Summary
We rapporteren een stage-top, flexibele omgevingskamer voor time-lapse beeldvorming van levende cellen met behulp van rechtop gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie met verzonden signaaldetectie. Lipidedruppeltjes werden afgebeeld in SKOV3-cellen behandeld met oliezuur gedurende maximaal 24 uur met een tijdsinterval van 3 minuten.
Abstract
Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie. Live-cell beeldvorming met SRS is aangetoond voor vele biologische en biomedische toepassingen. Langdurige time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen is echter niet op grote schaal toegepast. SRS-microscopie maakt vaak gebruik van een waterdompelobjectief met hoog numeriek diafragma (NA) en een hoge NA-oliedompelcondensor om beeldvorming met hoge resolutie te bereiken. In dit geval is de opening tussen het objectief en de condensor slechts enkele millimeters. Daarom kunnen de meeste commerciële podiumomgevingskamers niet worden gebruikt voor SRS-beeldvorming vanwege hun grote dikte met een stijve glazen afdekking. Dit artikel beschrijft het ontwerp en de fabricage van een flexibele kamer die kan worden gebruikt voor time-lapse live-cell imaging met verzonden SRS-signaaldetectie op een rechtopstaand microscoopframe. De flexibiliteit van de kamer wordt bereikt door een zacht materiaal te gebruiken - een dunne natuurlijke rubberen film. De nieuwe behuizing en het ontwerp van de kamer kunnen eenvoudig worden toegevoegd aan een bestaande SRS-beeldvormingsopstelling. De tests en voorlopige resultaten tonen aan dat het flexibele kamersysteem stabiele, langdurige, time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk maakt, die in de toekomst voor verschillende bioimaging-toepassingen kan worden gebruikt.
Introduction
Optische microscopie wordt gebruikt om de microstructuren van monsters te observeren. Optische beeldvorming is snel, minder invasief en minder destructief dan andere technologieën1. Live-cell imaging met optische microscopie is ontwikkeld om de dynamiek van gekweekte levende cellen over een lange periode vast te leggen2. Verschillende soorten optische contrasten bieden verschillende informatie over biologische monsters. Optische fasemicroscopie toont bijvoorbeeld het subtiele verschil in de brekingsindices in het monster3. Fluorescentiemicroscopie wordt veel gebruikt om specifieke biomoleculen of cellulaire organellen in beeld te brengen. De breedbandexcitatie- en emissiespectra van fluorescentie resulteren echter meestal in spectrale overlapping wanneer meerkleurige beeldvorming wordt uitgevoerd4. Fluorescerende moleculen zijn lichtgevoelig en kunnen worden gebleekt na langdurige, periodieke blootstelling aan licht. Bovendien kan fluorescentielabeling de biodistributie van de moleculen in cellen5 veranderen. SRS-microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie6. Het contrast van SRS is gebaseerd op de trillingsovergang van specifieke chemische bindingen. De trillingsfrequentie van een chemische binding vertoont vaak een smalle spectrale bandbreedte, waardoor het mogelijk is om meerdere Raman-banden in dezelfde monsters af te beelden7. SRS-microscopie is een uniek hulpmiddel voor beeldvorming van levende cellen en biedt meerdere chemische contrasten op een labelvrije manier8.
Hoewel SRS-beeldvorming van niet-gekleurde cellen voor veel studies is gebruikt, is SRS-beeldvorming van levende cellen op lange termijn niet op grote schaal toegepast. Een reden is dat commerciële open kamers niet direct kunnen worden gebruikt voor SRS-beeldvorming vanwege hun grote dikte 9,10,11,12. Deze kamers met een glazen deksel zijn meestal ontworpen voor brightfield- of fluorescentiebeeldvorming met behulp van een enkel hoog NA-objectief met een achterwaarts detectieschema. SRS-beeldvorming geeft echter de voorkeur aan verzonden detectie met behulp van zowel een hoog NA-objectief als een hoge NA-condensor, waardoor er slechts een zeer korte opening (meestal enkele millimeters) tussen het objectief en de condensor overblijft. Om dit probleem op te lossen, hebben we een flexibele kamer ontworpen met behulp van een zacht materiaal om time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk te maken met behulp van een rechtopstaand microscoopframe. In dit ontwerp is het waterdompelobjectief ingesloten in de zachte kamer en kan het vrij bewegen in drie dimensies voor scherpstel- en beeldvormingsdoeleinden.
De optimale temperatuur voor het kweken van de meeste zoogdiercellen is 37 °C, terwijl de kamertemperatuur altijd 10° lager is dan dit. Temperatuur hoger of lager dan 37 °C heeft een dramatisch effect op de celgroeisnelheid13. Daarom is temperatuurregeling van de celkweekomgeving vereist in een live-cell imaging-systeem. Het is bekend dat temperatuurinstabiliteit zal leiden tot onscherpe problemen tijdens langdurige beeldvorming14. Om een stabiele omgeving van 37 °C te bereiken, hebben we een grote behuizingskamer gebouwd om het hele microscoopframe te bedekken, inclusief een thermische isolatielaag onder de microscoop (figuur 1). In de omvangrijke temperatuurregelkamer helpt de kleine flexibele kamer om de fysiologische vochtigheid en pH nauwkeurig te handhaven via de gereguleerde luchtstroom aangevuld met 5% CO 2 (figuur 2). De temperatuur en vochtigheid van de kamers werden gemeten om te bevestigen dat het ontwerp met dubbele kamer de optimale celkweekconditie bood voor celgroei onder langdurige, periodieke SRS-beeldvorming (figuur 3). Vervolgens demonstreerden we de toepassing van het systeem voor time-lapse beeldvorming en het volgen van lipidedruppels (LDs) in SKOV3-kankercellen (figuur 4, figuur 5 en figuur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bouw de microscoop omgevingsbehuizing
OPMERKING: Deze omgevingsbehuizing met grote microscoop wordt gebruikt om de temperatuur van het microscooplichaam en de beeldomgeving te stabiliseren op 37 °C te regelen (figuur 1A).
- Markeer de locaties van de voeten van het SRS-microscoopframe en het gemotoriseerde podium met behulp van een markeerpen op de optische tafel. Monteer twee irismembranen voor de galvanometerscanner van de microscoop en pas deze aan om de pomp en Stokes-laserstralen door het midden van de irismembranen te laten gaan.
- Verwijder het microscoopframe en het podium uit de optische tafel.
- Leg de siliconen rubberen plaat (grootte: 31 x 29 inch, dikte: 1/8 inch) op de optische tafel (figuur 1B).
- Snijd het siliconenrubber langs de markeringen met een mes, verwijder kleine rubberen stukjes en plaats de vierkante MICA-keramische vellen (grootte: 6 x 6 inch, dikte: 1/4 inch) op dezelfde locaties.
OPMERKING: MICA-keramiek is een gemakkelijk te bewerken materiaal15. Het is zo hard als aluminium, maar is een uitstekende thermische isolator. MICA keramische platen werden gebruikt om de warmteoverdracht van het metalen microscoopframe en het podium naar de roestvrijstalen optische tafel te stoppen. Een paar doorgaande gaten moeten op de MICA-platen worden geboord om het gebruik van 1/4-20 schroeven voor de montage van de voeten van het frame en het podium mogelijk te maken. - Beweeg het microscoopframe en het podium terug naar de optische tafel en lijn de voeten voorzichtig uit op de MICA keramische vellen langs de markeringslijnen. Gebruik 1/4-20 schroeven om het frame en het podium op de tafel te monteren.
- Lijn het optische pad van SRS opnieuw uit. Pas de spiegelsteunen van spiegel 1 en spiegel 2 aan om de laserstraal door het midden van de twee voorgemonteerde irismembranen te laten gaan (figuur 2).
OPMERKING: Technische details van de in het laboratorium gebouwde SRS-microscoop die wordt gebruikt voor het huidige live-cell imaging-werk zijn eerder beschreven16. De pulsbreedte van de pomp en Stokes-balken zijn ~ 3-4 ps met glazen staafdispersie. Het systeem wordt aangestuurd met de ScanImage17 software. - Bovenop deze thermische isolatiefundering, monteer de omgevingsbehuizing om het hele microscoopframe te bedekken met behulp van vijf stukken grote polycarbonaatplaten (grootte: 31 x 29 x 28 inch, dikte: 0,25 inch).
OPMERKING: De grootte van de behuizingsdoos wordt bepaald op basis van de afmetingen van het microscoopframe en het podium. Het voorpaneel van de microscoopbehuizingsdoos moet tijdelijk worden verwijderd om de flexibele kamer te installeren en de celkweekschaal te laden.- Om de behuizing te monteren, voert u eenvoudig bewerkingswerk uit, waaronder snijden, boren en tappen van schroefgaten aan elke rand van de polycarbonaatplaten. Snijd twee grote gaten met een diameter van 2,6 inch aan de rechter- en linker vellen van de behuizing om respectievelijk in de inlaat- en uitlaatbuis te passen. Snijd een klein gaatje met een diameter van 5 mm op het achterblad om de laserstralen in de behuizing te laten komen.
- Sluit de randen en interfaces van de doos af met aluminiumfolietape.
- Sluit de flexibele kanaalslang aan op de inlaat en de uitlaatpoorten van de behuizingsdoos om een gecirculeerde warme luchtstroom te laten pompen en regelen door de verwarmingsmodule. Plaats de thermische sensor van de verwarmingsmodule in de flexibele kamer waar de cellen worden gekweekt en afgebeeld. Stel de beoogde temperatuur in op 37 °C.
OPMERKING: Een diffuser kan worden gebruikt om een meer uniforme luchtstroomverdeling in de omgevingsbehuizing te krijgen.
2. Monteer de flexibele kamer
- Monteer het bewerkte holle cilindrische aluminium stuk 1 (materiaal: aluminium 6061) aan het neusstuk van het objectief met behulp van drie stelschroeven (figuur 2).
- Monteer het bewerkte holle cilindrische aluminium stuk 2 op de monsterhouder met behulp van vier 1/4-20 schroeven (figuur 2).
OPMERKING: De monsterhouder moet zodanig worden aangepast dat de kweekschaal met glazen bodem van 50 mm wordt vastgehouden. Boor een doorgaand gat in het midden van de monsterhouder met behulp van een gatenzaag van 1-7/8 inch. Counterbore het gat met behulp van een gatenzaag van 50 mm en houd de diepte van het doorgaande gat ~ 1 mm. - Monteer de monsterhouder met het aluminium stuk 2 op het gemotoriseerde podium en monteer deze met schroeven.
- Plaats de natuurrubberen filmhuls (dikte: 0,01 inch; gelijmd met cyanoacrylaatlijm) tussen de twee bewerkte aluminium stukken en monteer deze met behulp van elastiekjes aan elk uiteinde.
- Sluit de gecomprimeerde CO2-cilinder aan op de gasmengermodule met behulp van de juiste buizen en connectoren. Stel de CO 2-ingangsdruk in op 20-25 psi. Gebruik een ingebouwde CO 2-sensor en een controller om ervoor te zorgen dat de luchtmixermodule 5% CO2 in de luchtstroom kan regelen en mengen. Gebruik inline filters om de luchtstroom op te ruimen.
- Gebruik de juiste buizen en connectoren om de gemengde lucht (met 5% CO2) naar de voorgesteriliseerde waterfles op de hete plaat te leiden en vervolgens de bevochtigde lucht naar de flexibele kamer te leiden. Zet de kookplaat op 37 °C. Bel de luchtstroom in het warme water om de luchtvochtigheid van de luchtstroom te verhogen.
3. Voorbereiding op time-lapse live-cell SRS imaging experimenten
- Veeg alle delen van de flexibele kamer schoon met 70% ethanol, inclusief het neusstuk, het waterdompeldoel en de monsterhouder.
- Ontsmet het hele behuizingssysteem met behulp van een UV-lamp die gedurende 20 tot 30 minuten in de behuizing is geplaatst.
OPMERKING: Blijf niet in de laboratoriumruimte tijdens het UV-desinfectieproces voor de veiligheid. - Kweek SKOV3-cellen gedurende 12 uur onder normale fysiologische omstandigheden in een petrischaal met glazen bodem van 50 mm in een reguliere incubator.
OPMERKING: Start de SKOV3 celkweek18 in een standaard bioveiligheidskast. - Koppel het bewerkte aluminium stuk 2 los van de monsterhouder door de schroeven te verwijderen.
OPMERKING: Dit is de manier om de flexibele kamer te openen om de celkweekschaal te laden. - Laad de celkweekschaal. Vergeet niet om dompelolie op de bovenkant van de condensor toe te voegen voordat u de celkweekschaal plaatst. Verwijder de deksel van de schaal en immobiliseer de schaal met behulp van de klemmen.
OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, moeten alle bewerkingen met handschoenen worden uitgevoerd. - Verlaag het objectief in de celkweekmedia voor grof scherpstellen. Laat het aluminium stuk 2 zakken om de flexibele kamer te omsluiten en monteer het met schroeven op de monsterhouder.
OPMERKING: Een 2 mm siliconen rubberen kussenkussen is bevestigd aan de onderkant van het aluminium stuk 2 om de opening goed af te dichten. - Stel de luchttoevoer in met 5% CO 2 en 19% O2 voor normale celcultuur met een luchtdebiet van 200 cc/min.
OPMERKING: Er kan een lager luchtdebiet worden gebruikt. Het hangt af van hoe goed de flexibele kamer is afgedicht.
4. Voer time-lapse live-cell SRS-beeldvormingsexperimenten uit
- Stem de lasergolflengte af op 805 nm om de 2854 cm-1 Raman-verschuiving te richten, die wordt toegeschreven aan de trilling van CH2 chemische bindingen. Gebruik een laag laservermogen om fotoschade aan de cellen te verminderen. Om dit protocol te volgen, gebruikt u ~ 15 mW gemiddeld vermogen van de pomplaser en ~ 7,5 mW van de Stokes-laser (gefixeerd op 1.045 nm) voor langdurige live-cell beeldvorming.
OPMERKING: Een hoger laservermogen levert een betere SRS-beeldkwaliteit op. Een te hoog laservermogen zal echter fotoschade aan levende cellen veroorzaken. Er is een afweging tussen beeldkwaliteit en fotoschade. - Pas het doel aan en focus het om een goede SRS-beeldvorming van de cellen te bereiken met behulp van de FOCUS-knop op het hoofdbedieningspaneel van de software. Als u snel wilt scherpstellen, stelt u het pixelnummer in op 512 × 512 pixels met een pixelverblijftijd van 4,8 μs in het deelvenster CONFIGURATIE .
- Stel het ingangsbereik van de lock-in versterker (meestal 5 mV) in op tweemaal de maximale signaalspanning. Stel het laagdoorlaatfilter in op hetzelfde als de verblijftijd van de pixel (4,8 μs).
OPMERKING: Verschillende in het lab gebouwde SRS-systemen kunnen verschillende instellingen voor gegevensverzameling gebruiken. - Na het bereiken van een goede scherpstelling, stelt u de beeldresolutie in op 2.048 × 2.048 pixels voor een gezichtsveld van 175 μm2 voor het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit. Controleer de functie OPSLAAN op het paneel HOOFDBEDIENING en controleer het SRS-kanaal op het deelvenster KANALEN . Stel de intervaltijd tussen twee frames in op 180 s (3 min) op het MAIN CONTROLS-kanaal. Stel het acquisitienummer in op 480 voor time-lapse-beeldvorming gedurende 24 uur.
OPMERKING: Een lagere beeldresolutie kan worden gebruikt op basis van het doel van de experimenten. - Start geautomatiseerde beeldacquisitie met behulp van de LOOP-functie op het MAIN CONTROLS-paneel .
OPMERKING: Controleer of er sprake is van focale drift als gevolg van temperatuurinstabiliteit in het eerste uur van de beeldvorming. De beeldvorming van het eerste uur is mogelijk niet stabiel. Controleer de scherpstelling elke 2-3 uur tijdens de time-lapse beeldvormingssessie. - Verwerk de verzamelde afbeeldingen met ImageJ19. Gebruik de volgende twee methoden voor LD-kwantificering: (i) de LD/cellichaamsoppervlakteverhouding en (ii) de gemiddelde SRS-intensiteit van totale LD's. Meet het cellichaamgebied door de niet-cellulaire pixels in de SRS-afbeeldingen te drempelen en op nul te zetten bij 2.854 cm-1. Meet het LD-gebied en de intensiteit door de niet-LD-pixels in de SRS-afbeeldingen te drempelen en op nul te zetten.
OPMERKING: Meer details over SRS-beeldverwerking zijn eerder gemeld16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We fabriceerden en assembleerden het flexibele kamersysteem voor time-lapse SRS-beeldvorming (figuur 1 en figuur 2) en evalueerden vervolgens de prestaties van het systeem. De temperatuur in de omgevingsruimte van de microscoop bereikte binnen 1 uur de verwachte 37 °C, wat de kamertemperatuur niet significant beïnvloedde (figuur 3A). De temperatuur in de flexibele kamer bereikte 37 °C in 1,5 uur en werd gedurende ten minste 24 uur stabiel op 37 °C gehouden (figuur 3B). De relatieve vochtigheid in de flexibele kamer kan in 1 uur 85% bereiken en vervolgens gedurende ten minste 24 uur worden gehandhaafd (figuur 3C). De gemeten temperatuur- en vochtigheidsgegevens bevestigen dat dit systeem een optimale omgeving kan bieden voor langdurige celgroei.
Live-cell imaging met SRS is toegepast op vele biologische en biomedische studies 20,21,22,23,24. Met name SRS-beeldvorming van labelvrije LD's in levende cellen om het lipidenmetabolisme bij kanker te begrijpen, heeft veel aandacht getrokken16,25,26. Met behulp van het ontworpen flexibele kamersysteem voerden we eerst time-lapse SRS-beeldvorming uit van levende SKOV3-cellen gedurende 24 uur met een tijdsinterval van 3 minuten (figuur 4). De videogegevens toonden de snelle en actieve beweging van intracellulaire LDs met een temporele resolutie van 3 min. Tegen het einde van de 24-uurs beeldvormingssessie vertoonden de cellen nog steeds een normale morfologie en dichtheid, wat aangeeft dat de cellen gezond waren. Vervolgens beeldden we SKOV3-cellen af die werden behandeld met oliezuur (OA) en volgden we het dynamische proces van LD-accumulatie binnen 10 uur (figuur 5A).
De LD-hoeveelheden werden gekwantificeerd in de met OA behandelde SKOV3-cellen op twee manieren (LD-cellichaamsoppervlakteverhouding en totale SRS-intensiteit van de LD's) met behulp van ImageJ19. De resultaten geven aan dat de hoeveelheid LDs (in grootte en aantal) gedurende 10 uur bleef toenemen (figuur 5B). We toonden ook gelijktijdige forward-SRS-beeldvorming van LDs (pseudo-kleurgroen) en achterwaartse twee-fotonfluorescentie (TPF) beeldvorming van lysosomen (pseudo-kleur rood) gelabeld met een fluorescentiekleurstof DND-189 (figuur 6). Opgemerkt wordt dat SRS / TPF dual-modaliteit beeldvorming kan worden gebruikt om de colocalisatie van twee cellulaire compartimenten te analyseren. In dit experiment werd een zeer lage mate van colokalisatie van LDs en lysosomen waargenomen, wat werd aangegeven door de kleine gele gebieden. Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat het flexibele kamersysteem stabiele, langdurige, time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk maakt, die in de toekomst voor verschillende beeldvormingstoepassingen kan worden gebruikt.
Figuur 1: Het flexibele kamersysteem voor time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen. (A) Schema van het flexibele kamersysteem voor time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen. (B) De afbeelding aan de linkerkant toont de thermische isolatielaag met behulp van een siliconen rubberen plaat en MICA keramische pads onder het microscoopframe en het podium. De afbeelding rechts toont de omgevingsmicroscoopbehuizing en de flexibele kamer. Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman verstrooiing; CCM = kubieke centimeter per min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema en afbeeldingen van de flexibele kamer met het optische SRS-pad, waardoor driedimensionale vrije beweging van het waterdompelobjectief mogelijk is voor scherpstellen en beeldvorming. De linker afbeeldingen tonen de twee bewerkte aluminium modules die zijn aangesloten op een commercieel objectief neusstuk en een gemodificeerde monsterhouder. De onderste afbeeldingen tonen het flexibele kamersysteem van de montage. Afkorting: SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Temperatuur- en vochtigheidsgegevens van de microscoopruimte en de flexibele kamer. (A) De gemeten temperatuurgegevens van de microscoopruimte en de laboratoriumkamertemperatuur, tot 12 uur. (B) De gemeten temperatuurgegevens (gemiddeld bij 37 °C) in de flexibele kamer, tot 24 uur. (C) de gemeten relatieve vochtigheidsgegevens (gemiddeld 85%) in de flexibele kamer; tot 24 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve 24 frames van time-lapse SRS-beeldvorming. Time-lapse SRS-beeldvorming (bij 2.854 cm-1) van levende SKOV3-cellen met behulp van de flexibele kamer, tot 24 uur. In dit experiment werden 480 frames opgenomen met een vast tijdsinterval van 3 minuten. Cellen werden onder normale omstandigheden gekweekt. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Time-lapse SRS-beeldvorming en lipidedruppelkwantificering. (A) Representatieve 10 frames van time-lapse SRS-beeldvorming (bij 2.854 cm-1) van levende SKOV3-cellen behandeld met 500 μM OA, tot 10 uur, met behulp van de flexibele kamer. In dit experiment werden 200 frames opgenomen met een vast tijdsinterval van 3 minuten. Schaalbalk = 50 μm. (B) De hoeveelheid LDs versus tijd (0-10 h) werd op twee manieren gekwantificeerd (LD/cell body area ratio en total SRS intensity of LDs) met behulp van de thresholding functie en de deeltjesanalyse functies in ImageJ. Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman spectroscopie; OA = oliezuur; LDs= lipidedruppeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Time-lapse, gelijktijdige SRS en twee-foton fluorescentie beeldvorming voor LDs en lysosomen. Time-lapse, gelijktijdige SRS (bij 2.854 cm-1) en twee-foton fluorescentie beeldvorming voor LDs (pseudo kleur groen) en lysosomen (rood), tot 2 uur. Cellen werden behandeld met een fluorescentiekleurstof (LysoSensor DND-189, 1 μM) gedurende 1 uur vóór beeldvorming. Om de 3 minuten werden er foto's gemaakt. Schaalbalk = 50 μm. Een lage mate van colocalisatie van LDs en lysosomen werd waargenomen, aangegeven met de gele kleur. Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman spectroscopie; LDs= lipidedruppeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse live-cell SRS-microscopie is een alternatieve beeldvormingstechniek voor het volgen van moleculen op een labelvrije manier. In vergelijking met fluorescentie-etikettering is SRS-beeldvorming vrij van fotobleken, waardoor moleculen op lange termijn kunnen worden gemonitord. Tot op heden is het live cell imaging-systeem op een rechtopstaande SRS-microscopie echter niet in de handel verkrijgbaar. In dit werk werd een live cell imaging-systeem met een stabiele thermisch geïsoleerde microscoopbehuizingsdoos en een flexibele binnenste zachte kamer ontwikkeld om verzonden SRS time-lapse beeldvorming mogelijk te maken. In deze opstelling handhaaft de grote behuizingsdoos de temperatuurstabiliteit op 37 °C, terwijl de interne zachte kamer bevochtigde lucht levert om een optimale celkweekomgeving te creëren. De flexibele open kamer die in dit werk wordt gedemonstreerd, maakt een eenvoudige workflow mogelijk voor langdurige SRS-beeldvorming van levende cellen. Cellen die in een schaal met glazen bodem zijn gezaaid, kunnen eerst worden bereid en gekweekt in een gewone incubator voordat ze worden overgebracht naar de flexibele kamer op het podium voor beeldvorming. Een alternatieve oplossing voor het uitvoeren van live-cell SRS-beeldvorming is het gebruik van een gesloten flowcel, inclusief de microfluïdische en flowcytometrieplatforms27,28,29,30. Het is mogelijk om een flowcel te ontwerpen met een lagere dikte. Het kweken van cellen in een perfusiekamer kan echter technisch uitdagend zijn31.
Focale drift is een veel voorkomend probleem bij live-cell imaging32. Als een multifotonproces vereist SRS-signaalgeneratie een strakke focus van de laserstralen en daarom is SRS-microscopie zeer gevoelig voor focale drift. Temperatuurinstabiliteit is een essentiële factor bij het induceren van focale drift. Om de thermische stabiliteit te verbeteren, werd de hele microscoop ingesloten met thermisch isolatiemateriaal. In sommige beeldvormingssessies ervoeren we echter nog steeds focale drift na 2-3 uur beeldvorming. SRS microscopische beeldvorming is ook gevoelig voor trillingen, die het scherpstellen kunnen vernietigen. Een optische antitrillingstafel helpt trillingen te verminderen om stabiele beeldvorming te bereiken. Om het probleem van de focale drift op te lossen, kunnen in toekomstige experimenten autofocustechnologieën worden gebruikt33.
De desinfectieprocedure van het beeldvormingssysteem is van cruciaal belang om besmetting van de cellen te voorkomen, vooral voor het doel van onderdompeling in water, dat rechtstreeks contact maakt met de celkweekmedia. Het moet veilig zijn om 70% ethanol te gebruiken voor het reinigen van de lens. Omdat UV-licht alleen het oppervlak van de objecten effectief kan desinfecteren, werden vier UV-lampen op verschillende locaties in de behuizingsdoos gemonteerd om desinfectie in deze experimenten uit te voeren. Het UV-licht kan echter de plastic componenten in het beeldvormingssysteem afbreken. In dit geval kan men aluminiumfolie gebruiken om de plastic onderdelen te wikkelen en te bedekken. Voor beeldvorming met levende cellen worden antibiotica (meestal 100 eenheden / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine in de kweekmedia) ten zeerste aanbevolen.
We hebben de LD's in levende kankercellen in deze experimenten in beeld gebracht en gekwantificeerd. Voor deze experimenten was een tijdsinterval van 3 minuten redelijk. Opgemerkt wordt dat het beeldvormingstijdsinterval kan worden gewijzigd afhankelijk van de behoeften van het onderzoeksproject. Als u bijvoorbeeld een enkele LD in een levende cel wilt volgen, kan een tijdsinterval van minder dan 1 minuut vereist zijn. Daarentegen is een langer tijdsinterval van enkele minuten voldoende om langzame biologische processen te volgen34.
SRS-beeldvorming maakt gebruik van een hoger laservermogen voor excitatie dan veel andere optische beeldvormingstechnologieën, wat een uitdaging kan zijn voor langdurige time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen. SRS-beeldvorming van de inheemse biomoleculen is nog uitdagender vanwege de kleine Raman-doorsnede van de chemische bindingen35. In deze experimenten werden een 15 mW pomplaser bij 805 nm en 7,5 mW Stokes-laser bij 1.045 nm gebruikt en werd geen significante fotoschade waargenomen in 24 uur met een tijdsinterval van 3 minuten. Het gebruik van gevoelige Raman-tags kan het laservermogen verder verminderen36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We willen het 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza en James Walsh) aan de Binghamton University bedanken voor het ontwerp, de fabricage en het testen van de microscoopbehuizingsdoos. We bedanken Scott Hancock, Olga Petrova en Fabiola Moreno Olivas van Binghamton University voor nuttige discussies. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health onder awardnummer R15GM140444.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R.
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P.
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al.
