Summary
Bu protokol, insan pluripotent ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kendi kendini organize eden kan damarlarının oluşumunu tanımlar. Bu kan damarı ağları, perisitler, düz kas aktini ve sürekli bir bazal membran ile çevrili geniş ve bağlı bir endotel ağı sergiler.
Abstract
Bir organoid, karşılık gelen in vivo organını taklit eden, bir doku kültürü kabında bu organın tanımlanmış yönlerini incelemek için kullanılabilecek şekilde tasarlanmış çok hücreli in vitro doku olarak tanımlanır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) kaynaklı organoid araştırmalarının genişliği ve uygulaması, diğer birçok dokunun yanı sıra beyin, retina, gözyaşı kanalı, kalp, akciğer, bağırsak, pankreas, böbrek ve kan damarlarını içerecek şekilde önemli ölçüde ilerlemiştir. Özellikle insan mikrodamarlarının üretimi için yöntemlerin geliştirilmesi, insan kan damarı gelişimini ve hastalığını in vitro olarak modellemenin ve SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere virüs enfeksiyonlarında yeni ilaçların veya doku tropizminin test edilmesinin ve analiz edilmesinin yolunu açmıştır. Görsel rehberlikten yoksun karmaşık ve uzun protokoller, birçok kök hücre kaynaklı organoidin tekrarlanabilirliğini engellemektedir. Ek olarak, organoid oluşum süreçlerinin ve öz-organizasyonun doğal stokastikliği, hücre kaderi edinimi ve programlamasının anlaşılmasını ilerletmek için optik protokollerin oluşturulmasını gerektirir. Burada, hPSC'lerden tasarlanan 3D insan kan damarı organoidlerinin (BVO'lar) üretilmesi için görsel olarak yönlendirilen bir protokol sunulmaktadır. Sürekli bir bazal membran, vasküler endotel hücreleri ve duvar hücreleri ile organize artikülasyon sunan BVO'lar, insan mikrovaskülatürünün fonksiyonel, morfolojik ve moleküler özelliklerini sergiler. BVO oluşumu agrega oluşumu ile başlatılır, bunu mezoderm ve vasküler indüksiyon izler. Vasküler olgunlaşma ve ağ oluşumu, agregaların 3D kollajen ve çözünür bazal membran matriksine gömülmesiyle başlatılır ve desteklenir. İnsan damar ağları 2-3 hafta içinde oluşur ve ölçeklenebilir kültür sistemlerinde daha da büyütülebilir. Önemli olarak, BVO'lar endojen fare dolaşımı ile immün sistemi baskılanmış fareler anastomozuna nakledilir ve fonksiyonel arterlere, damarlara ve arteriollere dönüşür. Mevcut görsel olarak yönlendirilen protokol, özellikle normal gelişim, doku vaskülarizasyonu ve hastalıktaki kan damarları ile ilgili olarak insan organoid araştırmalarını ilerletecektir.
Introduction
Vasküler disfonksiyon ve kan damarı hastalıkları organ fonksiyonlarında belirgin komplikasyonlarla kendini gösterir. Kardiyovasküler hastalık (KVH) dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir1 ve aynı zamanda Amerika Birleşik Devletleri'nde sağlık maliyetlerinin artmasına katkıda bulunan birincil faktördür. KVH vaka sayıları her yıl artmakta ve bu vakaların artan sayıları genç yaş gruplarında (20-45 yaş) meydana gelmektedir2. Kan damarlarının gelişimini ve olgunlaşmasını, vasküler hastalığı ve endotel disfonksiyonunu araştırmak için çoklu in vivo modeller geliştirilmiştir 3,4. Şu anda, kök hücrelerden türetilen veya in vivo yetişkin dokulardan izole edilen tek ve çoklu soy tanımlı hücreleri birleştiren yöntemler, insan vasküler fonksiyonunun ve anatomisinin yönlerini çoğaltan vasküler ağlar oluşturabilir 5,6. Kan damarları, mezodermden gelişim sırasında ilk fonksiyonel sistemlerden biri olarak ortaya çıkmıştır ve ya "vaskülogenez" adı verilen bir montaj süreci yoluyla ya da "anjiyogenez"7 olarak adlandırılan önceden var olan damarlardan genişleme ve dallanma yoluyla organize olurlar.
Gelişimsel biyolojinin ve kendi kendini yöneten montajın gücünden yararlanan Wimmer ve ark., insan mikrovaskülatürünün işlevsel, morfolojik ve moleküler özelliklerini sergileyen hPSC'lerden ilk kendi kendini organize eden 3D insan kan damarı organoidlerini bildirmiştir8. İnsan vaskülatürü9'a benzer şekilde, bu hBVO'lar bir endotel, sürekli bir bazal membran ve çevreleyen duvar hücreleri 8,10 ile üretilir ve sunulur. hBVO'lar in vivo olarak nakledilebilir ve endojen dolaşım ile anastomoz edilebilir. Ayrıca in vitro olgunlaşmaya uğrayabilir ve kardiyovasküler hastalıklar (yani diyabet)8 veya SARS-CoV-211 gibi virüs enfeksiyonlarında doku tropizmi için model olarak hizmet edebilirler. Daha önce yazılı bir protokol10 yayınlamış olsak da, bu aksi takdirde karmaşık teknik için mevcut bir video protokolü yoktur.
Kısa ve kademeli bir ilerleme ile hBVO oluşumu, agrega oluşumu, bir WNT agonisti olan Chiron (CHIR99021) ve kemik morfojenik proteini - 4 (BMP4)12,13 kullanılarak mezoderm indüksiyonu, vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGFA) ve Forskolin (Fors)12 yoluyla vasküler indüksiyon ve özel bir filizlenme matrisine gömülerekgerçekleştirilir 8,10. Vasküler olgunlaşma ve ağ oluşumu, agregaların filizlenme matrisine gömülmesini takip eder. Bu insan damarı ağları 2-3 hafta içinde oluşur ve filizlenme matrisinden çıkarılabilir ve 6 aya kadar ölçeklenebilir kültür sistemlerinde daha da büyütülebilir. Burada, insan kök hücre kaynaklı vaskülatürünün oluşumu ve uygulanması için optik olarak yönlendirilen prosedürler sağlanmaktadır.
Protocol
Burada yapılan tüm deneylerde ticari olarak temin edilebilen H9 insan iPSC hattı kullanılmıştır. Ticari olarak yaygın ve ticari olarak temin edilemeyen insan pluripotent kök hücre hatları (yani, H9, NC8) de bu protokolü kullanarak insan kan damarı organoidlerinin üretimi için test edilmiş ve etkili olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıntılar için lütfen daha önce yayınlanmış 8,10 numaralı raporlarımıza bakın.
1. İnsan kan damarı organoidlerinin üretimi için medya ve reaktif formülasyonu
- Toplama ortamını hazırlayın.
- 40 mL nakavt DMEM/F12 (insan ESC ve iPSC büyümesi için optimize edilmiş L-glutamin veya HEPES tamponu içermeyen düşük ozmolalite ortamı), 10 mL nakavt serum replasmanı (KOSR), %0,85 NaCl içinde 0,5 mL 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi, 0,5 mL esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 35 μL beta-merkaptoetanol (BME, 10 mL steril PBS içinde 100 μL 2-merkaptoetanol), ve Y-27632 (1:200'de Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren protein kinaz [ROCK]14 [10 mM] hücre geçirgen ve seçici inhibitörü) (bkz.
- N2B27 (N2 ve B27 takviyeli temel ortam) hazırlayın.
- 25 mL DMEM / F12, 25 mL nörobazal ortam, 1 mL B27 takviyesi, 0.5 mL N2 takviyesi, 250 μL 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi% 0.85 NaCl ve 35 μL beta-merkaptoetanol karıştırın (bkz.
- Mezoderm indüksiyon ortamını hazırlayın.
- ChiR (12 μM, mezoderm indüksiyonunu uyaran GSK3a / b inhibitörü) ve BMP-4 (30 ng / mL, mezoderm soyunu indükleyen MSX2 aktivatörü) ile N2B27 besiyeri takviyesi.
NOT: Stok (ChiR): 10 mM (1:833 veya 1,2 μL/mL N2B27 kullanın). Stok (BMP-4): 100 μg/mL (1:3333 veya 0,3 μL/mL N2B27 kullanın) ( bkz.
- ChiR (12 μM, mezoderm indüksiyonunu uyaran GSK3a / b inhibitörü) ve BMP-4 (30 ng / mL, mezoderm soyunu indükleyen MSX2 aktivatörü) ile N2B27 besiyeri takviyesi.
- Vasküler indüksiyon ortamını hazırlayın.
- N2B27 ortamını VEGFA (100 ng / mL) ve forskolin (2 μM) ile tamamlayın ( bkz.
- Hücre dışı matrisi (ECM) hazırlayın.
- 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için 1 mL ECM kullanın (30-50 agrega gömmek için). Her bir kuyu için kullanılan 1 mL ECM çözeltisinden, bir alt katman oluşturmak için 0,5 mL, ECM temeli olarak hizmet edecek "katman 1" ve üst katman "katman 2" için 0,5 mL artı agregalar kullanın. Bu yaklaşımın kullanılması, ECM süspansiyonu aracılığıyla, insan kan damarı ağlarının her yönde filizlenmesi için yeterli alan ve destek sağlar.
NOT: Genel olarak, 1 mL ECM, 500 μL saflaştırılmış sığır kollajen tip I, Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu hücreleri tarafından salgılanan 250 μL çözünür bazal membran matrisi (bakınız Malzeme Tablosu) ve 250 μL bazik matris çözeltisi (adım 1.5.2) içerir. Taze hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar buzda tutun. - Dört adet 12 kuyucuklu plaka (48 kuyucuk) için temel matris çözeltisini hazırlamak için, 5,627 mL 0,1 N NaOH, 2,498 mL 10x DMEM, 473 μL HEPES, 368 μL% 7,5 sodyum bikarbonat, 233 μL 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi% 0,85 NaCl ve 3,451 mL Ham'ın F-12'sini karıştırın (bkz.
NOT: Artık bazik matris çözeltisi, kapaklı 50 mL yüksek netlikli polipropilen konik tüpe yerleştirilebilir ve 2 aya kadar kullanım için 4 ° C'de saklanabilir.
- 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için 1 mL ECM kullanın (30-50 agrega gömmek için). Her bir kuyu için kullanılan 1 mL ECM çözeltisinden, bir alt katman oluşturmak için 0,5 mL, ECM temeli olarak hizmet edecek "katman 1" ve üst katman "katman 2" için 0,5 mL artı agregalar kullanın. Bu yaklaşımın kullanılması, ECM süspansiyonu aracılığıyla, insan kan damarı ağlarının her yönde filizlenmesi için yeterli alan ve destek sağlar.
- Filizlenme ortamını hazırlayın.
- İnsan hematopoetik hücrelerinin gelişimini desteklemek için 50 mL esnek serumsuz ortam (SFM), esnek serumsuz orta besin takviyesinin 1.3 mL aliquot'u, % 15 fetal sığır serumu (FBS), 250 μL penisilin-streptomisin, 500 μL'si 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi% 0.85 NaCl, VEGFA (100 ng / mL) ve FGF2'de (100 ng / mL) spesifik olarak formüle edin (bkz.
- Engelleme arabelleğini hazırlayın.
- 0,5 g sığır serum albümini, 1,5 mL fetal sığır serumu, 250 μL Tween 20, 250 μL Triton X-100, 500 μL sodyum deoksikolat (%1 ağırlık/hacim stoğu) ve 47,5 mL 1x fosfat tamponlu salin karıştırın (bkz. Tüm bileşenler iyi bir şekilde birleştirilene ve çözüm netleşene kadar pipeti yukarı ve aşağı çekin.
2. İnsan pluripotent ve indüklenmiş pluripotent kök hücrenin bakımı ve kültürü
- LDEV'siz indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi (1:50 seyreltme) ile kaplanmış kök hücre kültürü ortamına sahip 6 kuyucuklu doku kültürü plakaları kullanarak hücre kültürü gerçekleştirin (bkz.
- Hücreler ~% 70 akıcılığa ulaştığında, 37 ° C'de 3-4 dakika boyunca 1 mL memeli hücresi ayrışma enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak onları geçirin.
NOT: Hücrelerin 1: 6 oranında bölünmesi, hücre canlılığını arttırır ve çoğu insan kök hücre hattı için 2-4 gün içinde akıcılık sağlar. Hücre canlılığını arttırmak için, ROCK inhibitörü Y-27632 takviyeli (10 mM, 1: 1.000) kültür ortamı, geçiş sonrası 24 saat boyunca kullanılır. - Kültür ortamını% 70'lik bir akıcılığa ulaşana kadar günlük olarak değiştirin.
NOT: Bu çalışma için,% 70 akıcılıkta, 6 delikli bir hücre kültürü plakasının bir kuyusu yaklaşık 1 milyon H9 hPSC içerir.
3. Gün 0 - Tek hücreli bir süspansiyondan pluripotent agregaların üretilmesi
NOT: 6 delikli bir kültür plakasının iki kuyucuğunda %70'lik bir akıntı, yaklaşık 175 hBVO verecektir.
- Bir pipet veya vakum sistemi kullanarak, kültür ortamını aspire edin, 1 mL hücre ayrışma reaktifi ile değiştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Hücreler hücre ayrışma reaktifi altındayken, 6 kuyucuklu ultra düşük bir bağlantı kültürü plakasında istenen sayıda kuyucuk için gerektiği gibi 15 mL'lik bir konik tüpte gerekli miktarda toplama ortamını (adım 1.1) hazırlayın (bkz.
- 1 mL hücre ayrışma reaktifini aspire edin ve hücreleri 1 mL agregasyon ortamında askıya alın. Numuneleri saymadan önce nazik yukarı-aşağı pipetleme ile tek hücreli bir süspansiyon oluşturun.
DİKKAT: hPSC'ler mekanik strese karşı oldukça hassastır ve agresif pipetlemeye tolerans gösteremez. - Otomatik bir hücre sayma cihazı10 veya mikroskop altında standartlaştırılmış bir sistem kullanarak hücreleri sayın. Deneme için gereken hücre numarasını hesaplayın.
NOT: Hücre hattına bağlı olarak, 200.000 hücre/kuyu ila 300.000 hücre/kuyu agrega oluşumu için ideal kabul edilir (yani, 4 kuyucuk = toplamda 800.000 ila 1.200.000 hücre). - Hücre süspansiyonunun uygun hacmini, 15 mL'lik yüksek berraklıktaki polipropilen konik tüpteki toplama ortamına ekleyin. Homojen bir hücre dağılımı sağlamak için seyreltilmiş hücre süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı pipetinleyin.
- Pipet, seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 3 mL'sini, 6 delikli ultra düşük bağlantı kültürü plakasının istenen her bir kuyucuğuna yerleştirin.
- Plakayı inkübatöre yerleştirin (37 ° C,% 5 CO2,% >90 nem) ve inkübatör kapılarını mümkün olduğunca açıp kapatmaktan kaçının.
NOT: Bu ilk adım en iyi akşamları veya düşük inkübatör trafiğinde tamamlanır. Hafif titreşimler bile agregaların boyutunu ve şeklini etkileyebilir ve bu da sonuçları bozabilir.
4. Gün 1 - Agregaların mezoderm indüksiyonu
- Tohumlamadan 24 saat sonra, 2-10 hücreden oluşan küçük agregaların mikroskop altında görülebildiğinden emin olun. Agregaları toplayın ve ortamı mezoderm indüksiyon ortamına değiştirmeden önce yerleşmelerine izin verin (adım 1.3).
- 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı kültürü plakasının kuyucuğu başına bir adet 15 mL yüksek netlikte polipropilen konik tüp kurun.
- Agregaları her bir kuyucuğun merkezinde toplamak için dairesel bir hareket (yani yörüngesel çalkalayıcı gibi) kullanın, agregaları ve çevresindeki ortamı her bir kuyudan nazikçe toplamak için 1 mL'lik bir pipet kullanın, bunları karşılık gelen 15 mL yüksek netlikli polipropilen konik tüplerine yerleştirin ve agregaların oda sıcaklığında çökelmesine izin verin.
- Toplandıktan sonra, çoğu hücre hattının / agregasının bu aşamada tortulanması için gereken süre olan 1 saat için bir zamanlayıcı ayarlayın.
NOT: Süre 1 saatten azsa, 15 mL konik tüpün dibine yerleşmemiş olabilecek agregalar kaybedilebilir. - Saat geçtikten sonra, dikkatli bir şekilde, süpernatantı bir pipet veya yüksek hassasiyetli bir aspire pompası ile aspire edin. Agregaların 15 mL konik tüpün dibinde bozulmadan kaldığından emin olun.
- Her 15 mL'lik konik tüpün agregalarını 2 mL mezoderm indüksiyon ortamında tekrar askıya alın ve 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı kültürü plakasının kendi kuyucuklarına geri yerleştirin.
- Plakayı inkübatöre (37 ° C) geri yerleştirin ve 4. güne kadar bırakın.
NOT: Agregalar birbirine yapışır ve büyürse, 1 mL'lik bir pipet kullanarak, agregaların boyut olarak benzer olmasını sağlamak için her bir agrega kuyucuğunu günde bir kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetin.
5. Gün 4 - Agregaların vasküler indüksiyonu ve astarlanması
- Agregaları toplayın ve ortamı vasküler indüksiyon ortamına değiştirmeden önce yerleşmelerine izin verin (adım 1.4).
- 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı kültürü plakasının kuyucuğu başına bir adet 15 mL konik tüp kurun.
- Agregaları her bir kuyucuğun merkezinde toplamak için dairesel bir hareket (yani yörüngesel çalkalayıcı gibi) kullanın, agregaları ve çevresindeki ortamı her bir kuyudan nazikçe toplamak için 1 mL'lik bir pipet kullanın ve bunları karşılık gelen 15 mL konik tüplerine yerleştirin.
- Toplandıktan sonra, agregaların çökelmesine izin vermek için 30 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın.
NOT: Bu aşamada çoğu hücre satırı için 30 dakikalık bir süre gereklidir. Süre 30 dakikadan azsa, 15 mL konik tüpün dibine yerleşmemiş olabilecek agregaları kaybetme riski vardır. - 30 dakika sonra, dikkatle, süpernatantı bir pipet veya yüksek hassasiyetli bir aspire pompası ile aspire edin. Agregaların 15 mL konik tüpün dibinde bozulmadan kaldığından emin olun.
- Her 15 mL'lik konik tüpün agregalarını 2 mL'lik vasküler indüksiyon ortamında tekrar askıya alın ve 6 kuyucuklu ultra düşük ataşman kültürü plakasının kendi kuyucuklarına geri yerleştirin.
- Plakayı inkübatöre (37 ° C) geri yerleştirin ve 6. güne kadar bırakın.
NOT: 1 mL'lik bir pipet kullanarak, agregaların boyut olarak benzer olmasını sağlamak ve birbirlerine yapışmalarını veya birbirlerine yapışmalarını önlemek için her bir agrega kuyucuğunu günde bir kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetin.
6. Gün 6 - Agrega gömme ve kap filiz indüksiyonu
- Buz üzerinde çalışırken, ECM çözeltisinin istenen son hacmini hazırlayın (adım 1.5).
NOT: Aşağıdakiler, gerektiğinde ayarlanabilen 12 delikli bir plakanın (30-50 agrega) bir kuyusu için protokoldür.- 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için, alt katman olarak 0,5 mL ECM uygulayın ve üst katmanda 0,5 mL ECM artı agregalar kullanın. Bu, etkili 3D agrega filizlenmesi için gerekli ECM "sandviçini" oluşturur.
- 500 μL ECM pipetini 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Kabarcık oluşmadığından ve kuyu alt ve yan menisküsünün tamamen kaplandığından emin olun. Bu, ECM sandviçinin 1. katmanını içerir.
- Plakayı 2 saat boyunca 37 ° C'ye geri yerleştirin.
NOT: Etkili polimerizasyon için 2 saatlik bir süre gereklidir. Daha kısa süre, ECM bütünlüğünü tehlikeye atma riski taşır. - Katman 1 polimerizasyonunun sonuna doğru, agregaları her bir kuyucuğun merkezinde toplamak için dairesel bir hareket kullanın, agregaları ve çevresindeki ortamı her bir kuyucuktan nazikçe toplamak için 1 mL'lik bir pipet kullanın ve bunları karşılık gelen 15 mL konik tüplerine yerleştirin.
- Agregaların 10-15 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve süpernatanı aspire edin.
- Agregaları 15 mL'lik konik tüpe 5 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Soğurken, şimdi polimerize edilmiş katman 1 ile 12 delikli plakayı inkübatörden çıkarın.
NOT: Agregaların soğutulması, katman 2 ECM'nin erken polimerizasyonunu önlemeye yardımcı olur. - Kabarcık oluşumunu önlemek için hızlı ve dikkatli bir şekilde çalışın, agregaları 500 μL ECM'de yeniden askıya alın ve ECM-agrega süspansiyonunu zaten polimerize edilmiş katman 1'in üzerine pipetinleyin. Katman 1'e dokunmamaya dikkat ederek, katman 2'yi ve agregaları kuyunun etrafına nazikçe dağıtmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın.
- Plakayı 2 saat boyunca 37 ° C'ye geri yerleştirin.
NOT: Etkili ECM polimerizasyonu için 2 saatlik bir inkübasyon süresi gereklidir. Daha kısa süre, ECM bütünlüğünü tehlikeye atma riski taşır ve katman 1 ile katman 2 arasında güçlü yapışmayı önleyebilir. - Kan damarı farklılaşmasını indüklemek için 1 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) filizlenme ortamı (adım 1.6) ekleyin. Filizlenen kaplar, gömme işleminden 1 gün ila 3 gün sonra görünmelidir. Ortamı 3 gün sonra ve ardından her gün değiştirin.
NOT: Filizlenme ortamı önceden ısıtılmalıdır; aksi takdirde, katman ayrılması meydana gelebilir ve ECM bütünlüğü etkilenebilir.
7. Gün 11 - BVO'ların izolasyonu ve olgunlaşması
- Steril koşullar altında çalışırken, vasküler ağları içeren ECM filizlenme matrisini gevşetmek için steril bir spatulanın yuvarlak ucunu kullanın. Bu aşamada, jel serbest yüzen bir diske benzemelidir.
- Steril forseps ve steril bir spatulanın yuvarlak ucunu kullanarak, jel diski (vasküler ağlar dahil) 10 cm'lik bir kültür kabının kapağına dikkatlice aktarın.
- Kapak artı jeli, istenen büyütme ve odaklanmaya göre ayarlanmış bir stereomikroskop altına yerleştirin ve işlemde elde edilen vaskülarize olmayan ECM miktarını sınırlamaya çalışarak tek kan damarı ağlarını kesmek için steril iğneler kullanın.
NOT: Hücreler zamanla çevredeki ECM'yi doğal olarak bozar; Bununla birlikte, her organoid ile kesilen miktarın azaltılması, görüntü kalitesini ve bağımsız gemi ağı bütünlüğünü arttırır. - Tüm organoidler jelden izole edildikten sonra, bunları yavaşça 3 mL filizlenme ortamına sahip ultra düşük bir bağlantı 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna geri aktarın. Bu aşamada, organoidler gece boyunca bırakılabilir veya biri hemen adım 7.4'e devam edebilir.
- Tek organoidleri 6 delikli plakadan ultra düşük ataşman 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Aktarıldıktan sonra, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 μL önceden ısıtılmış (37 ° C) filizlenme ortamı ekleyin.
NOT: 12 delikli bir plakadan bir vasküler organoid kuyusu, 96 delikli bir plakanın 30-40 kuyucuğunu doldurmalıdır. - 96 delikli plakalarda izolasyondan 4-6 gün sonra, organoidlerin yuvarlak ve sağlıklı bir morfolojiye sahip olduğundan emin olun. Bu aşamada, organoidler sabitlenmeye ve lekelenmeye hazırlanmaya hazırdır.
8. Gün 15 - BVO'ların sabitlenmesi, bloke edilmesi ve boyanması
- Kesilmiş 1 mL'lik bir uç kullanarak, organoidleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Herhangi bir BVO'nun aspirasyonunu önlemeye dikkat ederek, mikrosantrifüj tüpünde kalan filizlenme ortamını çıkarmak için 200 μL veya 1.000 μL pipet kullanın ve ardından PBS'de 1 saat boyunca 1 mL% 4 PFA ekleyin.
NOT: Oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya (125 rpm) sabitlenmesi önerilir. Maksimum 60 BVO / mikrosantrifüj tüpü kabul edilebilir. Daha fazla BVO, fiksasyonu ve yıkama etkinliğini bozacaktır.
DİKKAT: PFA zararlı bir kimyasaldır. Bir duman davlumbazında dikkatli kullanın ve kullanım ve uygun bertaraf yöntemleri için üreticinin talimatlarını izleyin. - Yeni sabitlenmiş BVO'ları her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez% 0,25 PBS-Arayla yıkayın.
- Organoidlerin çapı 1 mm'den büyükse, BVO'ları PBS'de% 1 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 30-60 dakika geçirgenleştirin.
- %0,25 PBS-Ara'nın tümünü aspire edin ve 1 mL engelleme arabelleği ekleyin (adım 1,7).
NOT: Antikora bağımlı olmasına rağmen, bir orbital çalkalayıcı (125 rpm) üzerinde oda sıcaklığında 2 saat, boyama işlemi sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için yeterlidir. Organoidler bloke edici tamponda 4 °C'de 2 haftaya kadar bırakılabilir. - Bloke edici tamponu çıkarın ve bloke edici tamponun 1 mL'sinde seyreltilmiş birincil antikoru (1:100) ekleyin. Bir orbital çalkalayıcıda (12 rpm) gece boyunca 4 ° C'de tutun, organoidlerin birincil antikor çözeltisine batırılmış kalmasını sağlayın.
NOT: Bir gecede primer antikor inkübasyonu, bu çalışmada kullanılan antikorlar için uygundur. Gerekli birincil ve ikincil antikorlar ve bunların ilgili seyreltmeleri Malzeme Tablosunda verilmiştir. - Bir gecede primer antikor inkübasyonunu takiben, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve% 0.25 PBS-Ara ile her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- İkincil antikoru (1:250) artı DAPI'yi (1:1.000) 1 mL bloke edici tamponda seyreltilmiş olarak ekleyin ve oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de 2 saat inkübe edin.
NOT: Numuneler doğru hazırlanmışsa (yukarıda açıklandığı gibi), oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübasyon, bu çalışmada kullanılan antikorlar için uygundur. - İnkübasyondan sonra, ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve% 0.25 PBS-Ara ile her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
NOT: Boyamayı takiben, organoidler PBS'de 2 haftaya kadar tutulabilir.
9. Kan damarı organoidlerinin (BVO'lar) montajı
- Ara parçaları istenen görüntüleme kapaklarına yapıştırın (bkz.
- Kesilmiş 1 mm'lik pipet ucu kullanarak, tek organoidleri ara parça kuyucuklarına aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın ve kalan PBS'yi aspire edin.
- Kuyuyu, organoidi tamamen suya batırarak 75 ° C'ye ısıtılmış 150-200 μL temizleme çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile doldurun.
NOT: Numuneler, ısıtılmış temizleme çözeltisine maruz kaldıktan sonraki 1 saat içinde berraklaşmalıdır.- 1 saatlik temizleme süresi yetersizse, organoidleri karanlıkta kapalı bir kutuda oda sıcaklığında 6 saat ila gece boyunca berraklaşmaya bırakın. Numuneyi gece boyunca bırakıyorsanız, kurumasını önlemek için yeterli temizleme çözeltisine sahip olduğundan emin olun.
- Temizledikten sonra, temizleme solüsyonunu 100-200 μL pipet ucuyla dikkatlice aspire edin. Organoidi ara parçanın ortasına yavaşça manevra ettirin ve kuyu dolana kadar montaj jeli damlaları ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (kontrollü bir ısıtma bloğunda 75 ° C'ye ısıtılır).
- Numuneleri alt ve üst kapak kaymaları arasındaki boşluğa kapatmak için ikinci kapak kaymasını yavaşça montaj ara parçasının üstüne yerleştirin. Montaj jelinin karanlıkta gece boyunca 4 ° C'de kürlenmesine izin verin.
NOT: Kürlemeyi takiben, monte edilen numuneleri daha da sızdırmaz hale getirmek için son kat oje kullanılabilir.
Representative Results
Bu protokolde açıklanan adımlar, hPSC'lerden insan kan damarı organoidlerinin üretimi için kontrollü ve kesin bir yöntem elde etmek için özel olarak geliştirilmiştir. hPSC kültürlerinden 30-100 μm çapında agregaların oluşması protokolün başlangıç noktasını işaret eder (Şekil 1, Şekil 2B). Agregalar, damar ağı oluşumu için gerekli olan gömmeden önce (6. gün) mezoderm (gün 1-gün 4) ve vasküler soylara (gün 4-gün 6) doğru kademeli indüksiyonlarla yönlendirilir (Şekil 2A-D). Radyal olarak simetrik olan kap filizlenmesi, d7 veya d8 (Şekil 2E) ile görülebilmeli ve d10 (Şekil 2F, G) boyunca devam etmelidir. HBVO'ların ECM'den 96 delikli ultra düşük bağlantı plakalarına ekstrasyonu, filizlenen ağların kırılganlığını azaltır ve süspansiyon kültürü koşullarında (Şekil 2H) 6 aya kadar sürekli bakım yapılmasını sağlar. d15 ile hBVO'lar perisitler (PDGFR-ß+) ve düz kas aktini (SMA +) ile çevrili geniş ve bağlı bir endotel (CD31+) ağı sergiler (Şekil 3A-D). Sürekli bir kollajen IV (ColIV+) bazal membran damar ağlarını sarar (Şekil 3E). Endotel hücreleri (CD31+, VE-Kadherin+) ve perisitler (PDGFR-ß+) organoid hücre popülasyonlarının sırasıyla yaklaşık %30-35'ini ve %60-65'ini oluşturur8. Damarların aktif filizlenmesi, aşırı filipodi 8,10 gibi tipik uç hücre morfolojisi ile ortaya çıkan, endojen olarak organize edilmiş bir uç hücresi (CD31+) popülasyonunun yönlendirmesi altında gerçekleşir. Endotel damar ağlarını kapsülleyen PDGFR-ß+ ve SMA+ duvar hücrelerinin prezentasyonu organoid olgunlaşma sürecinin d15'i ile görülebilir (Şekil 3A,C). ECM'den çıkarıldıktan ve süspansiyon kültüründe (yani, d15) olgunlaştıktan sonra, hBVO'lar fare böbrek kapsülü altında ilgili analizler veya transplantasyon için uygundur.
Şekil 1: hBVO protokolünün zamanlamayı ve adım adım ilerlemeyi vurgulayan şeması. Görünüşte homojen hPSC veya hiPSC kültürlerinden, Rho-kinaz inhibitörü Y27632 varlığında agrega oluşumu meydana gelir. BMP4 ve CHiR takviyeli ortam, agregaları mezodermal kadere doğru yönlendirmek için kullanılır. Mezoderm indüksiyon ortamı, agregaları vasküler bir soya doğru uyarmak için VEGFA ve forskolin takviyeli ortam ile değiştirilir. Agregaların bir kollajen I ve çözünür bazal membran matrisine gömülmesi ve VEGFA ve FGF2 içeren ortama maruz bırakılması yoluyla elde edilen mekanik ve kimyasal kuyruklar, agrega gövdesinden neredeyse radyal olarak simetrik vasküler filizlenme ile sonuçlanır. Üretilen damar ağları kollajen I ve çözünür bazal membrandan çıkarılabilir ve in vivo olarak daha fazla olgunlaşma, analiz veya transplantasyon için süspansiyon kültürüne yerleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Parlak alan altında yakalanan hBVO neslinin kademeli ilerlemesi. (A) −1. günde hPSC (H9) kolonilerinin tipik morfolojisi. (B) Y-27632 varlığında 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakalarında hPSC agregalarının oluşturulması (gün 0). (C) BMP4 ve ChiR takviyeli ortam kullanılarak agregaların mezodermal indüksiyonu (gün 1). Agrega boyutu ve şeklindeki ince değişiklikler de gözlemlenebilir. (D) 4. Gün agregaları, VEGFA ve forskolin takviyeli ortam kullanılarak vasküler bir soya doğru astarlanır. (E) 7. günde, agregaların filizlenme matrisine gömülmesinden ve VEGFA ve FGF2 takviyeli filizlenme ortamına maruz kaldıktan bir gün sonra (7. gün) erken filizlenme. (F) Sağlıklı organoid morfoloji ve 9. günde devam eden damar filizlenmesi. (G) 10. günde filizlenen geç evre gemi. İdeal olarak, organoid merkezdeki yoğun hücre yapıları bu zamana kadar ortadan kalkmıştır. (H) Olgun (15. gün) insan kan damarı organoidlerinin tipik morfolojisi. Ultra düşük ataşman 96 kuyucuklu kültür plakalarında kesme ve olgunlaşma yoluyla çevreleyen matrisin çıkarılması, organoidleri küresel olarak şekillendirir ve damar ağları dahili olarak barındırılır. Ölçek çubukları: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Olgun (15. gün) insan kan damarı organoidlerinin tam montajlı boyanması. (A) Kendi kendini organize eden endotel (CD31+, macenta) ağları ve çevresindeki perisit (PDGFR-β+, camgöbeği) ve alfa-düz kas aktini (SMA +, sarı) kapsama alanına sahip olgun (15. gün) insan kan damarı organoidlerinin sunumu. (B) Gemi ağlarının SMA+ (sarı) ve PDGFR-β+ (camgöbeği) ekspresyonunu detaylandıran A'nın daha yüksek büyütülmesi. (C) Endotel (CD31+, macenta), perisit (PDGFR-β+, camgöbeği) ve alfa-düz kas aktin (SMA+, sarı) etkileşiminin ayrıntılı sunumu. (D) Damar endotelyal (CD31+, macenta)-düz kas (SMA +, sarı) etkileşiminin bir kesitte (solda) ve olgun kan damarı organoidlerinin daha yüksek bir büyütmesinde (sağda) tam montajlı boyanması. (E) Duvar hücrelerinin ve endotel tüplerinin yakın ilişkisi yoluyla vasküler bazal membranın (Col IV +, gri tonlamalı) kendi kendine yönlendirilmiş oluşumu. Ölçek çubukları: (A,D[sol]) 100 μm; (B,D[sağ],E) 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Kök hücre kaynaklı organoid kültürlerdeki son atılımlar, insan vaskülatürünün daha gelişmiş ve fizyolojik olarak ilgili modelleri için çerçeve sağlamıştır. Burada sunulan, laboratuvarımızda geliştirilen insan kan damarı organoid (hBVO) modeli 8,10, sadece insan vaskülogenezinin diğer yönlerini değil, aynı zamanda hastalık modelleme ve rejeneratif tedavinin yeni yollarını da araştırmak için güçlü bir araç sağlar 8,10,11. Kan damarlarının gelişimini ve olgunlaşmasını, vasküler hastalığı ve endotel disfonksiyonunu araştırmak için çoklu in vivo modeller kullanılmıştır 3,4. Farklı yaklaşımlar, replikatif insan vasküler ağları oluşturmak için kök hücrelerden türetilen veya yetişkin dokulardan in vivo olarak izole edilen tek ve çoklu soy tanımlı hücreleri birleştirir 5,6. Burada sunulan protokol, özünde tek bir hPSC 8,10'dan üretilebilen ilk çok hücreli soy insan kan damarı ağlarını elde etmek için gelişimsel biyoloji ve öz-organizasyon ilkesinden yararlanmaktadır.
Her kök hücre hattının kendine özgü bir genetik yapısı vardır ve kaynağı, işlevi ve duyarlılığı açısından diğerlerinden farklıdır15. Bu nedenle, insan kan damarı organoidleri (hBVO'lar) için protokol, çoklu (>12) farklı hPSC hatları 8,10 ile sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol uyumluluğu sağlamak için geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Burada açıklanan yöntem, 2 hafta boyunca hPSC kaynaklı kan damarı organoidleri üretir. Bununla birlikte, medya kompozisyonundaki ve/veya hBVO jenerasyonundaki tekniklerdeki değişiklikler etkisiz damar ağına ve organoid oluşumuna yol açabilir. Bireysel kök hücre hatlarının değişen çoğalma oranları, kök hücre deneylerinin tekrarlanabilirliğini de belirgin şekilde etkilemektedir15 ve dolayısıyla organoid kültürler. Örneğin, BVO'ların üretilmesinde, daha proliferatif hücreler veya daha fazla sayıda büyük gün 1 agregası, doğal olarak farklı metabolik ortamlara ve gaz ve besin difüzyon parametrelerine maruz kalır. Bu da, büyüme faktörü maruziyet sürelerini ve verimliliklerini, farklılaşma derecesini ve vasküler astarlamayı ve en önemlisi, agregaları kollajen 1 ve çözünür bazal membran matrisine gömdükten sonra damar ağları oluşturma yeteneğini değiştirir.
Oksijenin pasif difüzyonu ve temel besin maddelerinin dış ortamdan verilmesi, 3D organoidlerin uzun süreli hücre büyümesi ve in vitro16 doku morfogenezi için ideal değildir. Her ne kadar çeşitli faktörlere (yani, doku metabolizma hızı, besin ve gaz biyoyararlanımı, statik veya dinamik bir ortam) bağlı olsa da, fizyolojik olarak, insan dokularının perfüze edilmiş kan damarlarının 150 μm içinde canlı hücre kordonları sunduğu göz önüne alındığında, in vitro kültürlenmiş dokular için genel bir 150 μmO2 ve besin difüzyon sınırı belirlenmiştir17. Her ne kadar 70-200 μm'lik etkili gaz ve besin difüzyon mesafeleri de 18,19,20,21 önerilmiş olsa da, yapı yoğunluğu, sıcaklık, pH ve ortam bileşimi difüzyon etkinliğini önemli ölçüde etkilemektedir. 6. gün gömmeyi takiben yüzey alanı optimizasyonu ve integrin-beta reseptör iletişimi nedeniyle, 250-300 μm çapındaki agregalar, çapı 500-600 μm olanlardan> daha iyi performans gösterir, bu da tam bir damar filizlenme işlemi ve minimum yoğunlaştırılmış bir organoid çekirdek ile sonuçlanır. Bu nedenle, agrega boyutu çok önemlidir ve hem ilk tohumlama sırasında kullanılan hücre sayısından hem de agrega oluşumu için ayrılan süreden etkilenebilir. Agrega boyutu ve22 sayısı üzerinde kontrol sağlayan mikro kuyu plakaları, bu protokolde ultra düşük ataşman 6 kuyucuklu plakaların kullanılmasından kaynaklanan aksi takdirde stokastik agrega oluşum tekniğine uygun bir alternatiftir. hBVO protokolünün ilk 6 günü boyunca zamanlama ve agrega boyutlarının yönetilmesindeki tutarlılık, en iyi niyetli kan damarı organoidlerinin başarılı bir şekilde geliştirilmesinin en önemli göstergelerinden biri olmasa da, en önemlisidir.
1. gün (mezoderm indüksiyonu) ve 4. gündeki (vasküler indüksiyon) orta değişiklikler, agregaların çökelmesi ile birlikte tamamlanmalıdır. Santrifüjleme cazip bir alternatif olsa da, zayıf bir şekilde monte edilmiş aggeratlara uygulanan ek kuvvetler, protokolün sonraki aşamalarında farklılaşmayı, olgunlaşmayı ve filizlenme etkinliğini olumsuz yönde etkileyen istenmeyen kümelenme, montaj ve kesmeye neden olabilir. Gün boyunca buz üzerinde çalışmak 6 gömme işlemi, uygun ECM polimerizasyonunu ve tabaka oluşumunu korumak için kritik öneme sahiptir. Agrega gömme ve filizlenme indüksiyonu sırasında, ECM'nin 4°C'nin üzerindeki sıcaklıklara ve/veya 7,4'ten farklı bir ECM pH'ına maruz bırakılması sadece polimerizasyon oranlarını ve ECM tabaka bütünlüğünü değil, aynı zamanda gömülü agregaların filizlenme verimliliğini de etkileyecektir. ECM filizlenme matrisinin elastik yapısı, 12 delikli kültür kabından steril kesme yüzeyine kolay ayrılma ve taşıma sağlar. Matristen çıkarılan ve ultra düşük ataşman 96 kuyucuklu plakalara aktarılan bireysel organoidler, kalan çevreleyen ECM'yi tüketecek ve sürekli bir bazal membran ile kendi kendini organize eden duvar hücresi kaplı endotel mikrodamar ağlarını koruyacaktır.
Bu teklifte ele alınmamakla birlikte, medya bileşimlerindeki değişiklikler, hBVO'lardapatolojik yanıtlara neden olan hastalıkları çoğaltabilir 8,11. HBVO sistemini kullanarak hastalık modellemenin sınırları iyi bilinmekten uzaktır ve bu kesinlikle araştırılması gereken bir alandır. Kan damarı organoid teknolojimizin daha önce avasküler organoid yapıların23'ünün vaskülarizasyonunda uygulanması da önemli bir etki ve ilgi çekicidir.
Disclosures
Yazarların finansal çıkarları ile sunulan araştırma arasında bir ilişki yoktur. Kan damarı organoid teknolojisi Kök Hücre Teknolojilerine lisanslanmıştır. J.M.P., vasküler transplantasyon tedavisi olarak kan damarı organoidleri geliştiren Angios Biotech'in kurucusu ve hissedarıdır. Bu çalışma ile ilgili bir patent başvurusu Pat. No altında yapılmıştır. US20200199541A1, Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger ve Dontscho Kerjaschki'yi mucit olarak listeledi.
Acknowledgments
Laboratuvarlarımızın tüm üyelerine eleştirel katkıları ve tartışmaları için teşekkür ederiz. JMP, T. von Zastrow vakfı, FWF Wittgenstein ödülü (Z 271-B19), Avusturya Bilimler Akademisi, 101005026 numaralı hibe anlaşması kapsamında Yenilikçi İlaçlar Girişimi 2 Ortak Girişimi (JU), Leducq Transatlantik Kardiyovasküler Araştırmalarda Mükemmellik Ağları, Allen Enstitüsü Seçkin Araştırmacı Programı ve Kanada 150 Araştırma Başkanları Programı F18-01336'nın yanı sıra Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri COVID-19 hibeleri F20-02343 ve F20-02015'ten fon aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
| 7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
| Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
| Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
| Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
| Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
| Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
| BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
| CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
| CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
| Cellulose wipes | |||
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
| CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
| Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
| Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
| Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | |||
| Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
| Eppendorf tubes | |||
| Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
| Fine forceps | FST | 11254-20 | |
| Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
| Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
| Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
| KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
| PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
| PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
| Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
| PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
| RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
| Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
| SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
| Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
| Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
| Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
| StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
| Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
| Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
| Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 |
References
- Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
- Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
- Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
- Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581 (2018).
- Risau, W.
- Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
- Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).
- Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
- Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
- Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
- Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846 (2014).
- Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
- McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
- McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
- Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
- Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
- Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).
- Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707 (2022).
