Summary
פרוטוקול זה מתאר את היצירה של כלי דם המארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומושרים פלוריפוטנטים. רשתות כלי דם אלה מציגות רשת אנדותל נרחבת ומחוברת המוקפת בפריציטים, אקטין שריר חלק וקרום מרתף רציף.
Abstract
אורגנואיד מוגדר כרקמה רב-תאית מהונדסת במבחנה המחקה את האיבר המקביל לה in vivo כך שניתן להשתמש בו כדי לחקור היבטים מוגדרים של אותו איבר בצלחת תרבית רקמה. הרוחב והיישום של מחקר אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) התקדמו באופן משמעותי וכוללים את המוח, הרשתית, צינור הדמעות, הלב, הריאות, המעי, הלבלב, הכליות וכלי הדם, בין מספר רקמות אחרות. פיתוח שיטות ליצירת כלי דם אנושיים, במיוחד, פתח את הדרך למידול התפתחות כלי דם אנושיים ומחלות במבחנה ולבדיקה וניתוח של תרופות חדשות או טרופיזם רקמות בזיהומים וירוסים, כולל SARS-CoV-2. פרוטוקולים מורכבים וממושכים ללא הנחיה חזותית מעכבים את יכולת השחזור של אורגנואידים רבים שמקורם בתאי גזע. בנוסף, הסטוכסטיות האינהרנטית של תהליכי היווצרות אורגנואידים וארגון עצמי מחייבת יצירת פרוטוקולים אופטיים כדי לקדם את ההבנה של רכישה ותכנות של גורל התא. כאן, פרוטוקול מונחה חזותית מוצג עבור הדור של אורגנואידים תלת-ממדיים של כלי דם אנושיים (BVOs) שהונדסו מ-hPSCs. BVOs מציגים קרום מרתף רציף, תאי אנדותל וסקולריים וארטיקולציה מאורגנת עם תאי קיר, ומציגים את התכונות הפונקציונליות, המורפולוגיות והמולקולריות של כלי הדם הזעירים האנושיים. היווצרות BVO מתחילה באמצעות היווצרות מצטברת, ואחריה מזודרם ואינדוקציה וסקולרית. הבשלת כלי הדם והיווצרות הרשת יזומות ונתמכות על ידי הטמעת אגרגטים בקולגן תלת-ממדי ובמטריצת קרום מרתף מסיסה. רשתות כלי שיט אנושיים נוצרות תוך 2-3 שבועות וניתן להגדיל אותן עוד יותר במערכות תרבית מדרגיות. חשוב לציין, BVOs מושתלים בעכברים מדוכאי חיסון אנסטומוזים עם זרימת עכבר אנדוגנית ומציינים לעורקים פונקציונליים, ורידים ועורקים. הפרוטוקול הנוכחי מונחה חזותית יקדם את מחקר האורגנואידים בבני אדם, במיוחד ביחס לכלי דם בהתפתחות תקינה, כלי דם של רקמות ומחלות.
Introduction
תפקוד לקוי של כלי הדם ומחלות כלי דם נוכחים עם סיבוכים ניכרים בתפקודי איברים. מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בעולם1 והיא גם הגורם העיקרי לעלייה בעלויות הבריאות בארצות הברית. מספרי מקרי CVD גדלים מדי שנה, ומספר עולה של מקרים אלה מתרחש בקבוצות גיל צעירות יותר (20-45 שנים)2. מודלים מרובים in vivo פותחו כדי לחקור את ההתפתחות וההבשלה של כלי דם, מחלות כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל 3,4. כיום, שיטות המשלבות תאים בודדים ומרובים המוגדרים על ידי שושלת שמקורם בתאי גזע או שבודדו מרקמות בוגרות in vivo יכולות ליצור רשתות כלי דם המשכפלות היבטים של תפקוד כלי הדם האנושיים והאנטומיה 5,6. כלי הדם התפתחו כאחת המערכות התפקודיות הראשונות במהלך ההתפתחות מהמזודרם, והם מתארגנים באמצעות תהליך הרכבה הנקרא "וסקולוגנזה" או על ידי התרחבות והסתעפות מכלי דם קיימים, המכונה "אנגיוגנזה"7.
תוך מינוף כוחה של ביולוגיה התפתחותית והרכבה מכוונת עצמית, וימר ועמיתיו דיווחו על אורגנואידים תלת-ממדיים ראשונים של כלי דם אנושיים בעלי ארגון עצמי מתאי גזע גזעיים (hPSC), המציגים את המאפיינים הפונקציונליים, המורפולוגיים והמולקולריים של כלי הדם הזעירים האנושיים8. בדומה לכלי הדם האנושיים9, hBVOs אלה נוצרים ונוכחים עם אנדותל, קרום מרתף רציף, ותאי ציור קיר סביבו 8,10. hBVOs ניתן להשתיל in vivo ו anastomosed עם מחזור הדם אנדוגני. הם יכולים גם לעבור התבגרות במבחנה ולשמש מודלים למחלות לב וכלי דם (כלומר, סוכרת)8 או טרופיזם רקמות בזיהומים וירוסים כגון SARS-CoV-211. בעוד שפרסמנו בעבר פרוטוקול כתוב10, לא קיים פרוטוקול וידאו זמין עבור טכניקה מורכבת זו.
באמצעות התקדמות הדרגתית תמציתית, היווצרות hBVO מושגת באמצעות היווצרות אגרגטים, השראת מזודרם באמצעות אגוניסט WNT, כירון (CHIR99021), וחלבון מורפוגני עצם - 4 (BMP4)12,13, השראת כלי דם באמצעות גורם גדילה אנדותל כלי דם A (VEGFA) ופורסקולין (Fors)12, והטבעה במטריצת הנבטה מותאמת אישית 8,10. התבגרות כלי הדם והיווצרות הרשת עוקבות אחר הטבעה של האגרגטים במטריצת הנבט. רשתות כלי דם אנושיים אלה נוצרות תוך 2-3 שבועות וניתן להסיר אותן ממטריצת ההנבטה ולגדול עוד יותר במערכות תרבית ניתנות להרחבה למשך עד 6 חודשים. כאן, נהלים מונחים אופטית מסופקים להיווצרות ויישום של כלי דם נגזר תאי גזע אנושיים.
Protocol
כל הניסויים שבוצעו כאן השתמשו בקו H9 iPSC האנושי הזמין מסחרית. קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים נפוצים שאינם זמינים מסחרית (כלומר, H9, NC8) נבדקו גם הם והוכחו כיעילים לייצור אורגנואידים של כלי דם אנושיים באמצעות פרוטוקול זה. לקבלת פרטים, עיין בדוחות 8,10 שפורסמו בעבר.
1. ניסוח מדיה ומגיב ליצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים
- הכינו את אמצעי הצבירה.
- יש לערבב 40 מ"ל של DMEM/F12 (בינוני אוסמולליות נמוך ללא L-גלוטמין או חיץ HEPES הממוטב לצמיחת ESC ו-iPSC אנושיים), 10 מ"ל של תחליף סרום נוק-אאוט (KOSR), 0.5 מ"ל של 200 מ"ל L-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד ב-0.85% NaCl, 0.5 מ"ל חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 35 מיקרוליטר בטא-מרקפטואתנול (BME, 100 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול ב-10 מ"ל PBS סטרילי), ו-Y-27632 (מעכב סלקטיבי וחדיר לתאים של חלבון קינאז מסוג Rho-associated, סליל סליל המכיל חלבון [ROCK]14 [10 mM] בשעה 1:200) (ראה טבלת חומרים).
- הכינו N2B27 (N2 ו-B27 בתוספת מדיום בסיסי).
- יש לערבב 25 מ"ל DMEM/F12, 25 מ"ל של מדיה נוירובזלית, 1 מ"ל של תוסף B27, 0.5 מ"ל של תוסף N2, 250 מיקרוליטר של 200 מ"ל L-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד ב-0.85% NaCl, ו-35 מיקרוליטר בטא-מרקפטואתנול (ראו טבלת חומרים).
- הכן את מדיום אינדוקציה mesoderm.
- תוספת N2B27 בינונית עם ChiR (12 מיקרומטר, מעכב GSK3a/b המגרה השראת מזודרם) ו-BMP-4 (30 ננוגרם/מ"ל, מפעיל MSX2 המשרה שושלת מזודרם).
הערה: מלאי (ChiR): 10 mM (השתמש 1:833, או 1.2 μL/mL N2B27). מלאי (BMP-4): 100 מיקרוגרם/מ"ל (שימוש בקנ"מ 1:3333, או 0.3 מיקרוגרם/מ"ל N2B27) (ראה טבלת חומרים).
- תוספת N2B27 בינונית עם ChiR (12 מיקרומטר, מעכב GSK3a/b המגרה השראת מזודרם) ו-BMP-4 (30 ננוגרם/מ"ל, מפעיל MSX2 המשרה שושלת מזודרם).
- הכינו מדיום אינדוקציה וסקולרית.
- תוסף N2B27 בינוני עם VEGFA (100 ננוגרם/מ"ל) ופורסקולין (2 מיקרומטר) (ראו טבלת חומרים).
- הכן את המטריצה החוץ תאית (ECM).
- השתמש 1 מ"ל של ECM עבור באר אחת של צלחת 12 בארות (עבור הטבעה 30-50 אגרגטים). מתוך 1 מ"ל של פתרון ECM המשמש עבור כל באר, השתמש 0.5 מ"ל כדי ליצור שכבה תחתונה, "שכבה 1", אשר תשמש בסיס ECM, ו 0.5 מ"ל בתוספת אגרגטים עבור השכבה העליונה, "שכבה 2". שימוש בגישה זו מספק, באמצעות מתלה ECM, מספיק מקום ותמיכה לרשתות כלי הדם האנושיים לנבוט לכל הכיוונים.
הערה: בסך הכל, 1 מ"ל של ECM מכיל 500 מיקרוליטר של קולגן בקר מטוהר מסוג I, 250 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף מסיסה המופרשת על ידי תאי סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (ראה טבלת חומרים), ו- 250 μL של תמיסת מטריצה בסיסית (שלב 1.5.2). הכינו אותו טרי ושמרו על קרח עד שהוא מוכן לשימוש. - כדי להכין את פתרון המטריצה הבסיסית עבור ארבע צלחות 12 בארות (48 בארות), לערבב 5.627 מ"ל של 0.1 N NaOH, 2.498 מ"ל של 10x DMEM, 473 μL של HEPES, 368 μL של 7.5% סודיום ביקרבונט, 233 μL של 200 mM L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד ב 0.85% NaCl, ו 3.451 מ"ל של F-12 של Ham (ראה טבלה של חומרים).
הערה: ניתן למקם את שאריות תמיסת המטריצה הבסיסית בצינור חרוטי פוליפרופילן בעל בהירות גבוהה של 50 מ"ל ולאחסן ב- 4 °C לשימוש למשך עד חודשיים.
- השתמש 1 מ"ל של ECM עבור באר אחת של צלחת 12 בארות (עבור הטבעה 30-50 אגרגטים). מתוך 1 מ"ל של פתרון ECM המשמש עבור כל באר, השתמש 0.5 מ"ל כדי ליצור שכבה תחתונה, "שכבה 1", אשר תשמש בסיס ECM, ו 0.5 מ"ל בתוספת אגרגטים עבור השכבה העליונה, "שכבה 2". שימוש בגישה זו מספק, באמצעות מתלה ECM, מספיק מקום ותמיכה לרשתות כלי הדם האנושיים לנבוט לכל הכיוונים.
- מכינים את אמצעי ההנבטה.
- נוסחה ספציפית של 50 מ"ל של מדיום גמיש ללא סרום (SFM) לתמיכה בהתפתחות תאים המטופויטיים אנושיים, אליציטוט של 1.3 מ"ל של תוסף מזין בינוני גמיש ללא סרום, 15% סרום בקר עוברי (FBS), 250 מיקרוליטר של פניצילין-סטרפטומיצין, 500 מיקרוליטר של 200 מילימטר L-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד ב-0.85% NaCl, VEGFA (100 ננוגרם/מ"ל) ו-FGF2 (100 ננוגרם/מ"ל) (ראה טבלת חומרים).
- הכן את מאגר החסימה.
- יש לערבב 0.5 גרם אלבומין בסרום בקר, 1.5 מ"ל של סרום בקר עוברי, 250 מיקרוליטר של טווין 20, 250 מיקרוליטר של טריטון X-100, 500 מיקרוליטר נתרן דאוקסיכולאט (1% wt/vol מלאי), ו-47.5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x (ראה טבלת חומרים). פיפטה למעלה ולמטה עד שכל הרכיבים משולבים היטב והפתרון ברור.
2. תחזוקה ותרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים ומושרים אנושיים
- בצע תרבית תאים באמצעות מטריצת קרום מרתף ללא LDEV מופחתת גורם גדילה (דילול 1:50) - מצופה 6 צלחות תרבית רקמה עם מדיום תרבית תאי גזע (ראה טבלת חומרים).
- ברגע שהתאים מגיעים למפגש ~70%, מעבירים אותם באמצעות 1 מ"ל של אנזים ניתוק תאי יונקים (ראה טבלת חומרים) למשך 3-4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: פיצול התאים ביחס של 1:6 משפר את יכולת הקיום של התא ומשיג מפגש תוך 2-4 ימים עבור רוב קווי תאי הגזע האנושיים. כדי להגדיל את יכולת הקיום של התא, מעכב ROCK Y-27632-בתוספת (10 mM, 1:1,000) מדיום תרבית משמש 24 שעות לאחר המעבר. - שנו את מדיום התרבות מדי יום עד שמגיעים למפגש של 70%.
הערה: במחקר הנוכחי, במפגש של 70%, באר אחת של צלחת תרבית תאים בעלת 6 בארות מכילה כמיליון H9 hPSCs.
3. יום 0 - יצירת אגרגטים פלוריפוטנטיים מתרחיף חד-תאי
הערה: מפגש של 70% בשתי בארות של צלחת תרבית של 6 בארות יניב כ -175 hBVOs.
- באמצעות פיפטה או מערכת ואקום, לשאוף את מדיום התרבית, להחליף אותו עם 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא (ראה טבלה של חומרים), לדגור במשך 5 דקות ב 37 ° C.
- בזמן שהתאים נמצאים תחת מגיב הדיסוציאציה של התא, הכינו את הנפח הדרוש של תווך הצבירה (שלב 1.1) בצינור חרוטי של 15 מ"ל לפי הצורך למספר הבארות הרצוי בלוח תרבית התקשרות 6 בארות נמוך במיוחד (ראו טבלת חומרים).
- לשאוף את 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא, ולהשעות את התאים ב 1 מ"ל של מדיום צבירה. צור תרחיף חד-תאי עם צנרת עדינה מעלה-מטה לפני ספירת הדגימות.
זהירות: hPSCs רגישים למדי ללחץ מכני ואינם יכולים לסבול פיפטינג אגרסיבי. - ספור את התאים באמצעות מכשיר ספירת תאים אוטומטי10 או מערכת מתוקננת תחת מיקרוסקופ. חשב את מספר התא הדרוש לניסוי.
הערה: בהתאם לקו התא, 200,000 תאים/באר עד 300,000 תאים/באר נחשבים אידיאליים להיווצרות צבירה (כלומר, 4 בארות = 800,000 עד 1,200,000 תאים בסך הכל). - הוסף את הנפח המתאים של תרחיף התא למדיום הצבירה בצינור חרוטי פוליפרופילן בבהירות גבוהה של 15 מ"ל. מרפטים בעדינות את תרחיף התא המדולל מעלה ומטה כדי להבטיח פיזור תאים הומוגני.
- פיפטה 3 מ"ל של תרחיף התא המדולל לכל באר רצויה של צלחת תרבית חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד.
- מניחים את הצלחת באינקובטור (37°C, 5% CO2, >90% לחות), והימנעו ככל האפשר מפתיחה וסגירה של דלתות האינקובטור.
הערה: שלב ראשוני זה מומלץ להשלים בשעות הערב או במהלך תנועת אינקובטור נמוכה. אפילו תנודות קלות יכולות להשפיע על גודל וצורת האגרגטים, מה שעלול לפגוע בתוצאות.
4. יום 1 - השראת מזודרם של אגרגטים
- ודא כי 24 שעות לאחר הזריעה, אגרגטים קטנים הכוללים 2-10 תאים נראים תחת המיקרוסקופ. אספו את האגרגטים, ואפשרו להם להתיישב לפני שינוי המדיום למדיום האינדוקציה של מזודרם (שלב 1.3).
- הגדר צינור חרוטי פוליפרופילן אחד בבהירות גבוהה של 15 מ"ל לכל באר של צלחת תרבית חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד.
- השתמש בתנועה מעגלית (כלומר, כמו שייקר מסלולי) כדי לאסוף את האגרגטים במרכז כל באר, השתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי לאסוף בעדינות את האגרגטים ואת התווך שמסביב מכל באר, מקם אותם בתוך צינורות חרוטי פוליפרופילן בבהירות גבוהה המתאימים להם 15 מ"ל, ולאפשר לאגרגטים לשקוע בטמפרטורת החדר.
- לאחר האיסוף, הגדר טיימר למשך שעה אחת, שהוא הזמן הדרוש לרוב קווי התא / אגרגטים למשקעים בשלב זה.
הערה: אם הזמן הוא פחות מ 1 שעות, אחד עלול לאבד את כל האגרגטים שאולי לא התיישבו לתחתית הצינור החרוטי 15 מ"ל. - לאחר שחלפה השעה, בזהירות, שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה או משאבה בעלת רגישות גבוהה. ודא שהאגרגטים נשארים ללא הפרעה בתחתית הצינור החרוטי 15 מ"ל.
- השהה מחדש את האגרגטים של כל צינור חרוטי 15 מ"ל ב -2 מ"ל של מדיום אינדוקציה מזודרם, והחזיר אותם לבארות המתאימות שלהם של צלחת תרבית ההתקשרות האולטרה-נמוכה של 6 בארות.
- מחזירים את הצלחת לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס), ומשאירים אותה עד היום הרביעי.
הערה: אם האגרגטים מתחברים וגדלים זה על זה או אחד לתוך השני, באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, יש לפיפטה עדינה של כל באר של אגרגטים למעלה ולמטה פעם ביום כדי לשמור על גודל דומה של האגרגטים.
5. יום 4 - אינדוקציה וסקולרית ופרימינג של האגרגטים
- אספו את האגרגטים, ואפשרו להם להתיישב לפני שינוי המדיום למדיום השראת כלי הדם (שלב 1.4).
- הגדר צינור חרוטי אחד של 15 מ"ל לכל באר של צלחת תרבית חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד.
- השתמש בתנועה מעגלית (כלומר, כמו שייקר מסלולי) כדי לאסוף את האגרגטים במרכז כל באר, השתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי לאסוף בעדינות את האגרגטים ואת התווך שמסביב מכל באר, ומקם אותם בתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל המתאימים להם.
- לאחר האיסוף, כוונו טיימר למשך 30 דקות כדי לאפשר לצברים לשקוע.
הערה: נדרש זמן של 30 דקות עבור רוב קווי התאים בשלב זה. אם הזמן הוא פחות מ -30 דקות, קיים סיכון לאבד את כל האגרגטים שאולי לא התיישבו לתחתית הצינור החרוטי 15 מ"ל. - לאחר 30 דקות, בזהירות, שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה או משאבה בעלת רגישות גבוהה. ודא שהאגרגטים נשארים ללא הפרעה בתחתית הצינור החרוטי 15 מ"ל.
- השהה מחדש את האגרגטים של כל צינור חרוטי 15 מ"ל ב -2 מ"ל של תווך השראת כלי דם, והחזיר אותם לבארות שלהם בהתאמה של צלחת תרבית החיבור 6 בארות נמוכה במיוחד.
- מחזירים את הצלחת לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס), ומשאירים אותה עד יום 6.
הערה: באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, יש לפיפטה עדינה של כל באר אגרגטים למעלה ולמטה פעם ביום כדי לשמור על גודל דומה של האגרגטים ולמנוע מהם לגדול או להיצמד זה לזה.
6. יום 6 - הטבעה מצטברת והשראת נבטי כלי שיט
- תוך כדי עבודה על קרח, הכן את הנפח הסופי הרצוי של פתרון ECM (שלב 1.5).
הערה: להלן פרוטוקול עבור באר אחת של צלחת 12 בארות (30-50 אגרגטים), אשר ניתן להתאים לפי הצורך.- עבור באר אחת של צלחת 12 בארות, להחיל 0.5 מ"ל של ECM כמו השכבה התחתונה, ולהשתמש 0.5 מ"ל של ECM בתוספת אגרגטים על השכבה העליונה. זה יוצר את "סנדוויץ'" ECM הדרוש להנבטה מצטברת תלת ממדית יעילה.
- פיפטה 500 μL של ECM לתוך באר אחת של צלחת 12 בארות. יש לוודא שלא נוצרות בועות והמניסקוס התחתון והצדדי מצופים לחלוטין. זה כולל שכבה 1 של כריך ECM.
- החזירו את הצלחת לטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.
הערה: זמן של שעתיים הכרחי לפילמור יעיל. כל זמן קצר יותר עלול לסכן את תקינות ה-ECM. - לקראת סוף פילמור שכבה 1, השתמשו בתנועה מעגלית כדי לאסוף את האגרגטים במרכז כל באר, השתמשו בפיפטה של 1 מ"ל כדי לאסוף בעדינות את האגרגטים ואת התווך שמסביב מכל באר, והניחו אותם בצינורות החרוטיים המתאימים להם בנפח 15 מ"ל.
- הניחו לצברים להסתפק ב-10-15 דקות, ושאפו את הסופרנטנט.
- מניחים את האגרגטים בצינור החרוטי 15 מ"ל על קרח למשך 5 דקות. בזמן הקירור, הוציאו את הצלחת בעלת 12 הקידוחים עם שכבה 1 הפולימרית מהאינקובטור.
הערה: קירור האגרגטים מסייע במניעת פילמור מוקדם של ECM שכבה 2. - עבודה מהירה וזהירה למניעת היווצרות בועות, להשעות מחדש את האגרגטים ב 500 μL של ECM, ו pipette את המתלה ECM אגרגטים על גבי שכבה 1 כבר פולימרי. היזהרו שלא לגעת בשכבה 1, השתמשו בקצה פיפטה של 200 μL כדי לפזר בעדינות את שכבה 2 ואת האגרגטים סביב הבאר.
- החזירו את הצלחת לטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.
הערה: זמן דגירה של שעתיים הכרחי לפילמור ECM יעיל. כל זמן קצר יותר עלול לסכן את שלמות ה-ECM ועלול למנוע הידבקות חזקה בין שכבה 1 לשכבה 2. - הוסף 1 מ"ל של מדיום הנבטה שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) (שלב 1.6) כדי לגרום להתמיינות כלי הדם. כלי הנבטה חייבים להופיע יום עד שלושה ימים לאחר ההטבעה. שנה את המדיום לאחר 3 ימים ולאחר מכן פעם ביומיים.
הערה: יש לחמם מראש את מדיום הנבטה; אחרת, עלולה להתרחש היפרדות שכבות, ותקינות ה-ECM עלולה להיות מושפעת.
7. יום 11 - בידוד והבשלה של כ"ד
- עבודה בתנאים סטריליים, השתמש בקצה המעוגל של מרית סטרילית כדי לשחרר את מטריצת הנבטת ECM המכילה את רשתות כלי הדם. בשלב זה, הג'ל חייב להידמות לדיסק צף חופשי.
- בעזרת מלקחיים סטריליים וקצה מעוגל של מרית סטרילית, מעבירים בזהירות את דיסק הג'ל (כולל רשתות כלי הדם) למכסה של צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ.
- הניחו את המכסה בתוספת ג'ל תחת סטריאומיקרוסקופ המותאם להגדלה ולמיקוד הרצויים, והשתמשו במחטים סטריליות כדי לחתוך רשתות כלי דם בודדים, בניסיון להגביל את כמות ה- ECM הלא וסקולרי המתקבל בתהליך.
הערה: התאים מפרקים באופן טבעי את ה-ECM שמסביב לאורך זמן; עם זאת, הפחתת הכמות שנחתכה עם כל אורגנואיד מגדילה את איכות התמונה ואת שלמות רשת כלי השיט העצמאי. - לאחר שכל האורגנואידים בודדו מהג'ל, העבירו אותם בעדינות חזרה לבאר אחת של צלחת 6 בארות חיבור נמוכה במיוחד עם 3 מ"ל של מדיום הנבטה. בשלב זה, ניתן להשאיר את האורגנואידים למשך הלילה, או להמשיך מיד לשלב 7.4.
- השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי להעביר אורגנואידים בודדים מן צלחת 6 בארות אל הבארות של צלחת חיבור נמוך במיוחד 96 בארות. לאחר ההעברה, להוסיף 200 μL של חומם מראש (37 ° C) נובט בינוני לכל באר של צלחת 96 באר.
הערה: באר אחת של אורגנואידים וסקולריים מצלחת של 12 בארות חייבת למלא 30-40 בארות של צלחת של 96 בארות. - 4-6 ימים לאחר הבידוד בצלחות 96 בארות, יש לוודא כי האורגנואידים בעלי מורפולוגיה עגולה ובריאה. בשלב זה, האורגנואידים מוכנים לתיקון ומוכנים להכתמה.
8. יום 15 - קיבוע, חסימה והכתמה של כ"ד
- באמצעות קצה לחתוך 1 מ"ל, להעביר את האורגנואידים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- היזהר כדי למנוע את השאיפה של כל BVOs, להשתמש פיפטה 200 μL או 1,000 μL כדי להסיר את המדיום הנבטה הנותר בצינור microcentrifuge, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 4% PFA ב PBS במשך 1 שעות.
הערה: מומלץ לבצע קיבוע על שייקר אורביטלי (125 סל"ד) בטמפרטורת החדר. מקסימום 60 BVOs/צינור מיקרוצנטריפוגה מקובל. כל BVOs נוספים יפגעו ביעילות הקיבוע והשטיפה.
אזהרה: PFA הוא כימיקל מזיק. יש להשתמש בו בזהירות במכסה אדים, ולעקוב אחר הוראות היצרן לשימוש ושיטות סילוק מתאימות. - שטפו את ה-BVOs החדשים שתוקנו 3 פעמים למשך 15 דקות בכל פעם עם 0.25% PBS-Tween.
- אם קוטר האורגנואידים גדול מ-1 מ"מ, יש לחדור ל-BVOs עם 1% Triton X-100 ב-PBS למשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את כל PBS-Tween של 0.25%, והוסיפו 1 מ"ל של מאגר חסימה (שלב 1.7).
הערה: למרות שזה תלוי נוגדנים, 2 שעות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי (125 סל"ד) מספיקות כדי להפחית קשירת נוגדנים לא ספציפיים במהלך תהליך הצביעה. ניתן להשאיר את האורגנואידים במאגר החוסם בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. - הסר את המאגר החוסם, והוסף את הנוגדן הראשי (1:100) מדולל ב- 1 מ"ל של המאגר החוסם. יש לשמור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C על שייקר אורביטלי (12 סל"ד), כדי להבטיח שהאורגנואידים יישארו שקועים בתמיסת הנוגדנים העיקרית.
הערה: דגירה ראשונית של נוגדנים במהלך הלילה מתאימה לנוגדנים המשמשים למחקר זה. הנוגדנים הראשוניים והמשניים הדרושים והדילולים המתאימים שלהם מסופקים בטבלת החומרים. - לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים במהלך הלילה, יש להסיר את תמיסת הנוגדנים הראשונית ולשטוף 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם עם 0.25% PBS-Tween.
- הוסיפו את הנוגדן המשני (1:250) בתוספת DAPI (1:1,000) מדולל ב-1 מ"ל של חיץ חוסם, ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או ב-4°C למשך הלילה.
הערה: אם הדגימות מוכנות כראוי (כמתואר לעיל), דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה מתאימה לנוגדנים המשמשים במחקר הנוכחי. - לאחר הדגירה, יש להסיר את תמיסת הנוגדנים המשנית ולשטוף 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם עם 0.25% PBS-Tween.
הערה: לאחר הצביעה, ניתן לשמור את האורגנואידים ב-PBS עד שבועיים.
9. הרכבה של אורגנואידים של כלי הדם (BVOs)
- הדביקו ספייסרים להרכבה על כיסויי ההדמיה הרצויים (ראו טבלת חומרים).
- בעזרת קצה פיפטה חתוך בקוטר 1 מ"מ, השתמשו בפיפטה בנפח 1 מ"ל כדי להעביר אורגנואידים בודדים לבארות הספייסר, ושאפו את ה-PBS הנותר.
- ממלאים את הבאר ב-150-200 מיקרוליטר של תמיסת ניקוי (ראו טבלת חומרים) מחוממת ל-75°C, תוך טבילה מלאה של האורגנואיד.
הערה: הדגימות צריכות להתבהר תוך שעה אחת מהחשיפה לתמיסת הניקוי המחוממת.- השאירו את האורגנואידים להתבהר בקופסה מכוסה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות עד לילה אם זמן הניקוי של שעה אינו מספיק. אם אתם משאירים את הדגימה למשך הלילה, ודאו שיש לה מספיק תמיסת ניקוי כדי למנוע התייבשות.
- לאחר הניקוי, שאפו בזהירות את פתרון הסליקה עם קצה פיפטה 100-200 μL. תמרנו בעדינות את האורגנואיד למרכז הספייסר היטב, והוסיפו טיפות ג'ל הרכבה (ראו טבלת חומרים) (מחומם ל-75 מעלות צלזיוס בבלוק חימום מבוקר) עד שהבאר מלאה.
- הניחו בעדינות את הכיסוי השני על גבי מרווח ההרכבה כדי לאטום את הדגימות ברווח שבין המכסה התחתון לעליון. תן ג'ל הרכבה לרפא בחושך ב 4 ° C במשך הלילה.
הערה: לאחר הריפוי, ניתן להשתמש בלק עליון כדי לאטום עוד יותר את הדגימות המותקנות.
Representative Results
השלבים המתוארים בפרוטוקול זה פותחו במיוחד כדי להניב שיטה מבוקרת ומדויקת ליצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע גזעיים (hPSC). יצירת אגרגטים בקוטר 30-100 מיקרומטר מתרביות hPSC מסמנת את נקודת ההתחלה של הפרוטוקול (איור 1, איור 2B). הצברים מובלים דרך אינדוקציות הדרגתיות לכיוון מזודרם (יום 1-יום 4) ושושלות כלי דם (יום 4-יום 6) לפני הטבעה (יום 6) (איור 2A-D), אשר הכרחי להיווצרות רשת כלי שיט. הנבטת כלי דם כמעט רדיאלית סימטרית חייבת להיראות על-ידי d7 או d8 (איור 2E) ולהמשיך דרך d10 (איור 2F,G). העברת ה-hBVOs מה-ECM ללוחות החיבור האולטרה-נמוכים של 96 בארות מפחיתה את השבריריות של רשתות ההנבטה ומאפשרת תחזוקה מתמשכת בתנאי תרבית מתלה (איור 2H) למשך עד 6 חודשים. עד d15, hBVOs מציגים רשת אנדותל נרחבת ומחוברת (CD31+) המוקפת בפריציטים (PDGFR-ß+) ואקטין שרירים חלקים (SMA+) (איור 3A-D). קרום מרתף רציף של קולגן IV (ColIV+) עוטף את רשתות כלי הדם (איור 3E). תאי אנדותל (CD31+, VE-Cadherin+) ופריציטים (PDGFR-ß+) מהווים כ-30%-35% ו-60%-65% מאוכלוסיות התאים האורגנואידים, בהתאמה8. ההנבטה הפעילה של כלי הדם מתרחשת בהנחיית אוכלוסיית תאי קצה מאורגנים אנדוגנית (CD31+) המציגה מורפולוגיה טיפוסית של תאי חוד, כגון פיליפודיה מוגזמת 8,10. ניתן לראות את ההצגה של תאי ציור קיר PDGFR-ß+ ו-SMA+ העוטפים את רשתות כלי האנדותל על-ידי d15 של תהליך ההבשלה האורגנואידי (איור 3A,C). לאחר הסרה מה-ECM והבשלה בתרבית ההשעיה (כלומר, d15), hBVOs ניתנים לניתוח או השתלה בהתאמה מתחת לכמוסת הכליה של העכבר.
איור 1: סכמה של פרוטוקול hBVO המדגישה את העיתוי ואת ההתקדמות בשלבים. מתרביות hPSC או hiPSC הומוגניות לכאורה, היווצרות מצטברת מתרחשת בנוכחות מעכב רו-קינאז Y27632. BMP4 ו CHiR תוספת מדיום משמש כדי להנחות את האגרגטים לקראת גורל mesodermal. מדיום השראת מזודרם מוחלף על ידי VEGFA ומדיום בתוספת פורסקולין כדי לעורר את האגרגטים לעבר שושלת כלי דם. תורים מכניים וכימיים המושגים באמצעות הטבעה של האגרגטים במטריצת קולגן I וקרום מרתף מסיס וחשיפה לתווך המכיל VEGFA ו- FGF2 גורמים להנבטת כלי דם כמעט רדיאלית סימטרית מגוף הצבירה. ניתן להסיר את רשתות כלי הדם שנוצרו מקולגן I ומממברנת המרתף המסיסה, ולהכניס אותן לתרבית תרחיף לצורך הבשלה נוספת, ניתוח או השתלה in vivo. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התקדמות הדרגתית של דור hBVO שנלכד תחת שדה בהיר. (A) מורפולוגיה אופיינית של מושבות hPSC (H9) ביום -1. (B) יצירת אגרגטים hPSC (יום 0) על לוחות חיבור אולטרה-נמוכים של 6 בארות בנוכחות Y-27632. (C) השראת מזודרמיס של אגרגטים באמצעות BMP4 ותוספת ChiR (יום 1). ניתן להבחין גם בשינויים עדינים בגודל המצטבר ובצורה המצטברת. (D) יום 4 אגרגטים דרוכים לקראת שושלת כלי דם באמצעות VEGFA ותוספת פורסקולין. (E) הנבטת כלי דם מוקדמת ביום 7, יום לאחר הטמעת האגרגטים במטריצת ההנבטה וחשיפה למדיום הנבטה בתוספת VEGFA ו-FGF2 (יום 7). (F) מורפולוגיה אורגנואידית בריאה והמשך הנבטת כלי הדם ביום ה-9. (ז) כלי בשלב מאוחר הנובט ביום ה-10. באופן אידיאלי, מבני התאים הצפופים במרכז האורגנואידים נעלמו בשלב זה. (H) מורפולוגיה אופיינית של אורגנואידים בוגרים (יום 15) של כלי דם אנושיים. הסרת המטריצה שמסביב על ידי חיתוך והבשלה בלוחות תרבית 96 בארות חיבור נמוכים במיוחד מעצבת את האורגנואידים בצורה כדורית, כאשר רשתות הכלים שוכנות פנימיות. פסי קנה מידה: (A,B,E,F) 250 מיקרומטר; (C,D) 500 מיקרומטר; (G,H) 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צביעה מלאה של אורגנואידים בוגרים (יום 15) של כלי דם אנושיים. (A) הצגה של אורגנואידים בוגרים (יום 15) של כלי דם אנושיים עם רשתות אנדותל מאורגנות (CD31+, מגנטה) וכיסוי פריציטים (PDGFR-β+, ציאן) ואקטין שריר חלק אלפא (SMA+, צהוב). (B) הגדלה גבוהה יותר של A המפרטת את הביטוי SMA+ (צהוב) ו- PDGFR-β+ (ציאן) של רשתות כלי השיט. (C) הצגה מפורטת של אינטראקציית אנדותל (CD31+, מגנטה), פריציט (PDGFR-β+, ציאן) ואקטין שריר חלק אלפא (SMA+, צהוב). (D) צביעה מלאה של כלי הדם אנדותל (CD31+, מגנטה)-שריר חלק (SMA+, צהוב) בחתך רוחב (משמאל) והגדלה גבוהה יותר (מימין) של אורגנואידים של כלי דם בוגרים. (E) היווצרות מכוונת עצמית של קרום מרתף כלי דם (Col IV+, גווני אפור) באמצעות הקשר הקרוב של תאי הקיר וצינורות האנדותל. פסי קנה מידה: (A,D [משמאל]) 100 מיקרומטר; (B,D[מימין],E) 25 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פריצות דרך אחרונות בתרביות אורגנואידים שמקורם בתאי גזע סיפקו את המסגרת למודלים מתקדמים יותר ורלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של כלי הדם האנושיים. מודל אורגנואיד כלי הדם האנושי (hBVO) המוצג כאן, שפותח במעבדהשלנו 8,10, מספק אמצעי רב עוצמה לחקור לא רק היבטים נוספים של כלי הדם האנושיים, אלא גם דרכים חדשות של מודלים של מחלות וטיפול רגנרטיבי 8,10,11. מודלים מרובים in vivo שימשו כדי לחקור את ההתפתחות וההבשלה של כלי דם, מחלות כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל 3,4. גישות שונות משלבות תאים בודדים ומרובים המוגדרים על ידי שושלת שמקורם בתאי גזע או מבודדים מרקמות בוגרות in vivo כדי ליצור רשתות כלי דם אנושיות משוכפלות 5,6. הפרוטוקול המוצג כאן ממנף את עקרון הביולוגיה ההתפתחותית והארגון העצמי כדי להניב את השושלת הרב-תאית הראשונה אי פעם של רשתות כלי דם אנושיות שניתן ליצור, למעשה, מ-hPSC 8,10 יחיד.
לכל קו תאי גזע יש מטען גנטי ייחודי והוא שונה מאחרים מבחינת המקור שלו, תפקודו והיענותו15. לכן, הפרוטוקול עבור אורגנואידים של כלי דם אנושיים (hBVOs) פותח ועבר אופטימיזציה כדי להבטיח תאימות פרוטוקול חזקה וניתנת לשחזור עם מספר (>12) קווי hPSC שונים 8,10. השיטה המתוארת כאן מייצרת אורגנואידים של כלי דם שמקורם ב-hPSC במשך שבועיים. עם זאת, שינויים בהרכב המדיה או בטכניקות ביצירת hBVO עלולים להוביל ליצירת רשת כלי דם ואורגנואידים לא יעילה. שיעורי ההתרבות המשתנים של קווי תאי גזע בודדים משפיעים במידה ניכרת גם על יכולת הרבייה של ניסויים בתאי גזע15, ולכן תרביות אורגנואידים. לדוגמה, ביצירת BVOs, תאים מתרבים יותר או מספרים גבוהים יותר של אגרגטים גדולים של יום 1 כפופים מטבעם לסביבות מטבוליות שונות ולפרמטרים שונים של דיפוזיה של גז וחומרים מזינים. זה, בתורו, משנה את זמני החשיפה לגורם הצמיחה ואת היעילות, את מידת ההתמיינות ואת הפריימינג של כלי הדם, והכי חשוב, את היכולת ליצור רשתות כלי דם עם הטמעת האגרגטים בקולגן 1 ובמטריצת קרום המרתף המסיס.
הדיפוזיה הפסיבית של חמצן וניהול חומרים מזינים חיוניים מסביבה חיצונית אינה אידיאלית לצמיחת תאים לטווח ארוך של אורגנואידים תלת-ממדיים ומורפוגנזה של רקמות במבחנה16. למרות שהדבר תלוי במספר גורמים (כלומר, קצב חילוף החומרים של הרקמות, הזמינות הביולוגית של חומרי המזון והגזים, סביבה סטטית או דינמית), נקבעה מגבלת דיפוזיה כללית של 150 מיקרומטר O2 וחומרים מזינים עבור רקמות בתרבית במבחנה, בהתחשב בכך שמבחינה פיזיולוגית, רקמות אנושיות מציגות חבלים של תאים חיים בטווח של 150 מיקרומטר מכלי דם מחוררים17. למרות שמרחקי דיפוזיה יעילים של גז וחומרים מזינים של 70-200 מיקרומטר הוצעו גם 18,19,20,21, צפיפות המבנה, הטמפרטורה, ה- pH והרכב המדיה משפיעים באופן משמעותי על יעילות הדיפוזיה. הודות לאופטימיזציה של שטח הפנים ותקשורת קולטני אינטגרין-בטא לאחר יום 6 הטבעה, אגרגטים בקוטר 250-300 מיקרומטר מתפקדים טוב יותר מאלו בקוטר >500-600 מיקרומטר, וכתוצאה מכך תהליך הנבטת כלי דם שלם וליבת אורגנואיד מעובה מינימלית. לפיכך, גודל הצבירה הוא קריטי ויכול להיות מושפע הן ממספר התאים המשמשים במהלך הזריעה הראשונית והן מהזמן המוקצב להיווצרות הצבירה. לוחות מיקרווול המאפשרים שליטה על גודל הצבר והמספר22 הם חלופה בת קיימא לטכניקת היווצרות האגרגטים הסטוכסטית הנובעת משימוש בלוחות חיבור 6 בארות נמוכים במיוחד בפרוטוקול זה. עקביות בתזמון ובניהול הגדלים המצטברים במהלך 6 הימים הראשונים של פרוטוקול hBVO היא אחד האינדיקטורים המכריעים, אם לא החשוב ביותר, לפיתוח מוצלח של אורגנואידים של כלי דם בתום לב.
יש להשלים שינויים בינוניים ביום 1 (השראת מזודרם) וביום 4 (השראת כלי דם) בשילוב עם שיקוע האגרגטים. למרות שצנטריפוגה היא חלופה מפתה, הכוחות הנוספים המופעלים על האגרטים החלשים עלולים לגרום לגושים, הרכבה וגזירה לא רצויים, המשפיעים לרעה על הדיפרנציאציה, ההתבגרות ויעילות ההנבטה בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול. עבודה על קרח במהלך היום 6 תהליך הטבעה הוא קריטי לשמירה על פילמור ECM תקין והיווצרות שכבות. במהלך השראת ההטבעה וההנבטה של האגרגטים, חשיפת ה-ECM לטמפרטורות מעל 4°C ו/או ECM pH שאינו 7.4 תשפיע לא רק על שיעורי הפילמור ושלמות שכבת ה-ECM אלא גם על יעילות ההנבטה של האגרגטים המשובצים. האופי האלסטי של מטריצת הנבטת ECM מאפשר ניתוק והובלה קלים מצלחת התרבית בת 12 הקידוחים למשטח החיתוך הסטרילי. אורגנואידים בודדים שהוסרו מהמטריצה והועברו ללוחות 96 בארות חיבור נמוכים במיוחד יצרכו את שארית ה- ECM שמסביב וישמרו על רשתות מיקרו-כלי אנדותל מצופים תאי קיר מאורגנים עם קרום מרתף רציף.
אמנם לא מכוסה בהצעה זו, שינויים בהרכבי התקשורת יכולים לשכפל מחלות אשר, בתורו, לעורר תגובות פתולוגיות hBVOs 8,11. גבולות מידול מחלות באמצעות מערכת hBVO רחוקים מלהיות ידועים, וזה בהחלט תחום שצריך לחקור. היישום של טכנולוגיית אורגנואיד כלי הדם שלנו בכלי הדם של מבנים אורגנואידים אווסקולריים בעבר23 הוא גם בעל השפעה ועניין משמעותיים.
Disclosures
אין קשר בין האינטרסים הכספיים של המחברים לבין המחקר המוצג. טכנולוגיית אורגנואיד כלי הדם קיבלה רישיון מחברת Stemcell Technologies. J.M.P. היא מייסדת ובעלת מניות בחברת Angios Biotech המפתחת אורגנואידים של כלי דם כטיפול בהשתלת כלי דם. בקשת פטנט הקשורה לעבודה זו הוגשה תחת פטנט לא. US20200199541A1, ומנה את ריינר א. וימר, יוזף מ. פנינגר ודונצ'ו קריאשקי כממציאים.
Acknowledgments
אנו מודים לכל חברי המעבדות שלנו על הקלט והדיונים הקריטיים. JMP קיבל מימון מקרן T. von Zastrow, פרס FWF Wittgenstein (Z 271-B19), האקדמיה האוסטרית למדעים, Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) תחת הסכם מענק מס '101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program ותוכנית 150 קתדרות המחקר של קנדה F18-01336 וכן מענקי COVID-19 של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות F20-02343 ו- F20-02015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
| 7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
| Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
| Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
| Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
| Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
| Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
| BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
| CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
| CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
| Cellulose wipes | |||
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
| CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
| Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
| Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
| Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | |||
| Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
| Eppendorf tubes | |||
| Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
| Fine forceps | FST | 11254-20 | |
| Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
| Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
| Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
| KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
| PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
| PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
| Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
| PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
| RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
| Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
| SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
| Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
| Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
| Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
| StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
| Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
| Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
| Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 |
References
- Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
- Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
- Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
- Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581 (2018).
- Risau, W.
- Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
- Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).
- Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
- Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
- Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
- Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846 (2014).
- Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
- McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
- McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
- Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
- Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
- Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).
- Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707 (2022).
