Summary
Denne protokol beskriver dannelsen af selvorganiserende blodkar fra humane pluripotente og inducerede pluripotente stamceller. Disse blodkarnetværk udviser et omfattende og forbundet endotelnetværk omgivet af pericytter, glat muskelaktin og en kontinuerlig kældermembran.
Abstract
En organoid defineres som et konstrueret multicellulært in vitro-væv , der efterligner dets tilsvarende in vivo-organ , så det kan bruges til at studere definerede aspekter af dette organ i en vævskulturskål. Bredden og anvendelsen af human pluripotent stamcelle (hPSC) -afledt organoidforskning er avanceret betydeligt til at omfatte hjernen, nethinden, tårekanalen, hjerte, lunge, tarm, bugspytkirtel, nyre og blodkar blandt flere andre væv. Udviklingen af metoder til generering af humane mikrokar specifikt har åbnet vejen for modellering af udvikling af menneskelige blodkar og sygdom in vitro og til test og analyse af nye lægemidler eller vævstropisme i virusinfektioner, herunder SARS-CoV-2. Komplekse og langvarige protokoller, der mangler visuel vejledning, hæmmer reproducerbarheden af mange stamcelleafledte organoider. Derudover nødvendiggør den iboende stokasticitet af organoiddannelsesprocesser og selvorganisering generering af optiske protokoller for at fremme forståelsen af erhvervelse og programmering af celleskæbne. Her præsenteres en visuelt guidet protokol til generering af 3D humane blodkarorganoider (BVO'er) konstrueret fra hPSC'er. Ved at præsentere en kontinuerlig kældermembran, vaskulære endotelceller og organiseret artikulation med vægmalericeller udviser BVO'er de funktionelle, morfologiske og molekylære træk ved human mikrovaskulatur. BVO-dannelse initieres gennem samlet dannelse efterfulgt af mesoderm og vaskulær induktion. Vaskulær modning og netværksdannelse initieres og understøttes ved indlejring af aggregater i en 3D-kollagen og opløselig kældermembranmatrix. Menneskelige fartøjsnetværk dannes inden for 2-3 uger og kan dyrkes yderligere i skalerbare kultursystemer. Det er vigtigt, at BVO'er transplanteres til immunkompromitterede mus anastomose med den endogene musecirkulation og specificerer i funktionelle arterier, vener og arterioler. Den nuværende visuelt styrede protokol vil fremme human organoid forskning, især i forhold til blodkar i normal udvikling, vævsvaskularisering og sygdom.
Introduction
Vaskulær dysfunktion og blodkarsygdomme til stede med markante komplikationer i organfunktioner. Hjerte-kar-sygdomme (CVD) er den største dødsårsag på verdensplan1 og er også den primære medvirkende faktor til stigende sundhedsomkostninger i USA. Antallet af CVD-tilfælde stiger årligt, og et stigende antal af disse tilfælde forekommer i yngre aldersgrupper (20-45 år)2. Flere in vivo-modeller er blevet udviklet til at undersøge udviklingen og modningen af blodkar, vaskulær sygdom og endoteldysfunktion 3,4. I øjeblikket kan metoder, der kombinerer enkelt- og multiple afstamningsdefinerede celler, enten afledt af stamceller eller isoleret fra voksent væv in vivo, skabe vaskulære netværk, der replikerer aspekter af human vaskulær funktion og anatomi 5,6. Blodkar er opstået som et af de første funktionelle systemer under udvikling fra mesodermen, og de organiserer enten gennem en samlingsproces kaldet "vaskulogenese" eller ved udvidelse og forgrening fra allerede eksisterende kar, der kaldes "angiogenese"7.
Ved at udnytte kraften i udviklingsbiologi og selvstyret samling rapporterede Wimmer et al. de første selvorganiserende 3D-humane blodkarorganoider fra hPSC'er, der udviser de funktionelle, morfologiske og molekylære egenskaber ved human mikrovaskulatur8. I lighed med human vaskulatur9 genereres disse hBVOs og er til stede med et endotel, en kontinuerlig kældermembran og omgivende vægmalerier 8,10. HBVOerne kan transplanteres in vivo og anastomoseres med den endogene cirkulation. De kan også gennemgå modning in vitro og tjene som modeller for hjerte-kar-sygdomme (dvs. diabetes)8 eller vævstropisme i virusinfektioner såsom SARS-CoV-211. Mens vi tidligere offentliggjorde en skriftlig protokol10, findes der ingen tilgængelig videoprotokol for denne ellers komplekse teknik.
Gennem en kortfattet trinvis progression opnås hBVO-dannelse gennem aggregeret dannelse, mesoderminduktion ved anvendelse af en WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) og knoglemorfogent protein - 4 (BMP4)12,13, vaskulær induktion via vaskulær endotelvækstfaktor A (VEGFA) og Forskolin (Fors)12 og indlejring i en brugerdefineret spirematrix 8,10. Vaskulær modning og netværksdannelse følger indlejringen af aggregaterne i spirematrixen. Disse menneskelige fartøjsnetværk dannes inden for 2-3 uger og kan fjernes fra spirematrixen og dyrkes yderligere i skalerbare kultursystemer i op til 6 måneder. Her tilvejebringes optisk styrede procedurer til dannelse og anvendelse af human stamcelleafledt vaskulatur.
Protocol
Alle eksperimenter udført heri brugte den kommercielt tilgængelige H9 humane iPSC-linje. Fælles kommercielt og ikke-kommercielt tilgængelige humane pluripotente stamcellelinjer (dvs. H9, NC8) er også blevet testet og vist sig effektive til dannelse af humane blodkarorganoider ved hjælp af denne protokol. For detaljer henvises til vores tidligere offentliggjorte rapporter 8,10.
1. Medie- og reagensformulering til dannelse af humane blodkarorganoider
- Forbered aggregeringsmediet.
- Bland 40 ml knock-out DMEM/F12 (medium med lav osmolalitet uden L-glutamin eller HEPES-buffer optimeret til human ESC- og iPSC-vækst), 10 ml knock-out serum replacer (KOSR), 0,5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, 0,5 ml ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 35 μL beta-mercaptoethanol (BME, 100 μL 2-mercaptoethanol i 10 ml steril PBS), og Y-27632 (cellegennemtrængelig og selektiv hæmmer af Rho-associeret, oprullet spole indeholdende proteinkinase [ROCK]14 [10 mM] ved 1:200) (se materialetabel).
- Forbered N2B27 (N2 og B27 suppleret basismedium).
- Bland 25 ml DMEM / F12, 25 ml neurobasal media, 1 ml B27 supplement, 0,5 ml N2 supplement, 250 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid i 0,85% NaCl og 35 μL beta-mercaptoethanol (se tabel over materialer).
- Forbered mesoderm induktionsmediet.
- Supplement N2B27 medium med ChiR (12 μM, GSK3a / b hæmmer stimulerer mesoderm induktion) og BMP-4 (30 ng / ml, MSX2 aktivator inducerende mesoderm afstamning).
BEMÆRK: Lager (ChiR): 10 mM (brug 1:833 eller 1,2 μL/ml N2B27). Lager (BMP-4): 100 μg/ml (brug 1:3333 eller 0,3 μL/ml N2B27) (se materialetabel).
- Supplement N2B27 medium med ChiR (12 μM, GSK3a / b hæmmer stimulerer mesoderm induktion) og BMP-4 (30 ng / ml, MSX2 aktivator inducerende mesoderm afstamning).
- Forbered vaskulært induktionsmedium.
- Supplement N2B27 medium med VEGFA (100 ng / ml) og forskolin (2 μM) (se tabel over materialer).
- Forbered den ekstracellulære matrix (ECM).
- Brug 1 ml ECM til en brønd i en 12-brøndplade (til indlejring af 30-50 aggregater). Af de 1 ml ECM-opløsning, der anvendes til hver brønd, skal du bruge 0,5 ml til at skabe et bundlag, "lag 1", der fungerer som et ECM-fundament, og 0,5 ml plus aggregater til det øverste lag, "lag 2". Brug af denne tilgang giver gennem ECM-suspensionen tilstrækkelig plads og støtte til, at de menneskelige blodkarnetværk kan spire i alle retninger.
BEMÆRK: Samlet set indeholder 1 ml ECM 500 μL renset bovin kollagen type I, 250 μL opløselig kældermembranmatrix udskilt af Engelbreth-Holm-Swarm musesarkomceller (se materialetabel) og 250 μL basisk matrixopløsning (trin 1.5.2). Forbered det frisk og hold det på is, indtil det er klar til brug. - For at forberede basismatrixopløsningen til fire plader med 12 brønde (48 brønde) blandes 5,627 ml 0,1 N NaOH, 2,498 ml 10x DMEM, 473 μL HEPES, 368 μL 7,5% natriumbicarbonat, 233 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl og 3,451 ml skinkes F-12 (se materialetabel).
BEMÆRK: Den resterende basismatrixopløsning kan placeres i et 50 ml konisk polypropylenrør med høj klarhed og opbevares ved 4 °C til brug i op til 2 måneder.
- Brug 1 ml ECM til en brønd i en 12-brøndplade (til indlejring af 30-50 aggregater). Af de 1 ml ECM-opløsning, der anvendes til hver brønd, skal du bruge 0,5 ml til at skabe et bundlag, "lag 1", der fungerer som et ECM-fundament, og 0,5 ml plus aggregater til det øverste lag, "lag 2". Brug af denne tilgang giver gennem ECM-suspensionen tilstrækkelig plads og støtte til, at de menneskelige blodkarnetværk kan spire i alle retninger.
- Forbered spiremediet.
- Specifikt formulere 50 ml fleksibelt serumfrit medium (SFM) til støtte for udviklingen af humane hæmatopoietiske celler, en 1,3 ml alikvote af det fleksible serumfrie medium næringstilskud, 15% føtalt bovint serum (FBS), 250 μL penicillin-streptomycin, 500 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, VEGFA (100 ng / ml) og FGF2 (100 ng / ml) (se materialetabel).
- Forbered blokeringsbufferen.
- Bland 0,5 g bovin serumalbumin, 1,5 ml føtalt bovin serum, 250 μL Tween 20, 250 μL Triton X-100, 500 μL natriumdeoxycholat (1% vægt/vol stamme) og 47,5 ml 1x fosfatbufret saltvand (se materialetabel). Pipette op og ned, indtil alle komponenter er godt inkorporeret, og løsningen er klar.
2. Vedligeholdelse og dyrkning af humane pluripotente og inducerede pluripotente stamceller
- Udfør cellekultur ved hjælp af LDEV-fri kældermembranmatrix med reduceret vækstfaktor (1:50 fortynding)-belagte 6-brønds vævskulturplader med stamcellekulturmedium (se materialetabel).
- Når cellerne når ~ 70% sammenløb, passerer dem ved hjælp af 1 ml pattedyrcelledissocierende enzym (se materialetabel) i 3-4 minutter ved 37 ° C.
BEMÆRK: Opdeling af cellerne i et forhold på 1: 6 forbedrer cellelevedygtigheden og opnår sammenløb inden for 2-4 dage for de fleste humane stamcellelinjer. For at øge cellelevedygtigheden anvendes ROCK-hæmmer Y-27632-suppleret (10 mM, 1: 1.000) dyrkningsmedium til 24 timer efter passering. - Skift kulturmediet dagligt, indtil en sammenløb på 70% er nået.
BEMÆRK: For den nuværende undersøgelse, ved 70% sammenløb, indeholder en brønd i en 6-brønds cellekulturplade omkring 1 million H9 hPSC'er.
3. Dag 0 - Dannelse af pluripotente aggregater fra en enkeltcellesuspension
BEMÆRK: Et sammenløb på 70% i to brønde i en 6-brønds kulturplade vil give ca. 175 hBVOs.
- Brug enten et pipette- eller vakuumsystem til at opsuge dyrkningsmediet, erstatte det med 1 ml celledissociationsreagens (se materialetabellen) og inkubere i 5 minutter ved 37 °C.
- Mens cellerne er under celledissociationsreagenset, fremstilles det nødvendige volumen aggregeringsmedium (trin 1.1) i et 15 ml konisk rør efter behov til det ønskede antal brønde i en 6-brønds ultralav fastgørelseskulturplade (se materialetabel).
- Opsug 1 ml celledissociationsreagens, og suspender cellerne i 1 ml aggregeringsmedium. Opret en enkeltcellesuspension med skånsom op-ned-pipettering, inden prøverne tælles.
FORSIGTIG: hPSC'er er ret følsomme over for mekanisk belastning og tåler ikke aggressiv pipettering. - Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletællingsenhed10 eller et standardiseret system under et mikroskop. Beregn det cellenummer, der er nødvendigt for eksperimentet.
BEMÆRK: Afhængigt af cellelinjen betragtes 200.000 celler / brønd til 300.000 celler / brønd som ideel til samlet dannelse (dvs. 4 brønde = 800.000 til 1.200.000 celler i alt). - Der tilsættes et passende volumen af cellesuspensionen til aggregeringsmediet i det koniske polypropylenrør med høj klarhed og høj klarhed. Den fortyndede cellesuspension pipetteres forsigtigt op og ned for at sikre en homogen cellefordeling.
- Der pipetteres 3 ml af den fortyndede cellesuspension i hvert ønsket hul på 6-brønds ultra-lav fastgørelseskulturplade.
- Pladen anbringes i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2 >90 % fugtighed), og undgå så vidt muligt at åbne og lukke inkubatordørene.
BEMÆRK: Dette indledende trin afsluttes bedst om aftenen eller under lav inkubatortrafik. Selv små vibrationer kan påvirke aggregaternes størrelse og form, hvilket kan forringe resultaterne.
4. Dag 1 - Mesoderm induktion af aggregater
- Sørg for, at 24 timer efter såning er små aggregater bestående af 2-10 celler synlige under mikroskopet. Aggregaterne samles, og lad dem bundfælde sig, inden substratet ændres til mesoderminduktionsmediet (trin 1.3).
- Opsæt et konisk rør af polypropylen med høj klarhed på 15 ml med høj klarhed pr. brønd på kulturpladen med ultralav fastgørelse.
- Brug en cirkulær bevægelse (dvs. som en orbitalryster) til at samle aggregaterne i midten af hver brønd, brug en 1 ml pipette til forsigtigt at samle aggregaterne og det omgivende medium fra hver brønd, placere dem i deres tilsvarende 15 ml koniske polypropylenrør med høj klarhed og lade aggregaterne sedimentere ved stuetemperatur.
- Når den er indsamlet, skal du indstille en timer til 1 time, hvilket er den tid, der kræves for de fleste cellelinjer / aggregater at sedimentere på dette stadium.
BEMÆRK: Hvis tiden er mindre end 1 time, kan man miste aggregater, der muligvis ikke har lagt sig til bunden af det 15 ml koniske rør. - Når timen er gået, aspireres supernatanten forsigtigt med en pipette eller en højfølsom sugepumpe. Sørg for, at aggregaterne forbliver uforstyrrede i bunden af det 15 ml koniske rør.
- Resuspender aggregaterne af hvert 15 ml konisk rør i 2 ml mesoderm induktionsmedium, og læg dem tilbage i deres respektive huller på 6-brønds ultra-lav fastgørelseskulturplade.
- Pladen sættes tilbage i inkubatoren (37 °C), og lad den stå indtil dag 4.
BEMÆRK: Hvis aggregaterne fastgøres og vokser på eller ind i hinanden ved hjælp af en 1 ml pipette, pipetteres hvert hul med aggregater forsigtigt op og ned en gang om dagen for at holde aggregaterne ens i størrelse.
5. Dag 4 - Vaskulær induktion og priming af aggregaterne
- Aggregaterne opsamles, og lad dem bundfælde sig, inden substratet skiftes til det vaskulære induktionsmedium (trin 1.4).
- Opsæt et 15 ml konisk rør pr. brønd på 6-brønds ultra-lav fastgørelseskulturplade.
- Brug en cirkulær bevægelse (dvs. som en orbital ryster) til at samle aggregaterne i midten af hvert hul, brug en 1 ml pipette til forsigtigt at samle aggregaterne og det omgivende medium fra hvert hul og placere dem i deres tilsvarende 15 ml koniske rør.
- Når den er indsamlet, skal du indstille en timer til 30 minutter for at lade aggregaterne sedimentere.
BEMÆRK: Der kræves en tid på 30 minutter for de fleste cellelinjer på dette stadium. Hvis tiden er mindre end 30 min, er der risiko for at miste aggregater, der muligvis ikke har lagt sig til bunden af det 15 ml koniske rør. - Efter 30 minutter aspireres supernatanten forsigtigt med en pipette eller en højfølsom opsugepumpe. Sørg for, at aggregaterne forbliver uforstyrrede i bunden af det 15 ml koniske rør.
- Resuspender aggregaterne af hvert 15 ml konisk rør i 2 ml vaskulært induktionsmedium, og læg dem tilbage i deres respektive huller på 6-brønds ultra-lav fastgørelseskulturplade.
- Pladen sættes tilbage i inkubatoren (37 °C), og lad den stå indtil dag 6.
BEMÆRK: Brug en 1 ml pipette til forsigtigt at pipette hvert hul med aggregater op og ned en gang om dagen for at holde aggregaterne ens i størrelse og forhindre dem i at vokse ind i eller binde sig til hinanden.
6. Dag 6 - Samlet indlejring og induktion af karspirer
- Mens du arbejder på is, skal du forberede det ønskede endelige volumen af ECM-opløsningen (trin 1.5).
BEMÆRK: Følgende er protokollen for en brønd i en 12-brøndplade (30-50 aggregater), som kan justeres efter behov.- For en brønd i en 12-brøndsplade påføres 0,5 ml ECM som bundlag, og brug 0,5 ml ECM plus aggregater på det øverste lag. Dette skaber ECM "sandwich", der er nødvendig for effektiv 3D-aggregatspiring.
- 500 μL ECM pipetteres i en brønd i en plade med 12 huller. Sørg for, at der ikke dannes bobler, og at brøndbunden og sidemenisken er helt belagt. Dette omfatter lag 1 af ECM-sandwichen.
- Pladen anbringes ved 37 °C i 2 timer.
BEMÆRK: En tid på 2 timer er nødvendig for effektiv polymerisation. Enhver kortere tid risikerer at kompromittere ECM-integriteten. - Mod slutningen af lag 1-polymerisationen skal du bruge en cirkulær bevægelse til at samle aggregaterne i midten af hvert hul, bruge en 1 ml pipette til forsigtigt at samle aggregaterne og det omgivende medium fra hvert hul og placere dem i deres tilsvarende 15 ml koniske rør.
- Lad aggregaterne bundfælde sig i 10-15 min, og sug supernatanten op.
- Anbring aggregaterne i det 15 ml koniske rør på is i 5 min. Under afkøling skal du tage 12-brøndpladen med det nu polymeriserede lag 1 ud af inkubatoren.
BEMÆRK: Afkøling af aggregaterne hjælper med at forhindre tidlig polymerisering af lag 2 ECM. - Arbejd hurtigt og omhyggeligt for at forhindre bobledannelse, resuspender aggregaterne i 500 μL ECM og pipette ECM-aggregatsuspensionen oven på det allerede polymeriserede lag 1. Vær forsigtig med ikke at røre lag 1, brug en 200 μL pipettespids til forsigtigt at fordele lag 2 og aggregaterne omkring brønden.
- Pladen anbringes ved 37 °C i 2 timer.
BEMÆRK: En inkubationstid på 2 timer er nødvendig for effektiv ECM-polymerisation. Enhver kortere tid risikerer at kompromittere ECM-integriteten og kan forhindre stærk vedhæftning mellem lag 1 og lag 2. - Der tilsættes 1 ml forvarmet (37 °C) spiremedium (trin 1.6) for at inducere blodkardifferentiering. Spirende kar skal vises 1 dag til 3 dage efter indlejring. Skift mediet efter 3 dage og derefter hver anden dag.
BEMÆRK: Spiremediet skal forvarmes; Ellers kan lagløsrivelse forekomme, og ECM-integriteten kan blive påvirket.
7. Dag 11 - Isolering og modning af BVO'erne
- Brug den afrundede ende af en steril spatel under sterile forhold under sterile forhold til at løsne ECM-spirematrixen, der indeholder de vaskulære netværk. På dette stadium skal gelen ligne en fritflydende disk.
- Brug sterile tang og den afrundede ende af en steril spatel til forsigtigt at overføre gelskiven (inklusive de vaskulære netværk) til låget på en 10 cm kulturskål.
- Placer låget plus gelen under et stereomikroskop justeret til den ønskede forstørrelse og fokus, og brug sterile nåle til at skære ud enkelte blodkarnetværk og forsøge at begrænse mængden af ikke-vaskulariseret ECM opnået i processen.
BEMÆRK: Cellerne nedbryder naturligt den omgivende ECM over tid; Men at reducere mængden skåret ud med hver organoid øger billedkvaliteten og det fritstående fartøjs netværksintegritet. - Når alle organoiderne er blevet isoleret fra gelen, overføres de forsigtigt tilbage til en brønd med en 6-brønds ultralav fastgørelsesplade med 3 ml spiremedium. På dette stadium kan organoiderne efterlades natten over, eller man kan straks fortsætte til trin 7.4.
- Brug en 1 ml pipette til at overføre enkelte organoider fra 6-brøndspladen til brøndene i en 96-brøndsplade med ultralav fastgørelse. Når det er overført, tilsættes 200 μL forvarmet (37 °C) spiremedium til hvert hul i 96-brøndpladen.
BEMÆRK: En brønd af vaskulære organoider fra en 12-brøndplade skal fylde 30-40 brønde af en 96-brøndplade. - 4-6 dage efter isolering i 96-brøndpladerne skal du sikre dig, at organoiderne har en rund og sund morfologi. På dette stadium er organoiderne klar til at blive fastgjort og forberedt til farvning.
8. Dag 15 - Fastgørelse, blokering og farvning af BVO'erne
- Brug en skåret 1 ml spids til at overføre organoiderne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Vær forsigtig med at undgå aspiration af BBO'er, brug en 200 μL eller 1.000 μL pipette til at fjerne det resterende spiremedium i mikrocentrifugerøret, og tilsæt derefter 1 ml 4% PFA i PBS i 1 time.
BEMÆRK: Fastgørelse på en orbitalryster (125 o / min) ved stuetemperatur anbefales. Højst 60 BVO'er/mikrocentrifugerør kan accepteres. Enhver mere BVO'er vil forringe fiksering og vaskeeffektivitet.
FORSIGTIG: PFA er et skadeligt kemikalie. Brug den med forsigtighed i en stinkhætte, og følg producentens brugsanvisning og passende bortskaffelsesmetoder. - Vask de nyligt fikserede BBO'er 3x i 15 minutter hver gang med 0,25% PBS-Tween.
- Hvis organoiderne er større end 1 mm i diameter, permeabiliseres BVO'erne med 1% Triton X-100 i PBS i 30-60 minutter ved stuetemperatur.
- Opsug alle 0,25% PBS-Tween, og tilsæt 1 ml blokerende buffer (trin 1.7).
BEMÆRK: Selvom antistofafhængig, er 2 timer ved stuetemperatur på en orbitalryster (125 o / min) tilstrækkelig til at reducere ikke-specifik antistofbinding under farvningsprocessen. Organoiderne kan efterlades i blokeringsbufferen ved 4 °C i op til 2 uger. - Den blokerende buffer fjernes, og det primære antistof (1:100) fortyndes i 1 ml blokerende buffer. Opbevares natten over ved 4 °C på en orbitalryster (12 omdr./min.), idet det sikres, at organoiden/organoiderne forbliver nedsænket i den primære antistofopløsning.
BEMÆRK: Primær antistofinkubation natten over er egnet til de antistoffer, der anvendes til denne undersøgelse. De nødvendige primære og sekundære antistoffer og deres respektive fortyndinger er angivet i materialetabellen. - Efter inkubation af primære antistoffer natten over fjernes den primære antistofopløsning og vaskes 3x i 15 minutter hver gang med 0,25% PBS-Tween.
- Det sekundære antistof (1:250) plus DAPI (1:1.000) fortyndes i 1 ml blokerende buffer, og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur eller ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Hvis prøverne fremstilles korrekt (som beskrevet ovenfor), er inkubation i 2 timer ved stuetemperatur eller ved 4 °C natten over egnet til de antistoffer, der anvendes i nærværende undersøgelse. - Efter inkubation fjernes den sekundære antistofopløsning, og der vaskes 3x i 15 minutter hver gang med 0,25% PBS-Tween.
BEMÆRK: Efter farvningen kan organoiderne opbevares i PBS i op til 2 uger.
9. Montering af blodkarorganoider (BVO'er)
- Lim monteringsafstandsstykker på de ønskede billeddæksler (se materialetabel).
- Brug en skåret 1 mm pipettespids til at overføre enkelte organoider til afstandsstykkerne og aspirere den resterende PBS ved hjælp af en skåret 1 mm pipettespids.
- Fyld brønden med 150-200 μL clearingopløsning (se materialetabellen) opvarmet til 75 °C, og nedsænk organoiden helt.
BEMÆRK: Prøverne skal være klare inden for 1 time efter eksponering for den opvarmede clearingopløsning.- Lad organoiderne blive klare i en overdækket kasse i mørke ved stuetemperatur i 6 timer til natten over, hvis 1 times rydningstid er utilstrækkelig. Hvis prøven efterlades natten over, skal du sikre dig, at den har tilstrækkelig rydningsopløsning til at undgå udtørring.
- Efter rydning aspireres clearingopløsningen forsigtigt med en 100-200 μL pipettespids. Manøvrer forsigtigt organoiden til midten af afstandsstykkebrønden, og tilsæt dråber monteringsgel (se materialetabel) (opvarmet til 75 ° C i en kontrolleret varmeblok), indtil brønden er fuld.
- Placer forsigtigt den anden dæksel oven på monteringsafstandsstykket for at forsegle prøverne i mellemrummet mellem bund- og topdækselerne. Lad monteringsgelen hærde i mørke ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Efter hærdningen kan topcoat neglelak bruges til yderligere at forsegle de monterede prøver.
Representative Results
De trin, der er beskrevet i denne protokol, blev udviklet specifikt til at give en kontrolleret og præcis metode til generering af humane blodkarorganoider fra hPSC'er. Frembringelsen af aggregater på 30-100 μm i diameter fra hPSC-kulturer markerer protokollens udgangspunkt (figur 1, figur 2B). Aggregaterne ledes gennem trinvise induktioner mod mesoderm (dag 1-dag 4) og vaskulære slægter (dag 4-dag 6) før indlejring (dag 6) (figur 2A-D), hvilket er nødvendigt for dannelse af fartøjsnetværk. Nærradialt symmetrisk beholderspiring skal være synlig ved d7 eller d8 (figur 2E) og fortsætte gennem d10 (figur 2F,G). Eksplantationen af hBVOerne fra ECM til 96-brønds ultralave fastgørelsesplader reducerer skrøbeligheden af spirenetværkene og muliggør fortsat vedligeholdelse i suspensionskulturforhold (figur 2H) i op til 6 måneder. Ved d15 udviser hBVOerne et omfattende og forbundet endotelnetværk (CD31+) omgivet af pericytter (PDGFR-ß+) og glat muskelaktin (SMA+) (figur 3A-D). En kontinuerlig kollagen IV (ColIV +) kældermembran omslutter fartøjets netværk (figur 3E). Endotelceller (CD31+, VE-Cadherin+) og pericytter (PDGFR-ß+) udgør henholdsvis ca. 30%-35% og 60%-65% af organoidcellepopulationerne8. Den aktive spiring af karrene sker under ledelse af en endogent organiseret tipcellepopulation (CD31+), der præsenterer med typisk spidscellemorfologi, såsom overdreven filipodia 8,10. Præsentationen af PDGFR-ß + og SMA + vægmalericeller, der indkapsler endotelbeholdernetværkene, kan ses ved d15 i organoidmodningsprocessen (figur 3A, C). Efter fjernelse fra ECM og modning i suspensionskultur (dvs. d15) er hBVOerne holdbare til respektive analyser eller transplantation under musenyrekapslen.
Figur 1: Skematisk oversigt over hBVO-protokollen, der fremhæver timingen og trinvis progression. Fra tilsyneladende homogene hPSC- eller hiPSC-kulturer forekommer aggregatdannelse i nærvær af Rho-kinasehæmmeren Y27632. BMP4 og CHiR-suppleret medium bruges til at instruere aggregaterne mod den mesodermale skæbne. Mesoderm induktionsmedium erstattes af VEGFA og forskolin-suppleret medium for at stimulere aggregaterne mod en vaskulær afstamning. Mekaniske og kemiske køer opnået ved indlejring af aggregaterne i en kollagen I og opløselig kældermembranmatrix og eksponering for VEGFA- og FGF2-holdigt medium resulterer i næsten radialt symmetrisk vaskulær spiring fra det samlede legeme. De genererede fartøjsnetværk kan fjernes fra kollagen I og opløselig kældermembran og placeres i suspensionskultur til yderligere modning, analyse eller transplantation in vivo. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trinvis progression af hBVO generationen fanget under brightfield. (A) Typisk morfologi af hPSC (H9) kolonier på dag -1. B) Generering af hPSC-aggregater (dag 0) på ultralave fastgørelsesplader med 6 brønde under tilstedeværelse af Y-27632. C) Mesodermal induktion af aggregater ved hjælp af BMP4 og ChiR-suppleret substrat (dag 1). Subtile ændringer i den samlede størrelse og form kan også observeres. (D) Dag 4-aggregater primet mod en vaskulær afstamning ved hjælp af VEGFA og forskolin-suppleret medium. E) Tidlig spiring af beholdere på dag 7, en dag efter indlejring af aggregaterne i spirematrixen og eksponering for VEGFA- og FGF2-suppleret spiremedium (dag 7). (F) Sund organoid morfologi og fortsat karspiring på dag 9. G) Beholderspiring i sene stadier på dag 10. Ideelt set er de tætte cellestrukturer i organoidcentret forsvundet på dette tidspunkt. (H) Typisk morfologi af modne (dag 15) humane blodkarorganoider. Fjernelsen af den omgivende matrix ved skæring og modning i ultra-lav vedhæftning 96-brønds kulturplader former organoiderne sfærisk, med beholdernetværkene anbragt internt. Skalastænger: (A, B, E, F) 250 μm; C,D) 500 μm (G,H) 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Helmonteret farvning af modne (dag 15) humane blodkarorganoider. (A) Præsentation af modne (dag 15) humane blodkarorganoider med selvorganiserede endotelnetværk (CD31+, magenta) og omgivende pericyt-(PDGFR-β+, cyan) og alfa-glat muskelaktin (SMA+, gul). (B) Større forstørrelse af A, der beskriver SMA+ (gul) og PDGFR-β+ (cyan) udtryk for fartøjsnetværkene. (C) Detaljeret præsentation af endotelinteraktion (CD31+, magenta), pericyt (PDGFR-β+, cyan) og alfa-glat muskelaktin (SMA+, gul). (D) Helmonteret farvning af karrendotelial (CD31+, magenta)-glat muskulatur (SMA+, gul) interaktion i et tværsnit (venstre) og en højere forstørrelse (højre) af modne blodkarorganoider. (E) Selvstyret dannelse af en vaskulær kældermembran (Col IV +, gråtoner) gennem den tætte tilknytning af vægmalericellerne og endotelrørene. Skalastænger: (A,D[venstre]) 100 μm; (B,D[højre],E) 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Nylige gennembrud i stamcelleafledte organoidkulturer har skabt rammerne for mere avancerede og fysiologisk relevante modeller af menneskelig vaskulatur. Den humane blodkarorganoid (hBVO) model, der præsenteres her, udviklet i vores laboratorium 8,10, giver et kraftfuldt middel til at udforske ikke kun yderligere aspekter af human vaskulogenese, men også nye veje til sygdomsmodellering og regenerativ terapi 8,10,11. Flere in vivo-modeller er blevet anvendt til at undersøge udvikling og modning af blodkar, vaskulær sygdom og endoteldysfunktion 3,4. Forskellige tilgange kombinerer enkelt- og multiple afstamningsdefinerede celler, der enten stammer fra stamceller eller isoleres fra voksent væv in vivo, for at skabe replikative humane vaskulære netværk 5,6. Protokollen, der præsenteres her, udnytter princippet om udviklingsbiologi og selvorganisering til at give de første multicellede afstamning humane blodkarnetværk, der i det væsentlige kan genereres fra en enkelt hPSC 8,10.
Hver stamcellelinje har en unik genetisk sammensætning og adskiller sig fra andre med hensyn til dens sourcing, funktion og lydhørhed15. Derfor blev protokollen for humane blodkarorganoider (hBVO'er) udviklet og optimeret for at sikre en robust og reproducerbar protokolkompatibilitet med flere (>12) forskellige hPSC-linjer 8,10. Metoden beskrevet her genererer hPSC-afledte blodkarorganoider over 2 uger. Ændringer i mediesammensætningen og/eller teknikkerne i hBVO generering kan imidlertid føre til ineffektivt fartøjsnetværk og organoid generering. De varierende spredningshastigheder for individuelle stamcellelinjer påvirker også markant reproducerbarheden af stamcelleforsøg15 og dermed organoidkulturer. For eksempel er der ved generering af BVO'erne mere proliferative celler eller et højere antal store dag 1-aggregater i sagens natur underlagt forskellige metaboliske miljøer og gas- og næringsdiffusionsparametre. Dette ændrer igen vækstfaktoreksponeringstiderne og effektiviteten, graden af differentiering og vaskulær priming og vigtigst af alt evnen til at danne fartøjsnetværk ved indlejring af aggregaterne i kollagen 1 og opløselig kældermembranmatrix.
Den passive diffusion af ilt og administrationen af essentielle næringsstoffer fra et eksternt miljø er ikke ideel til langsigtet cellevækst af 3D-organoider og vævsmorfogenese in vitro16. Selv om det afhænger af flere faktorer (dvs. vævets stofskifte, biotilgængeligheden af næringsstoffer og gasser, et statisk eller dynamisk miljø), er der fastsat en generel grænse på 150 μmO2 og næringsstofdiffusion for væv, der dyrkes in vitro, idet humant væv fysiologisk set har strenge af levende celler inden for 150 μm fra perfunderede blodkar17. Selvom effektive gas- og næringsdiffusionsafstande på 70-200 μm også er blevet foreslået18,19,20,21, påvirker konstruktionstætheden, temperaturen, pH og mediesammensætningen diffusionseffektiviteten betydeligt. På grund af overfladearealoptimering og integrin-beta-receptorkommunikation efter dag 6-indlejring fungerer aggregater med en diameter på 250-300 μm bedre end dem > 500-600 μm i diameter, hvilket resulterer i en komplet beholderspiringsproces og en minimalt kondenseret organoid kerne. Således er den samlede størrelse afgørende og kan påvirkes af både antallet af celler, der anvendes under den indledende såning, og den tid, der er afsat til aggregatdannelse. Mikrobrøndplader, der giver mulighed for kontrol over aggregatstørrelsen og antallet22, er et levedygtigt alternativ til den ellers stokastiske aggregatdannelsesteknik, der er resultatet af brugen af 6-brøndsplader med ultralav fastgørelse i denne protokol. Konsistens i timing og styring af aggregatstørrelserne i løbet af de første 6 dage af hBVO-protokollen er en af, hvis ikke den mest, afgørende indikatorer for vellykket udvikling af bona fide blodkarorganoider.
Middelskift på dag 1 (mesoderm induktion) og dag 4 (vaskulær induktion) skal fuldføres i kombination med sedimentering af aggregaterne. Selvom centrifugering er et fristende alternativ, kan de ekstra kræfter, der påføres de svagt monterede aggerater, forårsage uønsket klumpning, samling og klipning, hvilket negativt påvirker differentiering, modning og spiringseffektivitet i de senere stadier af protokollen. Arbejde på is i løbet af dag 6-indlejringsprocessen er afgørende for at bevare korrekt ECM-polymerisering og lagdannelse. Under induktionen af den samlede indlejring og spiring vil udsættelse af ECM for temperaturer over 4 °C og/eller en anden ECM-pH-værdi end 7,4 ikke kun påvirke polymerisationshastighederne og ECM-lagintegriteten, men også spireeffektiviteten af de indlejrede aggregater. ECM-spirematrixens elastiske natur muliggør nem løsrivelse og transport fra 12-brønds kulturskålen til den sterile skæreflade. Individuelle organoider fjernet fra matrixen og overført til 96-brøndplader med ultralav vedhæftning vil forbruge de resterende omgivende ECM og bevare selvorganiserede vægmalericellebelagte endotelmikrokarnetværk med en kontinuerlig kældermembran.
Selvom det ikke er dækket af dette forslag, kan ændringer i mediesammensætningerne replikere sygdomme, der igen fremkalder patologiske reaktioner i hBVOs 8,11. Grænserne for sygdomsmodellering ved hjælp af hBVO-systemet er langt fra velkendte, og dette er bestemt et område, der skal udforskes. Anvendelsen af vores blodkarorganoidteknologi i vaskulariseringen af tidligere avaskulære organoidkonstruktioner23 er også af betydelig indflydelse og interesse.
Disclosures
Der er ingen sammenhæng mellem forfatternes økonomiske interesser og den forskning, der præsenteres. Blodkarorganoidteknologien er blevet licenseret til Stemcell Technologies. J.M.P. er grundlægger og aktionær i Angios Biotech, der udvikler blodkarorganoider som vaskulær transplantationsterapi. En patentansøgning relateret til dette arbejde er blevet indgivet under Pat. nr. US20200199541A1, der nævner Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger og Dontscho Kerjaschki som opfindere.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af vores laboratorier for kritiske input og diskussioner. JMP modtog finansiering fra T. von Zastrow-fonden, FWF Wittgenstein-prisen (Z 271-B19), det østrigske videnskabsakademi, fællesforetagendet for initiativet om innovative lægemidler 2 (JU) under tilskudsaftale nr. 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program og Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 samt Canadian Institutes of Health Research COVID-19-tilskud F20-02343 og F20-02015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
| 7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
| Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
| Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
| Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
| Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
| Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
| BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
| CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
| CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
| Cellulose wipes | |||
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
| CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
| Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
| Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
| Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | |||
| Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
| Eppendorf tubes | |||
| Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
| Fine forceps | FST | 11254-20 | |
| Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
| Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
| Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
| KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
| PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
| PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
| Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
| PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
| RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
| Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
| SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
| Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
| Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
| Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
| StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
| Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
| Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
| Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 |
References
- Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
- Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
- Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
- Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581 (2018).
- Risau, W.
- Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
- Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).
- Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
- Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
- Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
- Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846 (2014).
- Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
- McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
- McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
- Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
- Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
- Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).
- Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707 (2022).
