを示しています。下の画像は、アセンブリフレキシブルチャンバーシステムを示しています。略称:SRS =誘導ラマン散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:顕微鏡筐体とフレキシブルチャンバーの温度と湿度のデータ。 (A)顕微鏡筐体と実験室の室温の測定温度データ、最大12時間。 (B)フレキシブルチャンバー内の測定温度データ(37°Cでの平均)、最大24時間。 (C)フレキシブルチャンバー内の測定された相対湿度データ(平均85%)、 最大24時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代表的な24フレームのタイムラプスSRSイメージング。 フレキシブルチャンバーを使用した生SKOV3細胞のタイムラプスSRSイメージング(2,854 cm-1)、最大24時間。この実験では、3分の固定時間間隔で480フレームが記録されました。細胞は通常の条件下で培養した。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:タイムラプスSRSイメージングと脂肪滴定量。 (A)フレキシブルチャンバーを使用して、500 μM OAで処理した生SKOV3細胞の代表的な10フレームのタイムラプスSRSイメージング(2,854 cm-1)を最大10時間。この実験では、3分の固定時間間隔で200フレームが記録されました。スケールバー= 50μm。 (B)時間(0〜10時間)に対するLDの量は、ImageJの閾値化機能と粒子分析機能を使用して、2つの方法(LD /細胞体面積比とLDの総SRS強度)で定量化されました。略語:SRS =誘導ラマン分光法;OA=オレイン酸;LD =脂肪滴。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:LDとリソソームのタイムラプス、SRSと2光子の同時蛍光イメージング。 LD(擬似カラー緑)およびリソソーム(赤色)のタイムラプス、同時SRS(2,854 cm-1)、および2光子蛍光イメージング、最大2時間。細胞をイメージング前に蛍光色素(LysoSensor DND-189、1 μM)で1時間処理しました。画像は3分ごとに撮影されました。スケールバー= 50μm。LDとリソソームの共局在度は低く、黄色で示されました。略語:SRS =誘導ラマン分光法;LD =脂肪滴。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
タイムラプス生細胞SRS顕微鏡は、ラベルフリーの方法で分子追跡を行うための代替イメージング技術です。蛍光標識と比較して、SRSイメージングは光退色がなく、分子の長期モニタリングが可能です。しかしながら、今日まで、正立SRS顕微鏡上の生細胞イメージングシステムは市販されていない。本研究では、安定した断熱顕微鏡エンクロージャボックスと柔軟な内部ソフトチャンバーを備えたライブセルイメージングシステムを開発し、透過SRSタイムラプスイメージングを可能にしました。このセットアップでは、大型のエンクロージャボックスが37°Cで温度安定性を維持し、内部のソフトチャンバーが加湿空気を供給して最適な細胞培養環境を確立します。この研究で実証された柔軟なオープンチャンバーは、生細胞の長期SRSイメージングのためのシンプルなワークフローを可能にします。ガラス底皿に播種された細胞は、まず通常のインキュベーターで調製および培養してから、イメージングのために柔軟なステージ上のチャンバーに移すことができます。生細胞SRSイメージングを実行するための代替ソリューションは、マイクロ流体およびフローサイトメトリープラットフォームを含むクローズドフローセルを使用することである27、28、29、30。より低い厚さのフローセルを設計することは可能です。しかしながら、灌流チャンバー内で細胞を培養することは技術的に困難な場合があります31。
焦点ドリフトは、生細胞イメージングにおける一般的な問題である32。多光子プロセスとして、SRS信号生成はレーザービームの緊密な集束を必要とするため、SRS顕微鏡は焦点ドリフトに非常に敏感です。温度不安定性は、焦点ドリフトを誘発する上で不可欠な要因です。熱安定性を向上させるために、顕微鏡全体を断熱材で囲みました。ただし、一部のイメージングセッションでは、イメージングの2〜3時間後に焦点ドリフトが発生しました。SRS顕微鏡イメージングは振動にも敏感であり、フォーカシングを破壊する可能性があります。防振光学テーブルは、振動を低減して安定したイメージングを実現します。焦点ドリフト問題を解決するために、将来の実験において、オートフォーカス技術が採用される可能性がある33。
イメージングシステムの消毒手順は、特に細胞培養培地に直接接触する水浸対物レンズにとって、細胞の汚染を避けるために重要です。レンズトップのクリーニングには70%エタノールを使用しても安全です。UV光は物体の表面を効果的に消毒することしかできないため、これらの実験では消毒を行うために、エンクロージャボックスの異なる場所に4つのUVランプを取り付けました。しかしながら、UV光は、イメージングシステム内のプラスチック部品を劣化させる可能性がある。この場合、アルミホイルを使用してプラスチック部品を包み、覆うことができます。生細胞イメージングには、抗生物質(通常、培地中のペニシリン100単位/mLおよびストレプトマイシン100μg/mL)を強くお勧めします。
これらの実験では、生きたがん細胞のLDを画像化し、定量しました。これらの実験では、3分の時間間隔が妥当でした。イメージングの時間間隔は、研究プロジェクトのニーズに応じて変更できることに注意してください。たとえば、生細胞内の単一のLDを追跡するには、1分未満の時間間隔が必要になる場合があります。対照的に、数分のより長い時間間隔は、遅い生物学的プロセス34を追跡するのに十分である。
SRSイメージングは、他の多くの光学イメージング技術よりも高いレーザー出力を励起に使用するため、生細胞の長期タイムラプスSRSイメージングでは困難な場合があります。天然生体分子のSRSイメージングは、化学結合のラマン断面積が小さいため、さらに困難です35。これらの実験では、805nmの15mWのポンプレーザーと1,045nmの7.5mWのストークスレーザーを使用し、3分の時間間隔で24時間で大きな光損傷は観察されませんでした。敏感なラマンタグの使用は、レーザー出力をさらに低下させ得る36。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
ビンガムトン大学の2019年学部シニアデザインチーム(Suk Chul Yuon、Ian Foxton、Louis Mazza、James Walsh)に、顕微鏡エンクロージャーボックスの設計、製造、テストを行ったことに感謝します。有益な議論をしてくれたビンガムトン大学のスコット・ハンコック、オルガ・ペトロワ、ファビオラ・モレノ・オリバスに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の支援を受けて、受賞番号R15GM140444で行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
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