Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von selbstorganisierenden Blutgefäßen aus humanen pluripotenten und induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese Blutgefäßnetzwerke weisen ein ausgedehntes und verbundenes Endothelnetzwerk auf, das von Perizyten, Aktin der glatten Muskulatur und einer durchgehenden Basalmembran umgeben ist.
Abstract
Ein Organoid ist definiert als ein künstlich hergestelltes multizelluläres In-vitro-Gewebe , das sein entsprechendes In-vivo-Organ nachahmt, so dass es verwendet werden kann, um definierte Aspekte dieses Organs in einer Gewebekulturschale zu untersuchen. Die Breite und Anwendung der Forschung an humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) hat sich erheblich weiterentwickelt und umfasst unter anderem das Gehirn, die Netzhaut, den Tränenkanal, das Herz, die Lunge, den Darm, die Bauchspeicheldrüse, die Niere und die Blutgefäße. Die Entwicklung von Methoden zur Erzeugung menschlicher Mikrogefäße hat insbesondere den Weg für die Modellierung der Entwicklung und Erkrankung menschlicher Blutgefäße in vitro sowie für die Erprobung und Analyse neuer Medikamente oder Gewebetropismus bei Virusinfektionen, einschließlich SARS-CoV-2, geebnet. Komplexe und langwierige Protokolle, denen es an visueller Anleitung mangelt, behindern die Reproduzierbarkeit vieler aus Stammzellen gewonnener Organoide. Darüber hinaus erfordert die inhärente Stochastizität von Organoidbildungsprozessen und Selbstorganisation die Generierung optischer Protokolle, um das Verständnis der Erfassung und Programmierung des Zellschicksals zu verbessern. In dieser Arbeit wird ein visuell geführtes Protokoll für die Erzeugung von 3D-Organoiden (BVOs) aus hPSCs vorgestellt. Mit einer durchgehenden Basalmembran, vaskulären Endothelzellen und einer organisierten Artikulation mit Wandzellen weisen BVOs die funktionellen, morphologischen und molekularen Merkmale des menschlichen Mikrogefäßsystems auf. Die BVO-Bildung wird durch Aggregatbildung eingeleitet, gefolgt von Mesoderm- und vaskulärer Induktion. Die vaskuläre Reifung und Netzwerkbildung wird durch die Einbettung von Aggregaten in eine 3D-Kollagen- und solubilisierte Basalmembranmatrix initiiert und unterstützt. Menschliche Gefäßnetzwerke bilden sich innerhalb von 2-3 Wochen und können in skalierbaren Kultursystemen weiter gezüchtet werden. Wichtig ist, dass BVOs, die in immungeschwächte Mäuse transplantiert werden, mit der endogenen Mauszirkulation anastomosieren und in funktionelle Arterien, Venen und Arteriolen spezifizieren. Das vorliegende visuell gesteuerte Protokoll wird die Forschung an menschlichen Organoiden voranbringen, insbesondere in Bezug auf Blutgefäße in normaler Entwicklung, Gewebevaskularisierung und Krankheiten.
Introduction
Gefäßfunktionsstörungen und Erkrankungen der Blutgefäße führen zu deutlichen Komplikationen der Organfunktionen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache1 und tragen auch am häufigsten zum Anstieg der Gesundheitskosten in den Vereinigten Staaten bei. Die Fallzahlen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen steigen von Jahr zu Jahr, und die Zahl dieser Fälle steigt in jüngeren Altersgruppen (20-45 Jahre)2. Es wurden mehrere In-vivo-Modelle entwickelt, um die Entwicklung und Reifung von Blutgefäßen, Gefäßerkrankungen und endotheliale Dysfunktionen zu untersuchen 3,4. Derzeit können Methoden, die einzelne und mehrere liniendefinierte Zellen kombinieren, die entweder aus Stammzellen gewonnen oder in vivo aus adultem Gewebe isoliert wurden, vaskuläre Netzwerke schaffen, die Aspekte der menschlichen Gefäßfunktion und -anatomie nachbilden 5,6. Blutgefäße haben sich während der Entwicklung aus dem Mesoderm als eines der ersten funktionellen Systeme herausgebildet und organisieren sich entweder durch einen Prozess der Assemblierung, der als "Vaskulogenese" bezeichnet wird, oder durch Erweiterung und Verzweigung von bereits vorhandenen Gefäßen, was als "Angiogenese" bezeichnet wird7.
Wimmer et al. nutzten die Möglichkeiten der Entwicklungsbiologie und der selbstgesteuerten Assemblierung und berichteten über die ersten selbstorganisierenden 3D-Organoide menschlicher Blutgefäße aus hPSCs, die die funktionellen, morphologischen und molekularen Eigenschaften des menschlichen Mikrogefäßsystems aufweisen8. Ähnlich wie das menschliche Gefäßsystem9 werden diese hBVOs mit einem Endothel, einer durchgehenden Basalmembran und umgebenden Wandzellen gebildet und liegen vor 8,10. Die hBVOs können in vivo transplantiert und mit dem endogenen Kreislauf anastomosiert werden. Sie können auch in vitro reifen und als Modelle für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z. B. Diabetes)8 oder Gewebetropismus bei Virusinfektionen wie SARS-CoV-2dienen 11. Obwohl wir zuvor ein schriftliches Protokoll10 veröffentlicht haben, gibt es kein verfügbares Videoprotokoll für diese ansonsten komplexe Technik.
Durch eine prägnante schrittweise Progression wird die hBVO-Bildung durch Aggregatbildung, Mesoderm-Induktion mit einem WNT-Agonisten, Chiron (CHIR99021) und knochenmorphogenem Protein - 4 (BMP4)12,13, vaskuläre Induktion über vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor A (VEGFA) und Forskolin (Fors)12 und Einbettung in eine benutzerdefinierte Sprossungsmatrixerreicht 8,10. Die Gefäßreifung und Netzwerkbildung erfolgt nach der Einbettung der Aggregate in die Keimmatrix. Diese menschlichen Gefäßnetzwerke bilden sich innerhalb von 2-3 Wochen und können aus der Keimmatrix entfernt und in skalierbaren Kultursystemen bis zu 6 Monate weiter gezüchtet werden. Hier werden optisch gesteuerte Verfahren zur Bildung und Applikation von humanen Stammzellgefäßen bereitgestellt.
Protocol
Alle hier durchgeführten Experimente verwendeten die kommerziell erhältliche humane H9-iPSC-Linie. Gängige kommerziell und nicht kommerziell erhältliche humane pluripotente Stammzelllinien (z. B. H9, NC8) wurden ebenfalls getestet und haben sich als wirksam für die Erzeugung menschlicher Blutgefäßorganoide unter Verwendung dieses Protokolls erwiesen. Einzelheiten entnehmen Sie bitte unseren bereits veröffentlichten Berichten 8,10.
1. Medien- und Reagenzienformulierung für die Erzeugung menschlicher Blutgefäßorganoide
- Bereiten Sie das Aggregationsmedium vor.
- Mischen Sie 40 ml Knock-out-DMEM/F12 (Medium mit niedriger Osmolalität ohne L-Glutamin oder HEPES-Puffer, optimiert für das Wachstum von humanem ESC und iPSC), 10 ml Knock-out-Serumersatz (KOSR), 0,5 ml 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85 % NaCl, 0,5 ml nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 35 μl Beta-Mercaptoethanol (BME, 100 μl 2-Mercaptoethanol in 10 ml sterilem PBS), und Y-27632 (zellpermeabler und selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-coil-haltigen Proteinkinase [ROCK]14 [10 mM] bei 1:200) (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie N2B27 (N2 und B27 ergänztes Basismedium) vor.
- Mischen Sie 25 ml DMEM/F12, 25 ml neurobasales Medium, 1 ml B27-Supplement, 0,5 mL N2-Supplement, 250 μl 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85 % NaCl und 35 μl Beta-Mercaptoethanol (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie das Mesoderm-Induktionsmedium vor.
- Ergänzen Sie das N2B27-Medium mit ChiR (12 μM, GSK3a/b-Inhibitor, der die Induktion des Mesoderms stimuliert) und BMP-4 (30 ng/ml, MSX2-Aktivator, der die Mesodermlinie induziert).
Anmerkungen: Bestand (ChiR): 10 mM (verwenden Sie 1:833 oder 1,2 μl/ml N2B27). Bestand (BMP-4): 100 μg/ml (verwenden Sie 1:3333 oder 0,3 μl/ml N2B27) (siehe Materialtabelle).
- Ergänzen Sie das N2B27-Medium mit ChiR (12 μM, GSK3a/b-Inhibitor, der die Induktion des Mesoderms stimuliert) und BMP-4 (30 ng/ml, MSX2-Aktivator, der die Mesodermlinie induziert).
- Bereiten Sie ein vaskuläres Induktionsmedium vor.
- N2B27-Medium mit VEGFA (100 ng/ml) und Forskolin (2 μM) ergänzen (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie die extrazelluläre Matrix (EZM) vor.
- Verwenden Sie 1 ml ECM für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte (zum Einbetten von 30-50 Aggregaten). Von den 1 ml ECM-Lösung, die für jedes Bohrloch verwendet wird, verwenden Sie 0,5 ml, um eine untere Schicht, "Schicht 1", die als ECM-Fundament dient, und 0,5 ml plus Aggregate für die oberste Schicht, "Schicht 2", zu erstellen. Dieser Ansatz bietet durch die EZM-Suspension ausreichend Platz und Unterstützung für die menschlichen Blutgefäßnetzwerke, um in alle Richtungen zu sprießen.
ANMERKUNG: Insgesamt enthält 1 ml EZM 500 μl gereinigtes Rinderkollagen Typ I, 250 μl gelöste Basalmembranmatrix, die von Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen sezerniert wird (siehe Materialtabelle), und 250 μl basische Matrixlösung (Schritt 1.5.2). Bereiten Sie es frisch zu und bewahren Sie es bis zur Verwendung auf Eis auf. - Zur Herstellung der basischen Matrixlösung für vier 12-Well-Platten (48 Wells) werden 5,627 ml 0,1 N NaOH, 2,498 ml 10x DMEM, 473 μl HEPES, 368 μl 7,5 % Natriumbicarbonat, 233 μl 200 mM L-Alanyl-L-glutamin-dipeptid in 0,85 % NaCl und 3,451 ml Ham's F-12 gemischt (siehe Materialtabelle).
Anmerkungen: Die übrig gebliebene Basis-Matrixlösung kann in ein verdeckeltes 50-ml-konisches 50-ml-Röhrchen aus hochklarem Polypropylen gegeben und bei 4 °C gelagert werden, um es bis zu 2 Monate lang zu verwenden.
- Verwenden Sie 1 ml ECM für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte (zum Einbetten von 30-50 Aggregaten). Von den 1 ml ECM-Lösung, die für jedes Bohrloch verwendet wird, verwenden Sie 0,5 ml, um eine untere Schicht, "Schicht 1", die als ECM-Fundament dient, und 0,5 ml plus Aggregate für die oberste Schicht, "Schicht 2", zu erstellen. Dieser Ansatz bietet durch die EZM-Suspension ausreichend Platz und Unterstützung für die menschlichen Blutgefäßnetzwerke, um in alle Richtungen zu sprießen.
- Bereiten Sie das Keimmedium vor.
- Formulieren Sie speziell 50 ml flexibles serumfreies Medium (SFM) zur Unterstützung der Entwicklung menschlicher hämatopoetischer Zellen, 1,3 ml aliquot des Nährstoffergänzungsmittels mit flexiblem serumfreiem Medium, 15 % fötales Kälberserum (FBS), 250 μl Penicillin-Streptomycin, 500 μl 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85 % NaCl, VEGFA (100 ng/ml) und FGF2 (100 ng/ml) (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie den Blockierungspuffer vor.
- Mischen Sie 0,5 g Rinderserumalbumin, 1,5 ml fötales Kälberserum, 250 μl Tween 20, 250 μl Triton X-100, 500 μl Natriumdesoxycholat (1 Gew./Vol.-Brühe) und 47,5 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (siehe Materialtabelle). Pipettieren Sie auf und ab, bis alle Komponenten gut eingearbeitet sind und die Lösung klar ist.
2. Erhaltung und Kultivierung humaner pluripotenter und induzierter pluripotenter Stammzellen
- Durchführung der Zellkultur mit LDEV-freien Basalmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor (1:50 Verdünnung) beschichteten 6-Well-Gewebekulturplatten mit Stammzellkulturmedium (siehe Materialtabelle).
- Sobald die Zellen ~70% Konfluenz erreicht haben, passieren Sie sie mit 1 ml Säugetierzell-Dissoziationsenzym (siehe Materialtabelle) für 3-4 Minuten bei 37 °C.
HINWEIS: Die Teilung der Zellen im Verhältnis 1:6 verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen und erreicht bei den meisten menschlichen Stammzelllinien innerhalb von 2-4 Tagen eine Konfluenz. Um die Zellviabilität zu erhöhen, wird der ROCK-Inhibitor Y-27632-supplementiertes (10 mM, 1:1.000) Nährmedium für 24 Stunden nach der Passage verwendet. - Wechseln Sie das Nährmedium täglich, bis eine Konfluenz von 70 % erreicht ist.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie enthält eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte bei einer Konfluenz von 70 % etwa 1 Million H9-hPSCs.
3. Tag 0 - Erzeugung pluripotenter Aggregate aus einer einzelligen Suspension
HINWEIS: Eine Konfluenz von 70 % in zwei Vertiefungen einer 6-Well-Kulturplatte ergibt etwa 175 hBVOs.
- Saugen Sie das Nährmedium entweder mit einer Pipette oder einem Vakuumsystem ab, ersetzen Sie es durch 1 ml Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei 37 °C.
- Während sich die Zellen unter dem Zelldissoziationsreagenz befinden, bereiten Sie das erforderliche Volumen des Aggregationsmediums (Schritt 1.1) in einem konischen 15-ml-Röhrchen nach Bedarf für die gewünschte Anzahl von Vertiefungen in einer 6-Well-Kulturplatte mit extrem niedriger Bindung (siehe Materialtabelle) vor.
- Aspirieren Sie das 1 ml Zelldissoziationsreagenz und suspendieren Sie die Zellen in 1 ml Aggregationsmedium. Erstellen Sie eine Einzelzellsuspension mit sanftem Auf-Ab-Pipettieren, bevor Sie die Proben zählen.
ACHTUNG: hPSCs sind sehr empfindlich gegenüber mechanischer Beanspruchung und vertragen kein aggressives Pipettieren. - Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzählgerät10 oder einem standardisierten System unter einem Mikroskop. Berechnen Sie die Zellzahl, die für das Experiment benötigt wird.
HINWEIS: Je nach Zelllinie gelten 200.000 Zellen/Well bis 300.000 Zellen/Well als ideal für die Aggregatbildung (d. h. 4 Wells = 800.000 bis 1.200.000 Zellen insgesamt). - Geben Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension in das Aggregationsmedium in dem 15-ml-konischen 15-ml-Röhrchen aus hochklarem Polypropylen. Pipettieren Sie die verdünnte Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um eine homogene Zellverteilung zu gewährleisten.
- Pipettieren Sie 3 ml der verdünnten Zellsuspension in jede gewünschte Vertiefung der 6-Well-Kulturplatte mit extrem niedriger Anhaftung.
- Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, 5 % CO2, >90 % Luftfeuchtigkeit) und vermeiden Sie das Öffnen und Schließen der Inkubatortüren so weit wie möglich.
HINWEIS: Dieser erste Schritt wird am besten abends oder bei geringem Inkubatorverkehr durchgeführt. Schon leichte Vibrationen können die Größe und Form der Aggregate beeinflussen, was die Ergebnisse beeinträchtigen kann.
4. Tag 1 - Mesoderm-Induktion von Aggregaten
- Stellen Sie sicher, dass 24 h nach der Aussaat kleine Aggregate mit 2-10 Zellen unter dem Mikroskop sichtbar sind. Sammeln Sie die Aggregate und lassen Sie sie absetzen, bevor Sie das Medium auf das Mesoderm-Induktionsmedium umstellen (Schritt 1.3).
- Stellen Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen aus hochtransparentem Polypropylen pro Vertiefung der 6-Well-Kulturplatte mit extrem niedrigem Aufsatz auf.
- Verwenden Sie eine kreisförmige Bewegung (d. h. wie ein Orbitalschüttler), um die Aggregate in der Mitte jeder Vertiefung zu sammeln, verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um die Aggregate und das umgebende Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung zu sammeln, legen Sie sie in die entsprechenden konischen 15-ml-Röhrchen aus hochklarem Polypropylen und lassen Sie die Aggregate bei Raumtemperatur sedimentieren.
- Stellen Sie nach dem Sammeln einen Timer auf 1 h ein, was der Zeit entspricht, die die meisten Zelllinien/Aggregate benötigen, um in diesem Stadium sedimentiert zu werden.
Anmerkungen: Wenn die Zeit weniger als 1 h beträgt, können alle Aggregate verloren gehen, die sich möglicherweise nicht am Boden des konischen 15-ml-Röhrchens abgesetzt haben. - Nach Ablauf der Stunde mit Vorsicht den Überstand mit einer Pipette oder einer hochempfindlichen Ansaugpumpe absaugen. Stellen Sie sicher, dass die Aggregate ungestört am Boden des konischen 15-ml-Röhrchens bleiben.
- Resuspendieren Sie die Aggregate jedes konischen 15-ml-Röhrchens in 2 ml Mesoderm-Induktionsmedium und setzen Sie sie wieder in ihre jeweiligen Vertiefungen der 6-Well-Kulturplatte mit extrem niedriger Bindung ein.
- Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator (37 °C) und lassen Sie sie bis zum 4. Tag stehen.
Anmerkungen: Wenn sich die Aggregate anheften und aufeinander oder ineinander wachsen, pipettieren Sie mit einer 1-ml-Pipette jede Vertiefung mit Aggregaten einmal täglich vorsichtig auf und ab, um die Aggregate ähnlich groß zu halten.
5. Tag 4 - Vaskuläre Induktion und Priming der Aggregate
- Sammeln Sie die Aggregate und lassen Sie sie absetzen, bevor Sie das Medium auf das vaskuläre Induktionsmedium umstellen (Schritt 1.4).
- Stellen Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen pro Vertiefung der 6-Well-Kulturplatte mit extrem niedrigem Aufsatz auf.
- Verwenden Sie eine kreisförmige Bewegung (d. h. wie ein Orbitalschüttler), um die Aggregate in der Mitte jeder Vertiefung zu sammeln, verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um die Aggregate und das umgebende Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung zu sammeln, und legen Sie sie in die entsprechenden konischen 15-ml-Röhrchen.
- Stellen Sie nach dem Sammeln einen Timer auf 30 Minuten ein, damit sich die Aggregate absetzen können.
HINWEIS: Für die meisten Zelllinien ist in diesem Stadium eine Zeit von 30 Minuten erforderlich. Wenn die Zeit weniger als 30 Minuten beträgt, besteht die Gefahr, dass Aggregate verloren gehen, die sich möglicherweise nicht am Boden des konischen 15-ml-Röhrchens abgesetzt haben. - Nach 30 Minuten mit Vorsicht den Überstand mit einer Pipette oder einer hochempfindlichen Ansaugpumpe absaugen. Stellen Sie sicher, dass die Aggregate ungestört am Boden des konischen 15-ml-Röhrchens bleiben.
- Resuspendieren Sie die Aggregate jedes konischen 15-ml-Röhrchens in 2 ml vaskulärem Induktionsmedium und legen Sie sie wieder in ihre jeweiligen Vertiefungen der 6-Well-Kulturplatte mit extrem niedriger Bindung.
- Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator (37 °C) und lassen Sie sie bis zum 6. Tag stehen.
Anmerkungen: Pipettieren Sie mit einer 1-ml-Pipette jede Vertiefung mit Aggregaten einmal täglich vorsichtig auf und ab, um die Größe der Aggregate zu erhalten und zu verhindern, dass sie ineinander wachsen oder sich aneinander anheften.
6. Tag 6 - Einbettung von Aggregaten und Induktion von Gefäßsprossen
- Bereiten Sie während der Arbeit auf Eis das gewünschte Endvolumen der ECM-Lösung vor (Schritt 1.5).
HINWEIS: Im Folgenden finden Sie das Protokoll für ein Bohrloch einer 12-Well-Platte (30-50 Aggregate), das bei Bedarf angepasst werden kann.- Für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte werden 0,5 ml ECM als untere Schicht und 0,5 ml ECM plus Aggregate auf die obere Schicht aufgetragen. Dadurch entsteht das ECM-"Sandwich", das für eine effektive 3D-Aggregatkeimung erforderlich ist.
- Pipettieren Sie 500 μl ECM in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen bilden und der Muldenboden und der Seitenmeniskus vollständig beschichtet sind. Diese besteht aus Schicht 1 des ECM-Sandwiches.
- Stellen Sie den Teller für 2 h wieder auf 37 °C.
HINWEIS: Für eine effektive Polymerisation ist eine Zeit von 2 h erforderlich. Jede kürzere Zeit birgt die Gefahr, dass die Integrität des ECM beeinträchtigt wird. - Verwenden Sie gegen Ende der Polymerisation der Schicht 1 eine kreisförmige Bewegung, um die Aggregate in der Mitte jeder Vertiefung zu sammeln, verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um die Aggregate und das umgebende Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung zu sammeln, und legen Sie sie in die entsprechenden konischen 15-ml-Röhrchen.
- Lassen Sie die Aggregate 10-15 Minuten ruhen und saugen Sie den Überstand ab.
- Legen Sie die Aggregate für 5 Minuten in das konische 15-ml-Röhrchen auf Eis. Nehmen Sie während des Abkühlens die 12-Well-Platte mit der nun polymerisierten Schicht 1 aus dem Inkubator.
Anmerkungen: Die Kühlung der Aggregate trägt dazu bei, eine vorzeitige Polymerisation des Layer-2-ECM zu verhindern. - Um eine Blasenbildung zu verhindern, resuspendieren Sie die Aggregate in 500 μl ECM und pipettieren Sie die ECM-Aggregatsuspension auf die bereits polymerisierte Schicht 1. Achten Sie darauf, Schicht 1 nicht zu berühren, und verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze, um Schicht 2 und die Aggregate vorsichtig in der Vertiefung zu verteilen.
- Stellen Sie den Teller für 2 h wieder auf 37 °C.
HINWEIS: Für eine effektive ECM-Polymerisation ist eine Inkubationszeit von 2 h erforderlich. Jede kürzere Zeit birgt die Gefahr, dass die ECM-Integrität beeinträchtigt wird, und kann eine starke Haftung zwischen Schicht 1 und Schicht 2 verhindern. - Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes (37 °C) Keimmedium hinzu (Schritt 1.6), um eine Differenzierung der Blutgefäße zu induzieren. Keimende Gefäße müssen 1 bis 3 Tage nach dem Einbetten erscheinen. Wechseln Sie das Medium nach 3 Tagen und dann jeden zweiten Tag.
Anmerkungen: Das Keimmedium muss vorgewärmt werden; Andernfalls kann es zu einer Ablösung der Schicht kommen, und die Integrität des Motorsteuergeräts (ECM) kann beeinträchtigt werden.
7. Tag 11 - Isolation und Reifung der BVOs
- Verwenden Sie unter sterilen Bedingungen das abgerundete Ende eines sterilen Spatels, um die EZM-Sprossungsmatrix zu lösen, die die Gefäßnetzwerke enthält. In diesem Stadium muss das Gel einer frei schwebenden Scheibe ähneln.
- Übertragen Sie die Gelscheibe (einschließlich der Gefäßnetze) vorsichtig mit einer sterilen Pinzette und dem abgerundeten Ende eines sterilen Spatels auf den Deckel einer 10-cm-Kulturschale.
- Legen Sie den Deckel und das Gel unter ein Stereomikroskop, das auf die gewünschte Vergrößerung und den gewünschten Fokus eingestellt ist, und schneiden Sie mit sterilen Nadeln einzelne Blutgefäßnetzwerke heraus, um die Menge der dabei erhaltenen nicht-vaskularisierten EZM zu begrenzen.
HINWEIS: Die Zellen bauen das umgebende ECM im Laufe der Zeit auf natürliche Weise ab. Die Reduzierung der Menge, die mit jedem Organoid herausgeschnitten wird, erhöht jedoch die Bildqualität und die Integrität des Netzwerks der freistehenden Gefäße. - Sobald alle Organoide aus dem Gel isoliert wurden, übertragen Sie sie vorsichtig zurück in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit extrem niedriger Befestigung und 3 ml Keimmedium. In diesem Stadium können die Organoide über Nacht belassen werden, oder man kann sofort mit Schritt 7.4 fortfahren.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um einzelne Organoide von der 6-Well-Platte in die Wells einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz zu übertragen. Nach dem Transfer werden 200 μl vorgewärmtes (37 °C) Keimmedium in jede Vertiefung der 96-Well-Platte gegeben.
HINWEIS: Eine Vertiefung mit vaskulären Organoiden von einer 12-Well-Platte muss 30-40 Wells einer 96-Well-Platte füllen. - Stellen Sie 4-6 Tage nach der Isolierung in den 96-Well-Platten sicher, dass die Organoide eine runde und gesunde Morphologie besitzen. In diesem Stadium sind die Organoide bereit, fixiert und für die Färbung vorbereitet zu werden.
8. Tag 15 - Fixierung, Blockierung und Färbung der BVOs
- Übertragen Sie die Organoide mit einer abgeschnittenen 1-ml-Spitze in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Achten Sie darauf, die Aspiration von BVOs zu vermeiden, verwenden Sie eine 200-μl- oder 1.000-μl-Pipette, um das verbleibende Keimmedium im Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, und fügen Sie dann 1 h lang 1 ml 4%iges PFA in PBS hinzu.
Anmerkungen: Die Fixierung auf einem Orbitalschüttler (125 U/min) bei Raumtemperatur wird empfohlen. Maximal 60 BVOs/Mikrozentrifugenröhrchen sind akzeptabel. Weitere BVOs beeinträchtigen die Fixierung und Waschwirksamkeit.
ACHTUNG: PFA ist eine schädliche Chemikalie. Verwenden Sie es mit Vorsicht in einem Abzug und befolgen Sie die Gebrauchsanweisung des Herstellers und geeignete Entsorgungsmethoden. - Waschen Sie die neu fixierten BVOs 3x für jeweils 15 min mit 0,25% PBS-Tween.
- Wenn die Organoide einen Durchmesser von mehr als 1 mm haben, permeabilisieren Sie die BVOs mit 1% Triton X-100 in PBS für 30-60 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie das gesamte 0,25%ige PBS-Tween und fügen Sie 1 ml Blockierungspuffer hinzu (Schritt 1.7).
HINWEIS: Obwohl antikörperabhängig, reichen 2 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler (125 U/min) aus, um die unspezifische Antikörperbindung während des Färbeprozesses zu reduzieren. Die Organoide können bis zu 2 Wochen bei 4 °C im Blockierpuffer belassen werden. - Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie den primären Antikörper (1:100) in 1 ml des Blockierungspuffers verdünnt hinzu. Über Nacht bei 4 °C in einem Orbitalschüttler (12 U/min) aufbewahren, wobei darauf zu achten ist, dass das/die Organoid(e) in die primäre Antikörperlösung getaucht bleibt.
HINWEIS: Die Inkubation der primären Antikörper über Nacht ist für die für diese Studie verwendeten Antikörper geeignet. Die erforderlichen Primär- und Sekundärantikörper und ihre jeweiligen Verdünnungen sind in der Materialtabelle aufgeführt. - Nach der Inkubation des primären Antikörpers über Nacht wird die primäre Antikörperlösung entfernt und jedes Mal 3x 15 Minuten lang mit 0,25 % PBS-Tween gewaschen.
- Sekundärantikörper (1:250) plus DAPI (1:1.000) in 1 ml Blockierungspuffer verdünnt zugeben und 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Bei korrekter Vorbereitung der Proben (wie oben beschrieben) ist eine Inkubation von 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht für die in dieser Studie verwendeten Antikörper geeignet. - Entfernen Sie nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie sie 3x für jeweils 15 Minuten mit 0,25 % PBS-Tween.
HINWEIS: Nach der Färbung können die Organoide bis zu 2 Wochen in PBS aufbewahrt werden.
9. Montage der Blutgefäß-Organoide (BVOs)
- Kleben Sie Montageabstandshalter auf die gewünschten bebilderten Deckgläser (siehe Materialtabelle).
- Verwenden Sie eine abgeschnittene 1-mm-Pipettenspitze, um einzelne Organoide mit einer 1-ml-Pipette in die Spacer-Wells zu transferieren und das verbleibende PBS abzusaugen.
- Füllen Sie die Vertiefung mit 150-200 μl Reinigungslösung (siehe Materialtabelle), die auf 75 °C erhitzt wurde, und tauchen Sie das Organoid vollständig ein.
Anmerkungen: Die Proben sollten innerhalb von 1 Stunde nach dem Kontakt mit der erwärmten Reinigungslösung klar werden.- Lassen Sie die Organoide in einer abgedeckten Box im Dunkeln bei Raumtemperatur 6 h bis über Nacht klar werden, wenn die 1-stündige Räumzeit nicht ausreicht. Wenn Sie die Probe über Nacht stehen lassen, stellen Sie sicher, dass sie genügend Reinigungslösung enthält, um ein Austrocknen zu vermeiden.
- Nach dem Clearing wird die Clearing-Lösung vorsichtig mit einer 100-200 μL Pipettenspitze abgesaugt. Manövrieren Sie das Organoid vorsichtig in die Mitte der Abstandsvertiefung und fügen Sie Tropfen Eindeckgel (siehe Materialtabelle) hinzu (in einem kontrollierten Heizblock auf 75 °C erwärmt), bis die Vertiefung voll ist.
- Legen Sie das zweite Deckglas vorsichtig auf den Montageabstandshalter, um die Proben im Raum zwischen dem unteren und dem oberen Deckglas zu versiegeln. Lassen Sie das Montagegel im Dunkeln bei 4 °C über Nacht aushärten.
Anmerkungen: Nach dem Aushärten kann Topcoat-Nagellack verwendet werden, um die eingefassten Proben weiter zu versiegeln.
Representative Results
Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte wurden speziell entwickelt, um eine kontrollierte und präzise Methode zur Erzeugung menschlicher Blutgefäßorganoide aus hPS-Zellen zu entwickeln. Die Erzeugung von Aggregaten mit einem Durchmesser von 30-100 μm aus hPSC-Kulturen markiert den Ausgangspunkt des Protokolls (Abbildung 1, Abbildung 2B). Die Aggregate werden vor der Einbettung (Tag 6) schrittweise in Richtung Mesoderm (Tag 1-Tag 4) und Gefäßlinien (Tag 4-Tag 6) geleitet (Abbildung 2A-D), was für die Bildung eines Gefäßnetzwerks notwendig ist. Der nahezu radial symmetrische Gefäßaustrieb muss bei d7 oder d8 sichtbar sein (Abbildung 2E) und sich bis d10 fortsetzen (Abbildung 2F,G). Die Explantation der hBVOs aus der ECM in die 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platten reduziert die Zerbrechlichkeit der Keimnetzwerke und ermöglicht eine kontinuierliche Aufrechterhaltung unter Suspensionskulturbedingungen (Abbildung 2H) für bis zu 6 Monate. Bei d15 weisen die hBVOs ein ausgedehntes und verbundenes Endothelnetzwerk (CD31+) auf, das von Perizyten (PDGFR-ß+) und Aktin der glatten Muskulatur (SMA+) umgeben ist (Abbildung 3A-D). Eine kontinuierliche Kollagen-IV-Basalmembran (ColIV+) umhüllt die Gefäßnetzwerke (Abbildung 3E). Endothelzellen (CD31+, VE-Cadherin+) und Perizyten (PDGFR-ß+) machen etwa 30%-35% bzw. 60%-65% der Organoidzellpopulationen aus8. Die aktive Sprossung der Gefäße erfolgt unter der Leitung einer endogen organisierten Spitzenzellpopulation (CD31+), die sich mit einer typischen Spitzenzellmorphologie, wie z.B. übermäßigen Filipodien, aufweist 8,10. Die Präsentation von PDGFR-ß+ und SMA+ Wandzellen, die die endothelialen Gefäßnetzwerke einkapseln, kann durch d15 des Organoid-Reifungsprozesses gesehen werden (Abbildung 3A,C). Nach der Entfernung aus der EZM und der Reifung in einer Suspensionskultur (d.h. d15) sind die hBVOs für entsprechende Analysen oder die Transplantation unter die Nierenkapsel der Maus haltbar.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des hBVO-Protokolls mit Hervorhebung des zeitlichen Ablaufs und des schrittweisen Verlaufs. Aus scheinbar homogenen hPSC- oder hiPSC-Kulturen kommt es in Gegenwart des Rho-Kinase-Inhibitors Y27632 zur Aggregatbildung. BMP4 und CHiR-supplementiertes Medium wird verwendet, um die Aggregate in Richtung des mesodermalen Schicksals zu instruieren. Das Mesoderm-Induktionsmedium wird durch VEGFA und Forskolin-supplementiertes Medium ersetzt, um die Aggregate in Richtung einer vaskulären Linie zu stimulieren. Mechanische und chemische Warteschlangen, die durch die Einbettung der Aggregate in eine Kollagen-I- und solubilisierte Basalmembranmatrix und die Exposition gegenüber VEGFA- und FGF2-haltigem Medium erreicht werden, führen zu einem nahezu radial symmetrischen vaskulären Spross aus dem Aggregatkörper. Die erzeugten Gefäßnetzwerke können aus dem Kollagen I und der solubilisierten Basalmembran entfernt und zur weiteren Reifung, Analyse oder Transplantation in vivo in Suspensionskultur gebracht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schrittweise Progression der hBVO-Erzeugung, aufgenommen unter Hellfeld. (A) Typische Morphologie von hPSC (H9)-Kolonien an Tag −1. (B) Erzeugung von hPSC-Aggregaten (Tag 0) auf 6-Well-Ultra-Low-Attachment-Platten in Gegenwart von Y-27632. (C) Die mesodermale Induktion von Aggregaten unter Verwendung von BMP4 und ChiR-supplementiertem Medium (Tag 1). Subtile Veränderungen in der Größe und Form der Aggregate können ebenfalls beobachtet werden. (D) Tag-4-Aggregate, die unter Verwendung von VEGFA und Forskolin-supplementiertem Medium auf eine vaskuläre Linie vorbereitet wurden. (E) Frühes Keimen des Gefäßes an Tag 7, einen Tag nach Einbettung der Aggregate in die Keimmatrix und Exposition gegenüber VEGFA und FGF2-supplementiertem Keimmedium (Tag 7). (F) Gesunde organoide Morphologie und anhaltendes Gefäßkeimen an Tag 9. (G) Sprossung des Gefäßes im Spätstadium am 10. Tag. Im Idealfall sind die dichten Zellstrukturen im Organoidzentrum zu diesem Zeitpunkt verschwunden. (H) Typische Morphologie reifer (Tag 15) menschlicher Blutgefäßorganoide. Das Entfernen der umgebenden Matrix durch Schneiden und Reifung in 96-Well-Kulturplatten mit extrem niedrigem Aufsatz formt die Organoide kugelförmig, wobei die Gefäßnetzwerke intern untergebracht sind. Maßstabsbalken: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Whole-Mount-Färbung von reifen (Tag 15) menschlichen Blutgefäß-Organoiden. (A) Darstellung von reifen (Tag 15) menschlichen Blutgefäß-Organoiden mit selbstorganisierten endothelialen (CD31+, magenta) Netzwerken und umgebender Perizyte (PDGFR-β+, cyan) und alpha-glattem Muskelaktin (SMA+, gelb). (B) Höhere Vergrößerung von A, die die SMA+ (gelb) und PDGFR-β+ (cyan) Ausprägung der Gefäßnetzwerke detailliert beschreibt. (C) Detaillierte Darstellung der Interaktion zwischen Endothel (CD31+, Magenta), Perizyten (PDGFR-β+, Cyan) und Alpha-Glattmuskel-Aktin (SMA+, gelb). (D) Whole-Mount-Färbung der Interaktion zwischen Gefäßendothel (CD31+, magenta) und glatter Muskulatur (SMA+, gelb) in einem Querschnitt (links) und einer höheren Vergrößerung (rechts) von reifen Blutgefäßorganoiden. (E) Selbstgesteuerte Bildung einer vaskulären Basalmembran (Col IV+, Graustufen) durch die enge Assoziation von Wandzellen und Endotheltuben. Maßstabsbalken: (A,D[links]) 100 μm; (B,D[rechts],E) 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Jüngste Durchbrüche bei Stammzell-abgeleiteten Organoidkulturen haben den Rahmen für fortschrittlichere und physiologisch relevante Modelle des menschlichen Gefäßsystems geschaffen. Das hier vorgestellte Modell des humanen Blutgefäßorganoids (hBVO), das inunserem Labor 8,10 entwickelt wurde, bietet ein leistungsfähiges Mittel, um nicht nur weitere Aspekte der menschlichen Vaskulogenese, sondern auch neue Wege der Krankheitsmodellierung und regenerativen Therapie zu erforschen 8,10,11. Mehrere In-vivo-Modelle wurden verwendet, um die Entwicklung und Reifung von Blutgefäßen, Gefäßerkrankungen und endotheliale Dysfunktionen zu untersuchen 3,4. Unterschiedliche Ansätze kombinieren einzelne und mehrere liniendefinierte Zellen, die entweder aus Stammzellen gewonnen oder in vivo aus adultem Gewebe isoliert wurden, um replikative menschliche Gefäßnetzwerke zu schaffen 5,6. Das hier vorgestellte Protokoll nutzt das Prinzip der Entwicklungsbiologie und Selbstorganisation, um die ersten menschlichen Blutgefäßnetzwerke mit mehreren Zellen zu erzeugen, die im Wesentlichen aus einem einzigen hPSC 8,10 generiert werden können.
Jede Stammzelllinie hat eine einzigartige genetische Ausstattung und unterscheidet sich von anderen in Bezug auf ihre Beschaffung, Funktion und Reaktionsfähigkeit15. Daher wurde das Protokoll für humane Blutgefäß-Organoide (hBVOs) entwickelt und optimiert, um eine robuste und reproduzierbare Protokollkompatibilität mit mehreren (>12) verschiedenen hPSC-Linienzu gewährleisten 8,10. Die hier beschriebene Methode erzeugt über einen Zeitraum von 2 Wochen hPSC-abgeleitete Blutgefäßorganoide. Änderungen der Medienzusammensetzung und/oder der Techniken bei der hBVO-Erzeugung können jedoch zu einer ineffektiven Gefäßvernetzung und Organoiderzeugung führen. Die unterschiedlichen Proliferationsraten einzelner Stammzelllinien wirken sich auch deutlich auf die Reproduzierbarkeit von Stammzellexperimenten15 und damit von Organoidkulturen aus. Zum Beispiel unterliegen bei der Erzeugung der BVOs proliferativere Zellen oder eine höhere Anzahl großer Tag-1-Aggregate von Natur aus unterschiedlichen Stoffwechselumgebungen und Gas- und Nährstoffdiffusionsparametern. Dies wiederum verändert die Expositionszeiten und -effizienzen des Wachstumsfaktors, den Grad der Differenzierung und des vaskulären Primings und vor allem die Fähigkeit, Gefäßnetzwerke zu bilden, wenn die Aggregate in die Kollagen-1- und solubilisierte Basalmembranmatrix eingebettet werden.
Die passive Diffusion von Sauerstoff und die Verabreichung essentieller Nährstoffe aus der äußeren Umgebung ist nicht ideal für das langfristige Zellwachstum von 3D-Organoiden und die Gewebemorphogenese in vitro16. Obwohl dies von mehreren Faktoren abhängt (z. B. der Stoffwechselrate des Gewebes, der Bioverfügbarkeit von Nährstoffen und Gasen, einer statischen oder dynamischen Umgebung), wurde für in vitro kultivierte Gewebe ein allgemeiner Grenzwert von 150 μmO2 und Nährstoffdiffusion festgelegt, da menschliche Gewebe physiologisch gesehen Stränge lebender Zellen innerhalb von 150 μm von perfundierten Blutgefäßen aufweisen17. Obwohl auch effektive Gas- und Nährstoffdiffusionsabstände von 70-200 μm vorgeschlagen wurden18,19,20,21, haben die Konstruktdichte, die Temperatur, der pH-Wert und die Medienzusammensetzung einen signifikanten Einfluss auf die Diffusionseffizienz. Aufgrund der Oberflächenoptimierung und der Integrin-beta-Rezeptor-Kommunikation nach der Einbettung am Tag 6 schneiden Aggregate mit einem Durchmesser von 250-300 μm besser ab als solche mit einem Durchmesser von >500-600 μm, was zu einem vollständigen Gefäßkeimungsprozess und einem minimal kondensierten Organoidkern führt. Daher ist die Aggregatgröße entscheidend und kann sowohl von der Anzahl der Zellen, die während der ersten Aussaat verwendet werden, als auch von der für die Aggregatbildung vorgesehenen Zeit beeinflusst werden. Mikrotiterplatten, die eine Kontrolle über die Aggregatgröße und die Anzahl22 ermöglichen, sind eine praktikable Alternative zu der ansonsten stochastischen Aggregatbildungstechnik, die sich aus der Verwendung von 6-Well-Platten mit extrem niedriger Bindung in diesem Protokoll ergibt. Die Konsistenz des Timings und des Managements der Aggregatgrößen während der ersten 6 Tage des hBVO-Protokolls ist einer der, wenn nicht sogar der wichtigste Indikator für die erfolgreiche Entwicklung von echten Blutgefäßorganoiden.
Mediumwechsel an Tag 1 (Mesoderm-Induktion) und Tag 4 (vaskuläre Induktion) müssen in Kombination mit der Sedimentation der Aggregate abgeschlossen werden. Obwohl die Zentrifugation eine verlockende Alternative ist, können die zusätzlichen Kräfte, die auf die schwach zusammengesetzten Aggerate ausgeübt werden, zu unerwünschter Verklumpung, Assemblierung und Scherung führen, was sich negativ auf die Differenzierung, Reifung und Keimungseffizienz in den späteren Phasen des Protokolls auswirkt. Die Arbeit auf Eis während des Einbettprozesses von Tag 6 ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer ordnungsgemäßen ECM-Polymerisation und Schichtbildung. Während der Einbettung und Induktion von Aggregaten wirkt sich die Exposition des ECM bei Temperaturen über 4 °C und/oder einem anderen ECM-pH-Wert als 7,4 nicht nur auf die Polymerisationsraten und die Integrität der ECM-Schicht, sondern auch auf die Keimeffizienz der eingebetteten Aggregate aus. Die elastische Beschaffenheit der ECM-Sprossenmatrix ermöglicht ein einfaches Abnehmen und Transportieren von der 12-Well-Kulturschale zur sterilen Schneidefläche. Einzelne Organoide, die aus der Matrix entfernt und auf 96-Well-Platten mit extrem niedriger Anhaftung übertragen werden, verbrauchen die verbleibende umgebende EZM und behalten selbstorganisierte, mit Wandzellen beschichtete endotheliale Mikrogefäßnetzwerke mit einer durchgehenden Basalmembran bei.
Obwohl sie in diesem Vorschlag nicht behandelt werden, können Veränderungen in der Medienzusammensetzung Krankheiten replizieren, die wiederum pathologische Reaktionen in hBVOs hervorrufen 8,11. Die Grenzen der Krankheitsmodellierung mit dem hBVO-System sind alles andere als bekannt, und dies ist sicherlich ein Bereich, der erforscht werden muss. Die Anwendung unserer Blutgefäß-Organoid-Technologie bei der Vaskularisierung von zuvor avaskulären Organoidkonstrukten23 ist ebenfalls von erheblicher Bedeutung und Interesse.
Disclosures
Es besteht kein Zusammenhang zwischen den finanziellen Interessen der Autorinnen und Autoren und der präsentierten Forschung. Die Blutgefäß-Organoid-Technologie wurde an Stemcell Technologies lizenziert. J.M.P. ist Gründer und Anteilseigner von Angios Biotech, das Organoide für Blutgefäße als Gefäßtransplantationstherapie entwickelt. Eine Patentanmeldung zu dieser Arbeit wurde unter Patent-Nr. US20200199541A1, in dem Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger und Dontscho Kerjaschki als Erfinder aufgeführt sind.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern unserer Labore für kritische Anregungen und Diskussionen. JMP wurde von der T. von Zastrow-Stiftung, dem Wittgenstein-Preis des FWF (Z 271-B19), der Österreichischen Akademie der Wissenschaften, dem Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, dem Allen Institute Distinguished Investigator Program und dem Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 sowie den Canadian Institutes of Health Research COVID-19 Grants F20-02343 und F20-02015 gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
| 7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
| Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
| Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
| Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
| Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
| Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
| BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
| CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
| CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
| Cellulose wipes | |||
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
| CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
| Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
| Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
| Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | |||
| Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
| Eppendorf tubes | |||
| Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
| Fine forceps | FST | 11254-20 | |
| Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
| Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
| Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
| KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
| PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
| PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
| Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
| PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
| RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
| Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
| SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
| Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
| Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
| Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
| StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
| Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
| Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
| Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 |
References
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