Summary
نبلغ عن غرفة بيئية مرنة على قمة المسرح لتصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية باستخدام مجهر تشتت رامان المحفز المستقيم مع اكتشاف الإشارات المرسلة. تم تصوير قطرات الدهون في خلايا SKOV3 المعالجة بحمض الأوليك لمدة تصل إلى 24 ساعة مع فاصل زمني مدته 3 دقائق.
Abstract
الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات. تم عرض تصوير الخلايا الحية باستخدام SRS للعديد من التطبيقات البيولوجية والطبية الحيوية. ومع ذلك ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. غالبا ما يستخدم الفحص المجهري SRS هدف الغمر في الماء بفتحة عددية عالية (NA) ومكثف غمر زيت NA عالي لتحقيق تصوير عالي الدقة. في هذه الحالة ، تكون الفجوة بين الهدف والمكثف بضعة ملليمترات فقط. لذلك ، لا يمكن استخدام معظم الغرف البيئية التجارية على سطح المسرح لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير مع غطاء زجاجي صلب. تصف هذه الورقة تصميم وتصنيع غرفة مرنة يمكن استخدامها لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع اكتشاف إشارة SRS المرسلة على إطار مجهر مستقيم. يتم تحقيق مرونة الغرفة باستخدام مادة ناعمة - فيلم مطاطي طبيعي رقيق. يمكن إضافة العلبة الجديدة وتصميم الغرفة بسهولة إلى إعداد تصوير SRS الحالي. تظهر الاختبارات والنتائج الأولية أن نظام الغرفة المرنة يتيح تصوير SRS مستقرا وطويل الأجل بفاصل زمني للخلايا الحية ، والذي يمكن استخدامه في تطبيقات التصوير الحيوي المختلفة في المستقبل.
Introduction
يستخدم الفحص المجهري الضوئي لمراقبة الهياكل المجهرية للعينات. التصوير البصري سريع وأقل توغلا وأقل تدميرا من التقنيات الأخرى1. تم تطوير تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الضوئي لالتقاط ديناميكيات الخلايا الحية المستزرعة على مدى فترةطويلة 2. توفر الأنواع المختلفة من التباينات الضوئية معلومات مميزة عن العينات البيولوجية. على سبيل المثال ، يظهر الفحص المجهري للطور البصري الاختلاف الدقيق في مؤشرات الانكسار عبر العينة3. يستخدم الفحص المجهري الفلوري على نطاق واسع لتصوير جزيئات حيوية أو عضيات خلوية محددة. ومع ذلك ، فإن أطياف الإثارة والانبعاث ذات النطاق العريض للتألق عادة ما تؤدي إلى تداخل طيفي عند إجراء تصوير متعدد الألوان4. جزيئات الفلورسنت حساسة للضوء ويمكن تبييضها بعد التعرض للضوء الدوري طويل الأمد. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي وضع العلامات الفلورية إلى تغيير التوزيع الحيوي للجزيئات في الخلايا5. الفحص المجهري SRS هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات6. يعتمد تباين SRS على الانتقال الاهتزازي لروابط كيميائية محددة. غالبا ما يظهر التردد الاهتزازي لرابطة كيميائية عرض نطاق طيفي ضيق ، مما يجعل من الممكن تصوير نطاقات رامان متعددة في نفس العينات7. يعد الفحص المجهري SRS أداة فريدة لتصوير الخلايا الحية ، حيث يوفر تباينات كيميائية متعددة بطريقة خالية من الملصقات8.
بينما تم استخدام تصوير SRS للخلايا غير الملوثة في العديد من الدراسات ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. أحد الأسباب هو أنه لا يمكن استخدام الغرف التجارية المفتوحة مباشرة لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير9،10،11،12. تم تصميم هذه الغرف ذات الغطاء الزجاجي في الغالب للتصوير الساطع أو التصوير الفلوري باستخدام هدف NA مرتفع واحد مع مخطط الكشف الخلفي. ومع ذلك ، يفضل تصوير SRS الكشف المرسل باستخدام كل من هدف NA العالي ومكثف NA العالي ، والذي يترك فجوة قصيرة جدا (عادة بضعة ملليمترات) بين الهدف والمكثف. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتصميم غرفة مرنة باستخدام مادة ناعمة لتمكين تصوير SRS بفاصل زمني للخلايا الحية باستخدام إطار مجهر مستقيم. في هذا التصميم ، تم وضع هدف غمس الماء في الغرفة الناعمة ويمكن أن يتحرك بحرية في ثلاثة أبعاد لأغراض التركيز والتصوير.
درجة الحرارة المثلى لزراعة معظم خلايا الثدييات هي 37 درجة مئوية ، في حين أن درجة حرارة الغرفة دائما أقل بمقدار 10 درجات من ذلك. درجة الحرارة أعلى أو أقل من 37 درجة مئوية لها تأثير كبير على معدل نمو الخلايا13. لذلك ، يلزم التحكم في درجة حرارة بيئة زراعة الخلايا في نظام تصوير الخلايا الحية. من المعروف أن عدم استقرار درجة الحرارة سيؤدي إلى مشاكل في إلغاء التركيز أثناء التصوير طويل المدى14. لتحقيق بيئة مستقرة تبلغ 37 درجة مئوية ، قمنا ببناء غرفة حاوية كبيرة لتغطية إطار المجهر بالكامل ، بما في ذلك طبقة عازلة للحرارة أسفل المجهر (الشكل 1). داخل غرفة التحكم في درجة الحرارة الكبيرة ، تساعد الغرفة المرنة الصغيرة في الحفاظ بدقة على الرطوبة الفسيولوجية ودرجة الحموضة عبر تدفق الهواء المنظم المكمل ب 5٪ CO 2 (الشكل 2). تم قياس درجة حرارة ورطوبة الغرف للتأكد من أن تصميم الغرفة المزدوجة يوفر حالة زراعة الخلايا المثلى لنمو الخلايا تحت تصوير SRS الدوري طويل المدى (الشكل 3). ثم أظهرنا تطبيق النظام لتصوير الفاصل الزمني وتتبع قطرات الدهون (LDs) في الخلايا السرطانية SKOV3 (الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء العلبة البيئية المجهر
ملاحظة: يتم استخدام هذه العلبة البيئية للمجهر الكبير للتحكم في درجة حرارة جسم المجهر وبيئة التصوير المراد تثبيتها عند 37 درجة مئوية (الشكل 1 أ).
- حدد مواقع أقدام إطار مجهر SRS والمرحلة الآلية باستخدام قلم تحديد على الطاولة البصرية. قم بتركيب أغشيتين من قزحية العين أمام ماسح الجلفانومتر للمجهر واضبطها لجعل المضخة وأشعة الليزر ستوكس تمر عبر مركز أغشية القزحية.
- قم بإزالة إطار المجهر والمرحلة من الجدول البصري.
- ضع لوح مطاط السيليكون (الحجم: 31 × 29 بوصة ، السماكة: 1/8 بوصة) على الطاولة البصرية (الشكل 1 ب).
- قطع مطاط السيليكون على طول العلامات باستخدام سكين ، وإزالة القطع المطاطية الصغيرة ، ووضع صفائح السيراميك MICA المربعة (الحجم: 6 × 6 بوصات ، السماكة: 1/4 بوصة) في نفس الأماكن.
ملاحظة: سيراميك ميكا مادة سهلة الآلة15. إنه صلب مثل الألومنيوم ولكنه عازل حراري ممتاز. تم استخدام صفائح سيراميك ميكا لوقف انتقال الحرارة من إطار المجهر المعدني والمرحلة إلى الطاولة البصرية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ. يجب حفر عدد قليل من الثقوب على صفائح MICA للسماح باستخدام 1/4-20 براغي لتركيب أقدام الإطار والمرحلة. - حرك إطار المجهر والمسرح مرة أخرى إلى الطاولة البصرية وقم بمحاذاة القدمين بعناية على صفائح سيراميك ميكا على طول خطوط العلامة. استخدم 1 / 4-20 مسامير لتركيب الإطار والمسرح على الطاولة.
- إعادة محاذاة المسار البصري SRS. اضبط حوامل المرآة للمرآة 1 والمرآة 2 لجعل شعاع الليزر يمر عبر مركز الحجاب الحاجز القزحي المثبت مسبقا (الشكل 2).
ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية لمجهر SRS المصنوع في المختبر المستخدم في أعمال تصوير الخلايا الحية الحالية سابقا16. عرض نبضة المضخة وعوارض ستوكس ~ 3-4 حصان مع تشتت قضيب زجاجي. يتم التحكم في النظام باستخدام برنامج ScanImage17 . - علاوة على أساس العزل الحراري هذا ، قم بتجميع العلبة البيئية لتغطية إطار المجهر بالكامل باستخدام خمس قطع من ألواح البولي كربونات الكبيرة (الحجم: 31 × 29 × 28 بوصة ، السماكة: 0.25 بوصة).
ملاحظة: يتم تحديد حجم صندوق العلبة بناء على أبعاد إطار المجهر والمرحلة. يجب إزالة اللوحة الأمامية لصندوق حاوية المجهر مؤقتا لتثبيت الغرفة المرنة وتحميل طبق زراعة الخلية.- لتجميع العلبة ، قم بتنفيذ أعمال تصنيع بسيطة ، بما في ذلك القطع والحفر والتنصت على ثقوب البراغي على كل حافة من ألواح البولي كربونات. قم بقطع فتحتين كبيرتين بقطر 2.6 بوصة على اليمين والأوراق اليسرى من العلبة لتناسب أنبوب المدخل والمخرج ، على التوالي. اقطع ثقبا صغيرا بقطر 5 مم على الورقة الخلفية للسماح لأشعة الليزر بدخول العلبة.
- أغلق حواف وواجهات الصندوق باستخدام شريط رقائق الألومنيوم.
- قم بتوصيل خرطوم مجرى الهواء المرن بمنافذ المدخل والمخرج لصندوق العلبة للسماح بتدفق الهواء الدافئ المتداول الذي يتم ضخه والتحكم فيه بواسطة وحدة السخان. ضع المستشعر الحراري لوحدة السخان في الغرفة المرنة حيث يتم زراعة الخلايا وتصويرها. اضبط درجة الحرارة المستهدفة على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن استخدام الناشر للحصول على توزيع أكثر اتساقا لتدفق الهواء في العلبة البيئية.
2. تجميع الغرفة المرنة
- قم بتركيب قطعة الألمنيوم الأسطوانية المجوفة المشكلة 1 (المادة: الألومنيوم 6061) على قطعة الأنف للهدف باستخدام ثلاثة براغي مجموعة (الشكل 2).
- قم بتركيب قطعة الألمنيوم الأسطوانية المجوفة المشكلة 2 على حامل العينة باستخدام أربعة براغي 1 / 4-20 (الشكل 2).
ملاحظة: يجب تعديل حامل العينة لحمل طبق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي بغطاء 50 مم. احفر ثقبا في وسط حامل العينة باستخدام منشار ثقب 1-7 / 8 بوصة. قم بموازنة الفتحة باستخدام منشار ثقب 50 مم وحافظ على عمق الفتحة ~ 1 مم. - قم بتركيب حامل العينة بقطعة الألومنيوم 2 على المسرح الميكانيكي وقم بتركيبه باستخدام البراغي.
- ضع غلاف الفيلم المطاطي الطبيعي (السماكة: 0.01 بوصة ؛ لصقها بلاصق cyanoacrylate) بين قطعتي الألمنيوم المشكل آليا وقم بتركيبه باستخدام الأربطة المطاطية في كل طرف.
- قم بتوصيل أسطوانة CO2 المضغوطة بوحدة خلاط الغاز باستخدام الأنابيب والموصلات المناسبة. اضبط ضغط إدخال CO2 على 20-25 رطل / بوصة مربعة. استخدم مستشعر CO2 مدمج ووحدة تحكم لضمان قدرة وحدة خلاط الهواء على تنظيم وخلط 5٪ CO2 في تدفق الهواء. استخدم المرشحات المضمنة لتنظيف تدفق الهواء.
- باستخدام الأنابيب والموصلات المناسبة ، قم بتوجيه الهواء المختلط (مع 5٪ CO2) إلى زجاجة الماء المعقمة الموضوعة على لوح التسخين ، ثم قم بتوجيه الهواء المرطب إلى الغرفة المرنة. اضبط لوح التسخين على 37 درجة مئوية. قم بفقاعة تدفق الهواء في الماء الدافئ لزيادة رطوبة تدفق الهواء.
3. التحضير لتجارب تصوير SRS للخلايا الحية ذات الفاصل الزمني
- امسح جميع أجزاء الحجرة المرنة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، بما في ذلك قطعة الأنف وهدف غمس الماء وحامل العينة.
- قم بإزالة التلوث من نظام العلبة بالكامل باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية الموضوع في العلبة لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
ملاحظة: لا تبقى في غرفة المختبر أثناء عملية التطهير بالأشعة فوق البنفسجية من أجل السلامة. - ثقافة خلايا SKOV3 في طبق بتري ذو قاع زجاجي 50 مم لمدة 12 ساعة في ظل الظروف الفسيولوجية العادية في حاضنة منتظمة.
ملاحظة: ابدأ زراعة الخلايا SKOV318 في خزانة قياسية للسلامة البيولوجية. - افصل قطعة الألومنيوم المشكلة 2 عن حامل العينة عن طريق إزالة البراغي.
ملاحظة: هذه هي الطريقة لفتح الحجرة المرنة لتحميل طبق زراعة الخلايا. - تحميل طبق ثقافة الخلية. تذكر إضافة زيت الغمر في الجزء العلوي من المكثف قبل وضع طبق زراعة الخلايا. قم بإزالة غطاء الطبق وشل حركة الطبق باستخدام المشابك.
ملاحظة: لتجنب التلوث ، يجب إجراء جميع العمليات بالقفازات. - خفض الهدف في وسائط زراعة الخلايا للتركيز الخشن. اخفض قطعة الألومنيوم 2 لإحاطة الحجرة المرنة وتركيبها على حامل العينة باستخدام البراغي.
ملاحظة: يتم توصيل وسادة وسادة من مطاط السيليكون مقاس 2 مم بالجزء السفلي من قطعة الألومنيوم 2 لسد الفجوة بإحكام. - اضبط إمداد الهواء بنسبة 5٪ CO2 و 19٪ O2 لزراعة الخلايا الطبيعية بمعدل تدفق هواء يبلغ 200 سم مكعب / دقيقة.
ملاحظة: يمكن استخدام معدل تدفق هواء أقل. يعتمد ذلك على مدى جودة إغلاق الغرفة المرنة.
4. إجراء تجارب تصوير SRS للخلايا الحية ذات الفاصل الزمني
- اضبط الطول الموجي لليزر على 805 نانومتر لاستهداف إزاحة رامان 2854 سم -1 ، والتي تعزى إلى اهتزاز الروابط الكيميائية CH2 . استخدم طاقة ليزر منخفضة لتقليل التلف الضوئي للخلايا. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم ~ 15 ميغاواط متوسط الطاقة لليزر المضخة و ~ 7.5 ميغاواط من ليزر ستوكس (ثابت عند 1045 نانومتر) لتصوير الخلايا الحية على المدى الطويل.
ملاحظة: ستؤدي طاقة الليزر الأعلى إلى جودة تصوير SRS أفضل. ومع ذلك ، فإن طاقة الليزر العالية جدا ستؤدي إلى تلف ضوئي للخلايا الحية. هناك مقايضة بين جودة الصورة والتلف الضوئي. - اضبط الهدف وركز عليه لتحقيق تصوير SRS جيد للخلايا باستخدام زر FOCUS على لوحة MAIN CONTROLS الخاصة بالبرنامج. لإجراء التركيز البؤري السريع، اضبط رقم البكسل ليكون 512 × 512 بكسل مع وقت سكون بكسل يبلغ 4.8 ميكرو ثانية على لوحة التكوين .
- اضبط نطاق إدخال مضخم القفل (عادة 5 مللي فولت) ليكون ضعف الحد الأقصى لجهد الإشارة. اضبط مرشح الترددات المنخفضة ليكون هو نفسه وقت بقاء البكسل (4.8 μs).
ملاحظة: قد تستخدم أنظمة SRS المختلفة المبنية في المختبر إعدادات مختلفة للحصول على البيانات. - بعد تحقيق تركيز جيد ، اضبط دقة التصوير على 2,048 × 2,048 بكسل لمجال رؤية 175 ميكرومتر2 للحصول على صور عالية الجودة. تحقق من وظيفة SAVE في لوحة عناصر التحكم الرئيسية وتحقق من قناة SRS في لوحة CHANNELS . اضبط الفاصل الزمني بين إطارين ليكون 180 ثانية (3 دقائق) على قناة عناصر التحكم الرئيسية. اضبط رقم الاستحواذ على 480 للتصوير بفاصل زمني يزيد عن 24 ساعة.
ملاحظة: يمكن استخدام دقة تصوير أقل بناء على الغرض من التجارب. - ابدأ الحصول على التصوير الآلي باستخدام وظيفة LOOP في لوحة عناصر التحكم الرئيسية .
ملاحظة: تحقق مما إذا كان هناك انحراف بؤري بسبب عدم استقرار درجة الحرارة في الساعة الأولى من التصوير. قد لا يكون التصوير في الساعة الأولى مستقرا. تحقق من التركيز البؤري كل 2-3 ساعات أثناء جلسة التصوير بفاصل زمني. - معالجة الصور التي تم جمعها باستخدام ImageJ19. استخدم الطريقتين التاليتين لقياس LD: (i) نسبة LD / مساحة جسم الخلية ، و (ii) متوسط شدة SRS لإجمالي LDs. قم بقياس مساحة جسم الخلية عن طريق تحديد عتبة البكسل غير الخلوي وتصفيره في صور SRS عند 2,854 سم -1. قم بقياس منطقة LD وكثافتها عن طريق تحديد عتبة البكسل غير LD وتصفيرها في صور SRS.
ملاحظة: تم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل حول معالجة صور SRS سابقا16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بتصنيع وتجميع نظام الغرفة المرنة لتصوير SRS بفاصل زمني (الشكل 1 والشكل 2) ، ثم قمنا بتقييم أداء النظام. وصلت درجة الحرارة داخل العلبة البيئية للمجهر إلى 37 درجة مئوية المتوقعة في غضون 1 ساعة ، والتي لم تؤثر بشكل كبير على درجة حرارة الغرفة (الشكل 3 أ). وصلت درجة الحرارة في الغرفة المرنة إلى 37 درجة مئوية في 1.5 ساعة ، وتم الحفاظ عليها بثبات عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل (الشكل 3 ب). يمكن أن تصل الرطوبة النسبية في الغرفة المرنة إلى 85٪ في 1 ساعة ، ثم يتم الحفاظ عليها لمدة 24 ساعة على الأقل (الشكل 3C). تؤكد بيانات درجة الحرارة والرطوبة المقاسة أن هذا النظام يمكن أن يوفر بيئة مثالية لنمو الخلايا على المدى الطويل.
تم تطبيق تصوير الخلايا الحية باستخدام SRS على العديد من الدراسات البيولوجية والطبيةالحيوية 20،21،22،23،24. على وجه الخصوص ، جذب تصوير SRS ل LDs الخالية من الملصقات في الخلايا الحية لفهم استقلاب الدهون في السرطان الكثير من الاهتمام16،25،26. باستخدام نظام الغرفة المرنة المصمم ، أجرينا أولا تصوير SRS بفاصل زمني لخلايا SKOV3 الحية لمدة 24 ساعة مع فاصل زمني قدره 3 دقائق (الشكل 4). أظهرت بيانات الفيديو الحركة السريعة والنشطة ل LDs داخل الخلايا بدقة زمنية تبلغ 3 دقائق. بحلول نهاية جلسة التصوير التي استمرت 24 ساعة ، كانت الخلايا لا تزال تظهر مورفولوجيا وكثافة طبيعية ، مما يشير إلى أن الخلايا كانت صحية. ثم قمنا بتصوير خلايا SKOV3 المعالجة بحمض الأوليك (OA) وتتبعنا العملية الديناميكية لتراكم LD في غضون 10 ساعات (الشكل 5A).
تم تحديد كميات LD في خلايا SKOV3 المعالجة بالزراعة العضوية بطريقتين (نسبة LD إلى مساحة جسم الخلية وإجمالي كثافة SRS ل LDs) باستخدام ImageJ19. تشير النتائج إلى أن كمية LDs (من حيث الحجم والعدد) استمرت في الزيادة على مدار 10 ساعات (الشكل 5 ب). أظهرنا أيضا التصوير المتزامن ل SRS الأمامي ل LDs (اللون الأخضر الزائف) والتصوير الفلوري ثنائي الفوتون الخلفي (TPF) للجسيمات الحالة (اللون الأحمر الزائف) المسمى بصبغة مضان DND-189 (الشكل 6). ويلاحظ أنه يمكن استخدام التصوير ثنائي الطريقة SRS / TPF لتحليل التمركز المشترك لجزأين خلويين. في هذه التجربة ، لوحظت درجة منخفضة جدا من التمركز المشترك ل LDs والليزوزومات ، والتي أشارت إليها المناطق الصفراء الصغيرة. بشكل جماعي ، تظهر هذه النتائج أن نظام الغرفة المرنة يتيح تصوير SRS مستقرا وطويل الأجل وبفاصل زمني للخلايا الحية ، والذي يمكن استخدامه في تطبيقات التصوير المختلفة في المستقبل.
الشكل 1: نظام الحجرة المرنة لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني. (أ) رسم تخطيطي لنظام الحجرة المرنة لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني. (ب) توضح الصورة الموجودة على اليسار طبقة العزل الحراري باستخدام لوح مطاطي سيليكون ووسادات خزفية MICA أسفل إطار المجهر والمرحلة. تظهر الصورة الموجودة على اليمين حاوية المجهر البيئي والغرفة المرنة. الاختصارات: SRS = تشتت رامان المحفز ؛ CCM = سنتيمتر مكعب لكل دقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي وصور للغرفة المرنة مع المسار البصري SRS ، مما يسمح بحركة حرة ثلاثية الأبعاد لهدف غمس الماء للتركيز والتصوير. تظهر الصور اليسرى وحدتي الألمنيوم المشغلتين بالآلة المتصلتين بقطعة أنف تجارية وحامل عينة معدل. تظهر الصور السفلية نظام غرفة التجميع المرنة. اختصار: SRS = حفز تشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بيانات درجة الحرارة والرطوبة لحاوية المجهر والغرفة المرنة. (أ) بيانات درجة الحرارة المقاسة لحاوية المجهر ودرجة حرارة غرفة المختبر، حتى 12 ساعة. (ب) بيانات درجة الحرارة المقاسة (المتوسط عند 37 درجة مئوية) داخل الغرفة المرنة ، حتى 24 ساعة. (ج) بيانات الرطوبة النسبية المقاسة (المتوسط عند 85٪) داخل الغرفة المرنة ، حتى 24 ساعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تمثيل 24 إطارا لتصوير SRS بفاصل زمني. تصوير SRS بفاصل زمني (عند 2854 سم -1) لخلايا SKOV3 الحية باستخدام الحجرة المرنة ، حتى 24 ساعة. في هذه التجربة ، تم تسجيل 480 إطارا بفاصل زمني ثابت قدره 3 دقائق. تم استزراع الخلايا في ظل الظروف العادية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تصوير SRS بفاصل زمني وتحديد كمية قطرات الدهون. (أ) تمثيل 10 إطارات لتصوير SRS بفاصل زمني (عند 2854 سم -1) لخلايا SKOV3 الحية المعالجة ب 500 ميكرومتر OA ، حتى 10 ساعات ، باستخدام الغرفة المرنة. في هذه التجربة ، تم تسجيل 200 إطار بفاصل زمني ثابت قدره 3 دقائق. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) تم تحديد كمية LDs مقابل الوقت (0-10 h) بطريقتين (نسبة LD / مساحة جسم الخلية وإجمالي شدة SRS ل LDs) باستخدام وظيفة العتبة ووظائف تحليل الجسيمات في ImageJ. الاختصارات: SRS = مطيافية رامان المحفزة. الزراعة العضوية = حمض الأوليك ؛ LDs = قطرات الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التصوير الفلوري بفاصل زمني و SRS المتزامن والتصوير الفلوري ثنائي الفوتون ل LDs والجسيمات الحالة. الفاصل الزمني ، SRS المتزامن (عند 2,854 سم -1) ، والتصوير الفلوري ثنائي الفوتون ل LDs (اللون الأخضر الزائف) والليزوزومات (الأحمر) ، حتى 2 ساعة. تمت معالجة الخلايا بصبغة مضان (LysoSensor DND-189 ، 1 ميكرومتر) لمدة 1 ساعة قبل التصوير. تم التقاط الصور كل 3 دقائق. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. لوحظت درجة منخفضة من التمركز المشترك ل LDs والليزوزومات ، المشار إليها باللون الأصفر. الاختصارات: SRS = مطيافية رامان المحفزة. LDs = قطرات الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد الفحص المجهري SRS ذو الخلايا الحية ذات الفاصل الزمني تقنية تصوير بديلة لتتبع الجزيئات بطريقة خالية من الملصقات. بالمقارنة مع وضع العلامات الفلورية ، فإن تصوير SRS خال من التبييض الضوئي ، مما يتيح مراقبة الجزيئات على المدى الطويل. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن نظام التصوير بالخلايا الحية على مجهر SRS المستقيم غير متاح تجاريا. في هذا العمل ، تم تطوير نظام تصوير الخلايا الحية مع صندوق حاوية مجهر مستقر معزول حراريا وغرفة ناعمة داخلية مرنة لتمكين تصوير الفاصل الزمني SRS المرسل. في هذا الإعداد ، يحافظ صندوق العلبة الكبير على استقرار درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ، بينما توفر الغرفة الداخلية الناعمة الهواء المرطب لإنشاء بيئة زراعة الخلايا المثلى. تتيح الغرفة المفتوحة المرنة الموضحة في هذا العمل سير عمل بسيط لتصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية. يمكن أولا تحضير الخلايا المزروعة في طبق ذو قاع زجاجي وزراعتها في حاضنة عادية قبل نقلها إلى الغرفة المرنة على خشبة المسرح للتصوير. الحل البديل لإجراء تصوير SRS للخلايا الحية هو استخدام خلية تدفق مغلقة ، بما في ذلك منصات الموائع الدقيقة وقياس التدفق الخلوي27،28،29،30. من الممكن تصميم خلية تدفق بسمك أقل. ومع ذلك ، يمكن أن تكون زراعة الخلايا في غرفة التروية صعبة تقنيا31.
يعد الانجراف البؤري مشكلة شائعة في تصوير الخلايا الحية32. كعملية متعددة الفوتونات ، يتطلب توليد إشارة SRS تركيزا محكما لأشعة الليزر ، وبالتالي ، فإن الفحص المجهري SRS حساس للغاية للانحراف البؤري. عدم استقرار درجة الحرارة هو عامل أساسي في إحداث الانجراف البؤري. لتحسين الاستقرار الحراري ، تم وضع المجهر بأكمله بمواد عازلة للحرارة. ومع ذلك ، في بعض جلسات التصوير ، ما زلنا نعاني من الانجراف البؤري بعد 2-3 ساعات من التصوير. التصوير المجهري SRS حساس أيضا للاهتزاز ، مما قد يدمر التركيز. تساعد الطاولة البصرية المضادة للاهتزاز على تقليل الاهتزاز لتحقيق تصوير مستقر. لحل مشكلة الانجراف البؤري ، في التجارب المستقبلية ، يمكن اعتماد تقنيات التركيز التلقائي33.
يعد إجراء تطهير نظام التصوير أمرا بالغ الأهمية لتجنب تلوث الخلايا ، خاصة بالنسبة لهدف الغمر في الماء ، والذي سيتصل مباشرة بوسائط زراعة الخلايا. يجب أن يكون من الآمن استخدام 70٪ إيثانول لتنظيف أعلى العدسة. نظرا لأن ضوء الأشعة فوق البنفسجية يمكنه فقط تطهير سطح الأجسام بشكل فعال ، فقد تم تركيب أربعة مصابيح للأشعة فوق البنفسجية في مواقع مختلفة في صندوق العلبة لإجراء التطهير في هذه التجارب. ومع ذلك ، قد يؤدي ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى تدهور المكونات البلاستيكية في نظام التصوير. في هذه الحالة ، يمكن للمرء استخدام رقائق الألومنيوم لتغليف وتغطية الأجزاء البلاستيكية. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية ، يوصى بشدة بالمضادات الحيوية (عادة 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في وسائط الاستزراع).
قمنا بتصوير وقياس LDs في الخلايا السرطانية الحية في هذه التجارب. بالنسبة لهذه التجارب ، كان الفاصل الزمني لمدة 3 دقائق معقولا. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تغيير الفاصل الزمني للتصوير اعتمادا على احتياجات المشروع البحثي. على سبيل المثال ، لتتبع LD واحد في خلية حية ، قد تكون هناك حاجة إلى فاصل زمني أقل من 1 دقيقة. في المقابل ، يكفي فاصل زمني أطول لبضع دقائق لتتبع العمليات البيولوجية البطيئة34.
يستخدم تصوير SRS طاقة ليزر أعلى للإثارة من العديد من تقنيات التصوير البصري الأخرى ، والتي يمكن أن تكون صعبة لتصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية. يعد تصوير SRS للجزيئات الحيوية الأصلية أكثر صعوبة بسبب مقطع رامان العرضي الصغير للروابط الكيميائية35. في هذه التجارب ، تم استخدام ليزر مضخة 15 ميجاوات عند 805 نانومتر وليزر ستوكس 7.5 ميجاوات عند 1045 نانومتر ، ولم يلاحظ أي تلف ضوئي كبير في 24 ساعة مع فاصل زمني 3 دقائق. قد يؤدي استخدام علامات Raman الحساسة إلى تقليل طاقة الليزر بشكل أكبر36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر فريق التصميم الجامعي لعام 2019 (سوك تشول يون ، وإيان فوكستون ، ولويس مازا ، وجيمس والش) في جامعة بينغهامتون على تصميم وتصنيع واختبار صندوق حاوية المجهر. نشكر سكوت هانكوك وأولغا بتروفا وفابيولا مورينو أوليفاس في جامعة بينغهامتون على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R15GM140444.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R.
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P.
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al.
