Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64715
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, University of British Columbia, 3Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 4Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA)

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव प्लुरिपोटेंट और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से स्व-व्यवस्थित रक्त वाहिकाओं की पीढ़ी का वर्णन करता है। ये रक्त वाहिका नेटवर्क पेरिसाइट, चिकनी मांसपेशी एक्टिन और एक निरंतर तहखाने झिल्ली से घिरे एक व्यापक और जुड़े एंडोथेलियल नेटवर्क का प्रदर्शन करते हैं।

Abstract

एक ऑर्गनॉइड को एक इंजीनियर बहुकोशिकीय इन विट्रो ऊतक के रूप में परिभाषित किया गया है जो विवो अंग में इसके अनुरूप नकल करता है जैसे कि इसका उपयोग ऊतक संस्कृति डिश में उस अंग के परिभाषित पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) -व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड अनुसंधान की चौड़ाई और अनुप्रयोग मस्तिष्क, रेटिना, आंसू वाहिनी, हृदय, फेफड़े, आंत, अग्न्याशय, गुर्दे और रक्त वाहिकाओं को शामिल करने के लिए काफी उन्नत हुए हैं। मानव माइक्रोवाइल की पीढ़ी के लिए तरीकों के विकास, विशेष रूप से, विट्रो में मानव रक्त वाहिका विकास और बीमारी के मॉडलिंग और सार्स-सीओवी-2 सहित वायरस संक्रमण में नई दवाओं या ऊतक ट्रोपिज्म के परीक्षण और विश्लेषण के लिए रास्ता खोल दिया है। दृश्य मार्गदर्शन की कमी वाले जटिल और लंबे प्रोटोकॉल कई स्टेम सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की प्रजनन क्षमता में बाधा डालते हैं। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनॉइड गठन प्रक्रियाओं और आत्म-संगठन की अंतर्निहित स्टोकेस्टिकिटी सेल भाग्य अधिग्रहण और प्रोग्रामिंग की समझ को आगे बढ़ाने के लिए ऑप्टिकल प्रोटोकॉल की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। यहां, एचपीएससी से इंजीनियर 3 डी मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स (बीवीओ) की पीढ़ी के लिए एक नेत्रहीन निर्देशित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। भित्ति कोशिकाओं के साथ एक निरंतर तहखाने की झिल्ली, संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं और संगठित अभिव्यक्ति प्रस्तुत करते हुए, बीवीओ मानव माइक्रोवास्कुलर की कार्यात्मक, रूपात्मक और आणविक विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। बीवीओ गठन कुल गठन के माध्यम से शुरू किया जाता है, इसके बाद मेसोडर्म और संवहनी प्रेरण। संवहनी परिपक्वता और नेटवर्क गठन को 3 डी कोलेजन और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में समुच्चय एम्बेड करके शुरू और समर्थित किया जाता है। मानव पोत नेटवर्क 2-3 सप्ताह के भीतर बनते हैं और स्केलेबल कल्चर सिस्टम में आगे उगाए जा सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, बीवीओ को अंतर्जात माउस परिसंचरण के साथ इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों एनास्टोमोस में प्रत्यारोपित किया जाता है और कार्यात्मक धमनियों, नसों और धमनी में निर्दिष्ट किया जाता है। वर्तमान नेत्रहीन निर्देशित प्रोटोकॉल मानव ऑर्गनॉइड अनुसंधान को आगे बढ़ाएगा, विशेष रूप से सामान्य विकास, ऊतक वैस्कुलराइजेशन और बीमारी में रक्त वाहिकाओं के संबंध में।

Introduction

संवहनी शिथिलता और रक्त वाहिका रोग अंग कार्यों में चिह्नित जटिलताओं के साथ मौजूद हैं। कार्डियोवैस्कुलर बीमारी (सीवीडी) दुनिया भर में मृत्यु का प्रमुख कारण है1 और संयुक्त राज्य अमेरिका में स्वास्थ्य देखभाल लागत बढ़ाने के लिए प्राथमिक योगदान कारक भी है। सीवीडी मामलों की संख्या सालाना बढ़ रही है, और इन मामलों की बढ़ती संख्या युवा आयु समूहों (20-45 वर्ष) में हो रही है। रक्त वाहिकाओं, संवहनी रोग और एंडोथेलियल डिसफंक्शन 3,4 के विकास और परिपक्वता का पता लगाने के लिए कई इन विवो मॉडल विकसित किए गए हैं। वर्तमान में, एकल और कई वंश-परिभाषित कोशिकाओं के संयोजन के तरीके या तो स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं या विवो में वयस्क ऊतकों से अलग होते हैं, संवहनी नेटवर्क बना सकते हैं जो मानव संवहनी कार्य और शरीर रचना विज्ञान 5,6 के पहलुओं को दोहराते हैं। रक्त वाहिकाएं मेसोडर्म से विकास के दौरान पहली कार्यात्मक प्रणालियों में से एक के रूप में उभरी हैं, और वे या तो "वास्कुलोजेनेसिस" नामक असेंबली की प्रक्रिया के माध्यम से या पहले से मौजूद वाहिकाओं से विस्तार और शाखाओं द्वारा व्यवस्थित होती हैं, जिसे "एंजियोजेनेसिस" कहा जाता है।

विकासात्मक जीव विज्ञान और स्व-निर्देशित असेंबली की शक्ति का लाभ उठाते हुए, विमर एट अल ने एचपीएससी से पहले स्व-व्यवस्थित 3 डी मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स की सूचना दी जो मानव माइक्रोवास्कुलचर8 की कार्यात्मक, रूपात्मक और आणविक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। मानव वाहिका9 के समान, ये एचबीवीओ उत्पन्न होते हैं और एक एंडोथेलियम, एक निरंतर तहखाने झिल्ली और आसपास की भित्ति कोशिकाओं 8,10 के साथ मौजूद होते हैं। एचबीवीओ को विवो में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और अंतर्जात परिसंचरण के साथ एनास्टोमोस किया जा सकता है। वे विट्रो में परिपक्वता से भी गुजर सकते हैं और सार्स-सीओवी-211 जैसे वायरस संक्रमण में कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों (यानी, मधुमेह) 8 या ऊतक ट्रोपिज्म के लिए मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं। जबकि हमने पहले एक लिखित प्रोटोकॉल10 प्रकाशित किया था, इस अन्यथा जटिल तकनीक के लिए कोई वीडियो प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं है।

एक संक्षिप्त चरणबद्ध प्रगति के माध्यम से, एचबीवीओ गठन को समग्र गठन, डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट, चिरोन (CHIR99021), और हड्डी मॉर्फोजेनिक प्रोटीन - 4 (बीएमपी 4) 12,13 का उपयोग करके मेसोडर्म प्रेरण, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर ए (वीईजीएफए) और फोर्सकोलिन (फोर्स) 12 के माध्यम से संवहनी प्रेरण, और कस्टम स्प्राउटिंग मैट्रिक्स 8,10 में एम्बेड करने के माध्यम से पूरा किया जाता है।. संवहनी परिपक्वता और नेटवर्क गठन अंकुरित मैट्रिक्स में समुच्चय के एम्बेडिंग का पालन करते हैं। ये मानव पोत नेटवर्क 2-3 सप्ताह के भीतर बनते हैं और उन्हें अंकुरित मैट्रिक्स से हटाया जा सकता है और आगे 6 महीने तक स्केलेबल कल्चर सिस्टम में उगाया जा सकता है। यहां, मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न वाहिका के गठन और आवेदन के लिए ऑप्टिकल रूप से निर्देशित प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं।

Protocol

यहां किए गए सभी प्रयोगों ने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एच 9 मानव आईपीएससी लाइन का उपयोग किया। आम व्यावसायिक और गैर-व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनों (यानी, एच 9, एनसी 8) का भी परीक्षण किया गया है और इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए प्रभावी साबित हुआ है। विवरण के लिए, कृपया हमारी पहले प्रकाशित रिपोर्ट 8,10 देखें।

1. मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए मीडिया और अभिकर्मक सूत्रीकरण

  1. एकत्रीकरण माध्यम तैयार करें।
    1. 40 मिलीलीटर नॉक-आउट डीएमईएम/एफ12 (मानव ईएससी और आईपीएससी विकास के लिए अनुकूलित एल-ग्लूटामाइन या एचईपीईएस बफर के बिना कम ऑस्मोलैलिटी माध्यम), 10 एमएल नॉक-आउट सीरम रिप्लेसमेंट (केओएसआर), 0.5 एमएल 200 एमएल एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड में 0.85% एनएसीएल, 0.5 एमएल गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 35 μL बीटा-मर्केप्टोथेनॉल (बीएमई, 10 एमएल) और वाई -27632 (1:200 पर प्रोटीन किनेज [रॉक] 14 [10 एमएम] युक्त रो-संबद्ध, कुंडलित-कॉइल का सेल-पारगम्य और चयनात्मक अवरोधक) (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एन 2 बी 27 (एन 2 और बी 27 पूरक बुनियादी माध्यम) तैयार करें।
    1. डीएमईएम /एफ 12 के 25 एमएल, न्यूरोबेसल मीडिया के 25 एमएल, बी 27 पूरक के 1 एमएल, एन 2 पूरक के 0.5 एमएल, 0.85% एनएसीएल में 200 एमएल एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड के 250 μL, और बीटा-मर्कैप्टोइथेनॉल के 35 μL मिश्रण ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. मेसोडर्म प्रेरण माध्यम तैयार करें।
    1. चिर (12 μM, GSK3a/b अवरोधक उत्तेजक मेसोडर्म प्रेरण) और BMP-4 (30 ng/mL, MSX2 एक्टिवेटर उत्प्रेरण मेसोडर्म वंश) के साथ पूरक N2B27 माध्यम।
      नोट: स्टॉक (CHIR): 10 mM (1:833, या 1.2 μL/mL N2B27 का उपयोग करें)। स्टॉक (BMP-4): 100 μg/mL (1:3333, या 0.3 μL/mL N2B27 का उपयोग करें) ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. संवहनी प्रेरण माध्यम तैयार करें।
    1. वीईजीएफए (100 एनजी / एमएल) और फोर्सकोलिन (2 μM) के साथ पूरक N2B27 माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) तैयार करें।
    1. 12-वेल प्लेट के एक कुएं के लिए 1 एमएल ईसीएम का उपयोग करें (30-50 समुच्चय एम्बेड करने के लिए)। प्रत्येक कुएं के लिए उपयोग किए जाने वाले ईसीएम समाधान के 1 एमएल में से, एक निचली परत, "लेयर 1" बनाने के लिए 0.5 एमएल का उपयोग करें, जो ईसीएम नींव के रूप में काम करेगा, और शीर्ष परत, "लेयर 2" के लिए 0.5 एमएल प्लस समुच्चय। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, ईसीएम निलंबन के माध्यम से, मानव रक्त वाहिका नेटवर्क को सभी दिशाओं में अंकुरित करने के लिए पर्याप्त स्थान और समर्थन प्रदान करता है।
      नोट: कुल मिलाकर, ईसीएम के 1 एमएल में शुद्ध गोजातीय कोलेजन टाइप 1 के 500 μL, एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म माउस सारकोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 250 μL होते हैं ( सामग्री की तालिका देखें), और मूल मैट्रिक्स समाधान (चरण 1.5.2) के 250 μL। इसे ताजा तैयार करें और उपयोग के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
    2. चार 12-वेल प्लेटों (48 कुओं) के लिए मूल मैट्रिक्स समाधान तैयार करने के लिए, 0.1 एन एनएओएच के 5.627 एमएल, 10एक्स डीएमईएम के 2.498 एमएल, एचईपीईएस के 473 μL, 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट के 368 μL, 200 mM L-alanyl-L-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड के 233 μL को 0.85% NaCl में मिलाएं।
      नोट: बचे हुए मूल मैट्रिक्स समाधान को एक कैप्ड 50 एमएल उच्च-स्पष्टता पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार ट्यूब में रखा जा सकता है और 2 महीने तक उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. अंकुरित माध्यम तैयार करें।
    1. विशेष रूप से मानव हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने के लिए 50 एमएल लचीले सीरम-मुक्त माध्यम (एसएफएम) तैयार करें, लचीले सीरम-मुक्त मध्यम पोषक तत्व पूरक का 1.3 एमएल एलिकोट, 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 250 μL, 200 mM L-alanyl-L-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड का 500 μL 0.85% NaCl, वीईजीएफए (100 ng/mL) और FGF2 (100 ng/mL) देखें।
  7. ब्लॉकिंग बफर तैयार करें।
    1. 0.5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 1.5 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम, 250 μL ट्वीन 20, 250 μL ट्राइटन एक्स -100, 500 μL सोडियम डीऑक्सीकोलेट (1% wt / vol स्टॉक), और 47.5 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा ( सामग्री की तालिका देखें)। पिपेट ऊपर और नीचे तब तक जब तक कि सभी घटक अच्छी तरह से शामिल न हो जाएं और समाधान स्पष्ट न हो।

2. मानव प्लुरिपोटेंट और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का रखरखाव और संस्कृति

  1. स्टेम सेल कल्चर माध्यम के साथ एलडीईवी-मुक्त कम विकास कारक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (1: 50 कमजोर पड़ने) -लेपित 6-वेल ऊतक संस्कृति प्लेटों का उपयोग करके सेल कल्चर का प्रदर्शन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एक बार जब कोशिकाएं ~ 70% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 मिनट के लिए स्तनधारी सेल डिसोसिएटिंग एंजाइम ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 एमएल का उपयोग करके पारित करें।
    नोट: 1: 6 के अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित करना सेल व्यवहार्यता को बढ़ाता है और अधिकांश मानव स्टेम सेल लाइनों के लिए 2-4 दिनों के भीतर सामंजस्य प्राप्त करता है। सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए, रॉक अवरोधक वाई -27632-पूरक (10 एमएम, 1: 1,000) संस्कृति माध्यम का उपयोग 24 घंटे पोस्ट पासिंग के लिए किया जाता है।
  3. संस्कृति माध्यम को दैनिक रूप से बदलें जब तक कि 70% की स्थिरता तक न पहुंच जाए।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, 70% स्थिरता पर, 6-वेल सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में लगभग 1 मिलियन एच 9 एचपीएससी होते हैं।

3. दिन 0 - एकल-कोशिका निलंबन से प्लुरिपोटेंट समुच्चय का उत्पादन।

नोट: 6-वेल कल्चर प्लेट के दो कुओं में 70% की एक कंफ्लुएंसी लगभग 175 एचबीवीओ का उत्पादन करेगी।

  1. या तो एक पिपेट या वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके, संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें, इसे 1 एमएल सेल पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ बदलें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. जबकि कोशिकाएं सेल पृथक्करण अभिकर्मक के अधीन होती हैं, 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट कल्चर प्लेट में वांछित संख्या में कुओं के लिए आवश्यकतानुसार 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एकत्रीकरण माध्यम (चरण 1.1) की आवश्यक मात्रा तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 1 एमएल को एस्पिरेट करें, और एकत्रीकरण माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें। नमूने गिनने से पहले कोमल अप-डाउन पाइपिंग के साथ एक एकल-सेल निलंबन बनाएं।
    चेतावनी: एचपीएससी यांत्रिक तनाव के प्रति काफी संवेदनशील हैं और आक्रामक पाइपिंग को सहन नहीं कर सकते हैं।
  4. एक माइक्रोस्कोप के तहत एक स्वचालित सेल गिनती डिवाइस10 या एक मानकीकृत प्रणाली का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। प्रयोग के लिए आवश्यक सेल संख्या की गणना करें।
    नोट: सेल लाइन के आधार पर, 200,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 300,000 कोशिकाओं / कुएं को कुल गठन के लिए आदर्श माना जाता है (यानी, 4 कुएं = 800,000 से 1,200,000 कोशिकाएं)।
  5. 15 एमएल उच्च-स्पष्टता पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार ट्यूब में एकत्रीकरण माध्यम में सेल निलंबन की उचित मात्रा जोड़ें। एक समरूप सेल वितरण सुनिश्चित करने के लिए पतला सेल निलंबन को धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  6. 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट कल्चर प्लेट के प्रत्येक वांछित कुएं में पतला सेल निलंबन के पिपेट 3 एमएल।
  7. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, >90% आर्द्रता) में प्लेट रखें, और जितना संभव हो सके इनक्यूबेटर दरवाजे खोलने और बंद करने से बचें।
    नोट: यह प्रारंभिक चरण शाम को या कम इनक्यूबेटर ट्रैफ़िक के दौरान सबसे अच्छा पूरा होता है। यहां तक कि मामूली कंपन समुच्चय के आकार और आकार को प्रभावित कर सकते हैं, जो परिणामों को खराब कर सकता है।

4. दिन 1 - समुच्चय का मेसोडर्म प्रेरण

  1. सुनिश्चित करें कि 24 घंटे के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे 2-10 कोशिकाओं वाले छोटे समुच्चय दिखाई दें। समुच्चय एकत्र करें, और माध्यम को मेसोडर्म प्रेरण माध्यम (चरण 1.3) में बदलने से पहले उन्हें व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  2. 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट कल्चर प्लेट के प्रति कुएं में एक 15 एमएल उच्च-स्पष्टता पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार ट्यूब स्थापित करें।
  3. प्रत्येक कुएं के केंद्र में समुच्चय को इकट्ठा करने के लिए एक गोलाकार गति (यानी, एक कक्षीय शेकर की तरह) का उपयोग करें, प्रत्येक कुएं से समुच्चय और आसपास के माध्यम को धीरे से इकट्ठा करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें, उन्हें उनके संबंधित 15 एमएल उच्च-स्पष्टता पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार ट्यूबों में रखें, और समुच्चय को कमरे के तापमान पर तलछट की अनुमति दें।
  4. एक बार एकत्र होने के बाद, 1 घंटे के लिए एक टाइमर सेट करें, जो इस स्तर पर तलछट के लिए अधिकांश सेल लाइनों / समुच्चय के लिए आवश्यक समय है।
    नोट: यदि समय 1 घंटे से कम है, तो कोई भी समुच्चय खो सकता है जो 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के तल तक नहीं बस सकता है।
  5. एक बार जब घंटा बीत जाता है, तो सावधानी के साथ, सतह पर तैरनेवाले को पिपेट या उच्च संवेदनशीलता वाले एस्पिरेटिंग पंप से एस्पिरेट करें। सुनिश्चित करें कि समुच्चय 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के तल पर अबाधित रहें।
  6. प्रत्येक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के समुच्चय को 2 एमएल मेसोडर्म प्रेरण माध्यम में पुन: निलंबित करें, और उन्हें 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट कल्चर प्लेट के अपने संबंधित कुओं में वापस रखें।
  7. प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में वापस रखें, और इसे 4 दिन तक छोड़ दें।
    नोट: यदि समुच्चय संलग्न होते हैं और एक दूसरे पर या एक दूसरे में बढ़ते हैं, तो 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, समुच्चय के प्रत्येक कुएं को आकार में समान रखने के लिए प्रति दिन एक बार ऊपर और नीचे धीरे-धीरे पिपेट करें।

5. दिन 4 - समुच्चय का संवहनी प्रेरण और प्राइमिंग

  1. समुच्चय एकत्र करें, और माध्यम को संवहनी प्रेरण माध्यम (चरण 1.4) में बदलने से पहले उन्हें व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  2. 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट कल्चर प्लेट के प्रति कुएं में एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब स्थापित करें।
  3. प्रत्येक कुएं के केंद्र में समुच्चय को इकट्ठा करने के लिए एक गोलाकार गति (यानी, ऑर्बिटल शेकर की तरह) का उपयोग करें, प्रत्येक कुएं से समुच्चय और आसपास के माध्यम को धीरे से इकट्ठा करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें, और उन्हें उनके संबंधित 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में रखें।
  4. एक बार एकत्र होने के बाद, समुच्चय को तलछट की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए टाइमर सेट करें।
    नोट: इस स्तर पर अधिकांश सेल लाइनों के लिए 30 मिनट का समय आवश्यक है। यदि समय 30 मिनट से कम है, तो किसी भी समुच्चय को खोने का खतरा है जो 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के तल तक नहीं बस सकता है।
  5. 30 मिनट के बाद, सावधानी के साथ, सतह पर तैरनेवाला को पिपेट या उच्च संवेदनशीलता वाले एस्पिरेटिंग पंप से एस्पिरेट करें। सुनिश्चित करें कि समुच्चय 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के तल पर अबाधित रहें।
  6. संवहनी प्रेरण माध्यम के 2 एमएल में प्रत्येक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के समुच्चय को फिर से निलंबित करें, और उन्हें 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट कल्चर प्लेट के अपने संबंधित कुओं में वापस रखें।
  7. प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में वापस रखें, और इसे 6 दिन तक छोड़ दें।
    नोट: 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, समुच्चय को आकार में समान रखने और उन्हें एक दूसरे में बढ़ने या संलग्न करने से रोकने के लिए प्रति दिन एक बार समुच्चय के प्रत्येक कुएं को धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें।

6. दिन 6 - कुल एम्बेडिंग और पोत स्प्राउट प्रेरण

  1. बर्फ पर काम करते समय, ईसीएम समाधान (चरण 1.5) की वांछित अंतिम मात्रा तैयार करें।
    नोट: निम्नलिखित 12-वेल प्लेट (30-50 समुच्चय) के एक कुएं के लिए प्रोटोकॉल है, जिसे आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है।
    1. 12-वेल प्लेट के एक कुएं के लिए, नीचे की परत के रूप में ईसीएम के 0.5 एमएल लागू करें, और शीर्ष परत पर 0.5 एमएल ईसीएम प्लस समुच्चय का उपयोग करें। यह प्रभावी 3 डी एग्रीगेट स्प्राउटिंग के लिए आवश्यक ईसीएम "सैंडविच" बनाता है।
  2. 12-वेल प्लेट के एक कुएं में ईसीएम के पिपेट 500 μL। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले नहीं बनते हैं और अच्छी तरह से नीचे और साइड मेनिस्कस पूरी तरह से लेपित होते हैं। इसमें ईसीएम सैंडविच की परत 1 शामिल है।
  3. प्लेट को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस रखें।
    नोट: प्रभावी पोलीमराइजेशन के लिए 2 घंटे का समय आवश्यक है। किसी भी कम समय में ईसीएम अखंडता से समझौता करने का जोखिम होता है।
  4. परत 1 पोलीमराइजेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं के केंद्र में समुच्चय को इकट्ठा करने के लिए एक परिपत्र गति का उपयोग करें, प्रत्येक कुएं से समुच्चय और आसपास के माध्यम को धीरे से इकट्ठा करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें, और उन्हें उनके संबंधित 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में रखें।
  5. समुच्चय को 10-15 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें, और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  6. समुच्चय को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ पर 5 मिनट के लिए रखें। ठंडा करते समय, इनक्यूबेटर से अब पॉलीमराइज्ड लेयर 1 के साथ 12-वेल प्लेट लें।
    नोट: समुच्चय को ठंडा करने से परत 2 ईसीएम के शुरुआती पोलीमराइजेशन को रोकने में मदद मिलती है।
  7. बुलबुला गठन को रोकने के लिए तेजी से और सावधानी से काम करना, ईसीएम के 500 μL में समुच्चय को फिर से निलंबित करना, और पहले से ही पॉलीमराइज्ड परत 1 के ऊपर ईसीएम-एग्रीगेट निलंबन को पिपेट करना। परत 1 को स्पर्श न करने के लिए सावधान रहते हुए, परत 2 और कुएं के चारों ओर समुच्चय को धीरे से वितरित करने के लिए 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करें।
  8. प्लेट को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस रखें।
    नोट: प्रभावी ईसीएम पोलीमराइजेशन के लिए 2 घंटे का इनक्यूबेशन समय आवश्यक है। किसी भी कम समय में ईसीएम अखंडता से समझौता करने का जोखिम होता है और परत 1 और परत 2 के बीच मजबूत आसंजन को रोका जा सकता है।
  9. रक्त वाहिका भेदभाव को प्रेरित करने के लिए पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) अंकुरित माध्यम (चरण 1.6) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। अंकुरित जहाजों को एम्बेडिंग के बाद 1 दिन से 3 दिन तक दिखाई देना चाहिए। 3 दिनों के बाद और फिर हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
    नोट: अंकुरित माध्यम को पूर्व-गर्म किया जाना चाहिए; अन्यथा, परत अलगाव हो सकता है, और ईसीएम अखंडता प्रभावित हो सकती है।

7. दिन 11 - बीवीओ का अलगाव और परिपक्वता

  1. बाँझ परिस्थितियों में काम करते हुए, संवहनी नेटवर्क युक्त ईसीएम अंकुरित मैट्रिक्स को ढीला करने के लिए बाँझ स्पैटुला के गोल छोर का उपयोग करें। इस स्तर पर, जेल को एक फ्री-फ्लोटिंग डिस्क जैसा दिखना चाहिए।
    1. बाँझ बल और बाँझ स्पैटुला के गोल छोर का उपयोग करके, जेल डिस्क (संवहनी नेटवर्क सहित) को सावधानीपूर्वक 10 सेमी कल्चर डिश के ढक्कन में स्थानांतरित करें।
  2. वांछित आवर्धन और फोकस के लिए समायोजित स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ढक्कन प्लस जेल रखें, और एकल रक्त वाहिका नेटवर्क को काटने के लिए बाँझ सुइयों का उपयोग करें, प्रक्रिया में प्राप्त गैर-संवहनी ईसीएम की मात्रा को सीमित करने की कोशिश करें।
    नोट: कोशिकाएं स्वाभाविक रूप से समय के साथ आसपास के ईसीएम को नीचा दिखाती हैं; हालांकि, प्रत्येक ऑर्गेनॉइड के साथ कटौती की गई राशि को कम करने से छवि की गुणवत्ता और फ्रीस्टैंडिंग पोत नेटवर्क अखंडता बढ़ जाती है।
  3. एक बार जब सभी ऑर्गेनोइड्स को जेल से अलग कर दिया जाता है, तो धीरे से उन्हें 3 एमएल अंकुरित माध्यम के साथ अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेट के एक कुएं में वापस स्थानांतरित करें। इस स्तर पर, ऑर्गेनोइड्स को रात भर छोड़ा जा सकता है, या कोई तुरंत चरण 7.4 जारी रख सकता है।
  4. 6-वेल प्लेट से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट के कुओं में एकल ऑर्गेनोइड को स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। एक बार स्थानांतरित होने के बाद, 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 μL पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) अंकुरित माध्यम जोड़ें।
    नोट: 12-वेल प्लेट से संवहनी ऑर्गेनोइड्स के एक कुएं को 96-वेल प्लेट के 30-40 कुओं को भरना होगा।
  5. 96-वेल प्लेटों में अलगाव के 4-6 दिनों के बाद, सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनोइड्स में एक गोल और स्वस्थ आकृति विज्ञान है। इस स्तर पर, ऑर्गेनोइड ्स को ठीक करने और धुंधला करने के लिए तैयार किया जाता है।

8. दिन 15 - बीवीओ का निर्धारण, अवरोधन और धुंधलापन

  1. एक कट 1 एमएल टिप का उपयोग करके, ऑर्गेनोइड्स को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. किसी भी बीवीओ की आकांक्षा से बचने के लिए सावधान रहना, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में शेष अंकुरित माध्यम को हटाने के लिए 200 μL या 1,000 μL पिपेट का उपयोग करें, और फिर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 4% पीएफए के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेकर (125 आरपीएम) पर निर्धारण की सिफारिश की जाती है। अधिकतम 60 बीवीओ / माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब स्वीकार्य है। कोई भी और बीवीओ निर्धारण और धोने की प्रभावकारिता को खराब कर देगा।
    सावधानी: पीएफए एक हानिकारक रसायन है। फ्यूम हुड में सावधानी के साथ इसका उपयोग करें, और उपयोग और उचित निपटान विधियों के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  3. नए तय बीवीओ 3x को हर बार 15 मिनट के लिए 0.25% पीबीएस-ट्वीन के साथ धोएं।
  4. यदि ऑर्गेनोइड व्यास में 1 मिमी से बड़े हैं, तो कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए पीबीएस में 1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ बीवीओ को प्रतिस्थापित करें।
  5. सभी 0.25% पीबीएस-ट्वीन को एस्पिरेट करें, और 1 एमएल ब्लॉकिंग बफर (चरण 1.7) जोड़ें।
    नोट: हालांकि एंटीबॉडी-निर्भर, ऑर्बिटल शेकर (125 आरपीएम) पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे धुंधला प्रक्रिया के दौरान गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को कम करने के लिए पर्याप्त है। ऑर्गेनोइड्स को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉकिंग बफर में छोड़ा जा सकता है।
  6. ब्लॉकिंग बफर को हटा दें, और ब्लॉकिंग बफर के 1 एमएल में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 100) जोड़ें। ऑर्बिटल शेकर (12 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें, यह सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनॉइड (एस) प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में डूबे रहें।
    नोट: रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त है। आवश्यक प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी और उनके संबंधित कमजोर पड़ने सामग्री की तालिका में प्रदान किए जाते हैं।
  7. रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और 0.25% पीबीएस-ट्वीन के साथ हर बार 15 मिनट के लिए 3x धो लें।
  8. द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 250) प्लस डीएपीआई (1: 1,000) को ब्लॉकिंग बफर के 1 एमएल में पतला करें, और कमरे के तापमान पर 2 घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि नमूने सही ढंग से तैयार किए गए हैं (जैसा कि ऊपर वर्णित है), कमरे के तापमान पर 2 घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त है।
  9. इनक्यूबेशन बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें, और 0.25% पीबीएस-ट्वीन के साथ हर बार 15 मिनट के लिए 3x धो लें।
    नोट: धुंधला होने के बाद, ऑर्गेनोइड्स को पीबीएस में 2 सप्ताह तक रखा जा सकता है।

9. रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स (बीवीओ) का बढ़ना

  1. वांछित इमेजिंग कवरलिप्स पर गोंद माउंटिंग स्पेसर्स ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एक कट 1 मिमी पिपेट टिप का उपयोग करके, स्पेसर कुओं में एकल ऑर्गेनोइड को स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें, और शेष पीबीएस को एस्पिरेट करें।
  3. कुएं को 150-200 μL समाशोधन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ भरें, जिसे 75 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाए, ऑर्गेनॉइड को पूरी तरह से डुबो दिया जाए।
    नोट: नमूने गर्म समाशोधन समाधान के संपर्क में आने के 1 घंटे के भीतर स्पष्ट हो जाना चाहिए।
    1. यदि 1 घंटे का समाशोधन समय अपर्याप्त है, तो ऑर्गेनोइड्स को 6 घंटे से रात भर के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में एक कवर बॉक्स में स्पष्ट होने के लिए छोड़ दें। यदि नमूने को रात भर छोड़ दिया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि इसमें सूखने से बचने के लिए पर्याप्त समाशोधन समाधान है।
  4. साफ़ करने के बाद, 100-200 μL पिपेट टिप के साथ क्लियरिंग समाधान को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। धीरे-धीरे ऑर्गनॉइड को स्पेसर के केंद्र में अच्छी तरह से पैंतरेबाज़ी करें, और माउंटिंग जेल की बूंदें जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें) (नियंत्रित हीटिंग ब्लॉक में 75 डिग्री सेल्सियस तक गर्म) जब तक कि कुआं भर न जाए।
  5. नीचे और शीर्ष कवरलिप्स के बीच की जगह में नमूने को सील करने के लिए माउंटिंग स्पेसर के शीर्ष पर धीरे से दूसरा कवरस्लिप रखें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में बढ़ते जेल को ठीक होने दें।
    नोट: इलाज के बाद, माउंटेड नमूनों को और सील करने के लिए टॉपकोट नेल पॉलिश का उपयोग किया जा सकता है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित कदम विशेष रूप से एचपीएससी से मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड ्स की पीढ़ी के लिए एक नियंत्रित और सटीक विधि प्राप्त करने के लिए विकसित किए गए थे। एचपीएससी संस्कृतियों से व्यास में 30-100 μm के समुच्चय की पीढ़ी प्रोटोकॉल के शुरुआती बिंदु को चिह्नित करती है (चित्रा 1, चित्रा 2 बी)। समुच्चय को एम्बेडिंग (दिन 6) (चित्रा 2 ए-डी) से पहले मेसोडर्म (दिन 1-दिन 4) और संवहनी वंश (दिन 4-दिवसीय 6) की ओर चरणबद्ध प्रेरण के माध्यम से नेतृत्व किया जाता है, जो पोत नेटवर्क गठन के लिए आवश्यक है। निकट-रेडियल रूप से सममित पोत अंकुरित होना d7 या d8 (चित्रा 2E) द्वारा दिखाई देना चाहिए और d10 (चित्रा 2F, G) के माध्यम से जारी रहना चाहिए। ईसीएम से 96-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेटों में एचबीवीओ का निष्कासन अंकुरित नेटवर्क की नाजुकता को कम करता है और निलंबन संस्कृति (चित्रा 2 एच) स्थितियों में 6 महीने तक निरंतर रखरखाव की अनुमति देता है। डी 15 तक, एचबीवीओ एक व्यापक और जुड़े हुए एंडोथेलियल (सीडी 31 +) नेटवर्क का प्रदर्शन करते हैं जो पेरिसाइट्स (पीडीजीएफआर-बी +) और चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए +) (चित्रा 3 ए-डी) से घिरा हुआ है। एक निरंतर कोलेजन IV (ColIV+) तहखाने की झिल्ली पोत नेटवर्क (चित्रा 3E) को कवर करती है। एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीडी 31+, वीई-कैडरिन +) और पेरिसाइट्स (पीडीजीएफआर-बी +) में क्रमशः ऑर्गनॉइड सेल आबादी का लगभग 30% -35% और 60% -65% शामिलहै। वाहिकाओं का सक्रिय अंकुरण एक अंतर्जात संगठित टिप सेल (सीडी 31 +) आबादी के निर्देशन में होता है जो विशिष्ट टिप सेल आकृति विज्ञान के साथ प्रस्तुत होता है, जैसे कि अत्यधिक फिलिपोडिया 8,10। एंडोथेलियल पोत नेटवर्क को संलग्न करने वाले पीडीजीएफआर-बी + और एसएमए + भित्ति कोशिकाओं की प्रस्तुति को ऑर्गनॉइड परिपक्वता प्रक्रिया (चित्रा 3 ए, सी) के डी 15 द्वारा देखा जा सकता है। ईसीएम से हटाने और निलंबन संस्कृति (यानी, डी 15) में परिपक्वता के बाद, एचबीवीओ माउस किडनी कैप्सूल के तहत संबंधित विश्लेषण या प्रत्यारोपण के लिए मान्य हैं।

Figure 1
चित्रा 1: समय और चरणबद्ध प्रगति को उजागर करने वाले एचबीवीओ प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध। प्रतीत होता है कि समरूप एचपीएससी या एचआईपीएससी संस्कृतियों से, कुल गठन रो-काइनेज अवरोधक वाई 27632 की उपस्थिति में होता है। बीएमपी 4 और सीएचआईआर-पूरक माध्यम का उपयोग मेसोडर्मल भाग्य की ओर समुच्चय को निर्देश देने के लिए किया जाता है। मेसोडर्म प्रेरण माध्यम को एक संवहनी वंश की ओर समुच्चय को उत्तेजित करने के लिए वीईजीएफए और फोर्सकोलिन-पूरक माध्यम द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। कोलेजन I और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में समुच्चय के एम्बेडिंग के माध्यम से प्राप्त यांत्रिक और रासायनिक कतारें और वीईजीएफ और एफजीएफ 2 युक्त माध्यम के संपर्क में आने से कुल शरीर से लगभग रेडियल रूप से सममित संवहनी अंकुरण होता है। उत्पन्न पोत नेटवर्क को कोलेजन I और घुलनशील तहखाने झिल्ली से हटाया जा सकता है और विवो में आगे परिपक्वता, विश्लेषण या प्रत्यारोपण के लिए निलंबन संस्कृति में रखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ब्राइटफील्ड के तहत कैप्चर किए गए एचबीवीओ पीढ़ी की चरणबद्ध प्रगति । (ए) दिन -1 पर एचपीएससी (एच 9) कॉलोनियों की विशिष्ट आकृति विज्ञान। (बी) वाई -27632 की उपस्थिति में 6-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेटों पर एचपीएससी समुच्चय (दिन 0) का उत्पादन। (सी) बीएमपी 4 और सीआईआर-पूरक माध्यम (दिन 1) का उपयोग करके समुच्चय का मेसोडर्मल प्रेरण। कुल आकार और आकार में सूक्ष्म परिवर्तन भी देखे जा सकते हैं। (डी) दिन 4 वीईजीएफए और फोर्सकोलिन-पूरक माध्यम का उपयोग करके एक संवहनी वंश की ओर अग्रसर होता है। (ई) अंकुरित मैट्रिक्स में समुच्चय को एम्बेड करने और वीईजीएफ और एफजीएफ 2-पूरक अंकुरित अंकुरित माध्यम (दिन 7) के संपर्क में आने के एक दिन बाद 7 वें दिन जल्दी पोत अंकुरित होना। (एफ) स्वस्थ ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान और 9 वें दिन निरंतर पोत अंकुरित। (छ) 10वें दिन अंकुरित होने वाला लेट-स्टेज पोत। आदर्श रूप से, ऑर्गनॉइड केंद्र में घने सेल संरचनाएं इस समय तक गायब हो गई हैं। (एच) परिपक्व (दिन 15) मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स की विशिष्ट आकृति विज्ञान। अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल कल्चर प्लेटों में काटने और परिपक्वता द्वारा आसपास के मैट्रिक्स को हटाने से ऑर्गेनोइड्स गोलाकार आकार देते हैं, जिसमें पोत नेटवर्क आंतरिक रूप से रखे जाते हैं। स्केल बार: (ए, बी, ई, एफ) 250 μm; (सी, डी) 500 μm; (G, H) 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: परिपक्व (दिन 15) मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स का पूरा-माउंट धुंधलापन। (ए) स्व-संगठित एंडोथेलियल (सीडी 31+, मैजेंटा) नेटवर्क और आसपास के पेरिसिलेट (पीडीजीएफआर -β +, सियान) और अल्फा-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए +, पीला) कवरेज के साथ परिपक्व (दिन 15) मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स की प्रस्तुति। (बी) पोत नेटवर्क के एसएमए + (पीला) और पीडीजीएफआर -β + (सियान) अभिव्यक्ति का विवरण देने वाले ए का उच्च आवर्धन। (सी) एंडोथेलियल (सीडी 31 +, मैजेंटा), पेरिसिलेट (पीडीजीएफआर -β +, सियान), और अल्फा-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए +, पीला) इंटरैक्शन की विस्तृत प्रस्तुति। (डी) वाहिका एंडोथेलियल (सीडी 31 +, मैजेंटा) -चिकनी मांसपेशी (एसएमए +, पीला) का क्रॉस-सेक्शन (बाएं) में संपूर्ण-माउंट धुंधलापन और परिपक्व रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स का उच्च आवर्धन (दाएं)। (ई) भित्ति कोशिकाओं और एंडोथेलियल ट्यूबों के निकट सहयोग के माध्यम से एक संवहनी तहखाने झिल्ली (कोल IV +, ग्रेस्केल) का स्व-निर्देशित गठन। स्केल बार: (ए, डी[बाएं]) 100 μm; (B,D[दाएं],E) 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

स्टेम सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में हाल की सफलताओं ने मानव वाहिका के अधिक उन्नत और शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल के लिए रूपरेखा प्रदान की है। यहां प्रस्तुत मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनॉइड (एचबीवीओ) मॉडल, हमारी प्रयोगशाला 8,10 में विकसित, न केवल मानव वास्कुलोजेनेसिस के आगे के पहलुओं की खोज का एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है, बल्कि रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा 8,10,11 के नए रास्ते भी प्रदान करता है। विवो मॉडल में कई को रक्त वाहिकाओं, संवहनी रोग और एंडोथेलियल डिसफंक्शन 3,4 के विकास और परिपक्वता का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया है। अलग-अलग दृष्टिकोण एकल और कई वंश-परिभाषित कोशिकाओं को जोड़ते हैं जो या तो स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं या विवो में वयस्क ऊतकों से अलग होते हैं ताकि प्रतिकृति मानव संवहनी नेटवर्क 5,6 बनाया जा सके। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विकासात्मक जीव विज्ञान और आत्म-संगठन के सिद्धांत का लाभ उठाता है ताकि पहली बार बहु-कोशिका वंश मानव रक्त वाहिका नेटवर्क उत्पन्न किया जा सके, जिसे संक्षेप में, एकल एचपीएससी 8,10 से उत्पन्न किया जा सकता है।

प्रत्येक स्टेम सेल लाइन में एक अद्वितीय आनुवंशिक मेकअप होता है और इसकी सोर्सिंग, फ़ंक्शन और जवाबदेहीके मामले में दूसरों से भिन्न होता है। इसलिए, मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स (एचबीवीओ) के लिए प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया गया था ताकि कई (>12) विभिन्न एचपीएससी लाइनों 8,10 के साथ एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल संगतता सुनिश्चित की जा सके। यहां वर्णित विधि 2 सप्ताह में एचपीएससी-व्युत्पन्न रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड उत्पन्न करती है। हालांकि, मीडिया संरचना और या एचबीवीओ पीढ़ी में तकनीकों में परिवर्तन से अप्रभावी पोत नेटवर्क और ऑर्गेनॉइड पीढ़ी हो सकती है। अलग-अलग स्टेम सेल लाइनों की अलग-अलग प्रसार दर भी स्टेम सेल प्रयोगकी प्रजनन क्षमता को स्पष्ट रूप से प्रभावित करती है और इस प्रकार, ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां। उदाहरण के लिए, बीवीओ उत्पन्न करने में, अधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं या बड़े दिन 1 समुच्चय की उच्च संख्या स्वाभाविक रूप से विभिन्न चयापचय वातावरण और गैस और पोषक तत्व प्रसार मापदंडों के अधीन होती है। यह बदले में, विकास कारक जोखिम समय और क्षमता, भेदभाव और संवहनी प्राइमिंग की डिग्री को बदलता है, और, सबसे महत्वपूर्ण बात, कोलेजन 1 और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में समुच्चय को एम्बेड करने पर पोत नेटवर्क बनाने की क्षमता।

ऑक्सीजन का निष्क्रिय प्रसार और बाहरी वातावरण से आवश्यक पोषक तत्वों का प्रशासन विट्रो16 में 3 डी ऑर्गेनोइड्स और ऊतक मोर्फोजेनेसिस के दीर्घकालिक सेल विकास के लिए आदर्श नहीं है। यद्यपि कई कारकों (यानी, ऊतक चयापचय दर, पोषक तत्व और गैस जैव उपलब्धता, एक स्थिर या गतिशील वातावरण) पर निर्भर करता है, इन विट्रो में सुसंस्कृत ऊतकों के लिए एक सामान्य 150 μmO2 और पोषक तत्व प्रसार सीमा स्थापित की गई है, यह देखते हुए कि, शारीरिक रूप से, मानव ऊतक 150 μm के भीतर जीवित कोशिकाओं की डोरियां मौजूदहैं। यद्यपि 70-200 μm की प्रभावी गैस और पोषक तत्व प्रसार दूरी भी प्रस्तावित की गई है18,19,20,21, निर्माण घनत्व, तापमान, पीएच और मीडिया संरचना प्रसार प्रभावकारिता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है। दिन 6 एम्बेडिंग के बाद सतह क्षेत्र अनुकूलन और इंटीग्रिन-बीटा रिसेप्टर संचार के कारण, व्यास में 250-300 μm के समुच्चय व्यास में >500-600 μm की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक पूर्ण पोत अंकुरण प्रक्रिया और न्यूनतम संघनित ऑर्गेनॉइड कोर होता है। इस प्रकार, कुल आकार महत्वपूर्ण है और प्रारंभिक बीजारोपण के दौरान उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या और कुल गठन के लिए आवंटित समय दोनों से प्रभावित हो सकता है। माइक्रोवेल प्लेटें जो कुल आकार और संख्या22 पर नियंत्रण की अनुमति देती हैं, इस प्रोटोकॉल में अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेटों के उपयोग के परिणामस्वरूप अन्यथा स्टोकेस्टिक एग्रीगेट फॉर्मेशन तकनीक का एक व्यवहार्य विकल्प हैं। एचबीवीओ प्रोटोकॉल के पहले 6 दिनों के दौरान समय और कुल आकार ों के प्रबंधन में स्थिरता, यदि नहीं, तो बोनाफाइड रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स को सफलतापूर्वक विकसित करने के महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है।

दिन 1 (मेसोडर्म प्रेरण) और दिन 4 (संवहनी प्रेरण) पर मध्यम परिवर्तन समुच्चय के अवसादन के साथ संयोजन में पूरा किया जाना चाहिए। यद्यपि सेंट्रीफ्यूजेशन एक आकर्षक विकल्प है, लेकिन कमजोर रूप से इकट्ठे एग्गरेट पर लागू अतिरिक्त बल अवांछित क्लंपिंग, असेंबली और कतरन का कारण बन सकते हैं, जो प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में भेदभाव, परिपक्वता और अंकुरण प्रभावकारिता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। दिन 6 एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर काम करना उचित ईसीएम पोलीमराइजेशन और परत गठन को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुल एम्बेडिंग और स्प्राउटिंग प्रेरण के दौरान, ईसीएम को 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान और / या 7.4 के अलावा ईसीएम पीएच को उजागर करने से न केवल पोलीमराइजेशन दर और ईसीएम परत अखंडता प्रभावित होगी, बल्कि एम्बेडेड समुच्चय की अंकुरित दक्षता भी प्रभावित होगी। ईसीएम अंकुरित मैट्रिक्स की लोचदार प्रकृति 12-वेल कल्चर डिश से बाँझ काटने की सतह तक आसान अलगाव और परिवहन की अनुमति देती है। मैट्रिक्स से हटाए गए और अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेटों में स्थानांतरित किए गए अलग-अलग ऑर्गेनोइड्स आसपास के शेष ईसीएम का उपभोग करेंगे और निरंतर तहखाने झिल्ली के साथ स्व-संगठित भित्ति सेल-लेपित एंडोथेलियल माइक्रोवाइल नेटवर्क को बनाए रखेंगे।

जबकि इस प्रस्ताव में शामिल नहीं किया गया है, मीडिया रचनाओं में परिवर्तन उन बीमारियों को दोहरा सकते हैं जो बदले में, एचबीवीओ 8,11 में पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं को उकसाते हैं। एचबीवीओ प्रणाली का उपयोग करके रोग मॉडलिंग की सीमाएं प्रसिद्ध से बहुत दूर हैं, और यह निश्चित रूप से एक ऐसा क्षेत्र है जिसे अन्वेषण की आवश्यकता है। पहले से एवैस्कुलर ऑर्गनॉइड संरचनाओं23 के वैस्कुलराइजेशन में हमारे रक्त वाहिका ऑर्गनॉइड तकनीक का अनुप्रयोग भी महत्वपूर्ण प्रभाव और रुचि का है।

Disclosures

लेखकों के वित्तीय हितों और प्रस्तुत किए जा रहे शोध के बीच कोई संबंध नहीं है। रक्त वाहिका ऑर्गेनॉइड तकनीक को स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज को लाइसेंस दिया गया है। जेएमपी एंजियोस बायोटेक के संस्थापक और शेयरधारक हैं जो रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स को संवहनी प्रत्यारोपण चिकित्सा के रूप में विकसित करता है। इस कार्य से संबंधित एक पेटेंट आवेदन पैट नं 2008 के तहत दायर किया गया है। US20200199541A1, रेनर ए विमर, जोसेफ एम पेनिंगर और डोन्त्स्चो केरजास्की को आविष्कारकों के रूप में सूचीबद्ध किया।

Acknowledgments

हम महत्वपूर्ण इनपुट और चर्चा के लिए हमारी प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। जेएमपी को टी वॉन जैस्ट्रो फाउंडेशन, एफडब्ल्यूएफ विट्गेन्स्टाइन पुरस्कार (जेड 271-बी 19), ऑस्ट्रियाई एकेडमी ऑफ साइंसेज, इनोवेटिव मेडिसिन इनिशिएटिव 2 संयुक्त उपक्रम (जेयू) अनुदान समझौते संख्या 101005026, लेडुक ट्रान्साटलांटिक नेटवर्क ऑफ एक्सीलेंस इन कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च, एलन इंस्टीट्यूट डिस्टिंग्विश्ड इन्वेस्टिगेटर प्रोग्राम और कनाडा 150 रिसर्च चेयर ्स प्रोग्राम एफ 18-01336 के साथ-साथ कनाडाई इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च कोविड-19 अनुदान एफ20-02333 से फंडिंग मिली।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES  Gibco 15630080
2-Mercaptoethanol Millipore 60-24-2
7.5% sodium bicarbonate Gibco 5080094
Accutase  Gibco A1110501 cell dissociation reagent 
Albumin fraction V (BSA) AppliChem A1391, 0100
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment — Jackson Immuno Research 711-546-152
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG — Life Technologies A11015
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment — Jackson Immuno Research 705-606-147
Automated cell counter  Invitrogen Countess II
B27 supplement Gibco 12587010
Biological safety cabinet  Faster SafeFAST Premium 212
BMP4 Miltenyi BioTec 130-111-165
CD31 Endothelial cell DAKO M0823
CD31 Endothelial cell R&D AF806
Cellulose wipes
Centrifuge Heraeus Multifuge 4 KR
CHIR99021 Tocris Bioscience 4423
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)
CO2 incubator  New Brunswick Galaxy 170S
Collagen type IV Basement membrane Millipore AB769
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) Leica SP8
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue Invitrogen C10283
Coverslips (22 x 50 mm)
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment — Jackson Immuno Research 715-166-150
DAPI  Sigma D9542
DMEM/F12 Gibco 11330-032
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM)  Sigma D5648-10L
Eppendorf tubes
Falcon tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fetal Bovien Serum (FBS) Gibco 10270-106
FGF2 Miltenyi BioTec 130-093-841
Fine forceps FST 11254-20
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides Fisher Scientific 12-550-016
Forskolin  Sigma F3917
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Fisher Scientific A1413302
Glutamax Gibco 35050061
Ham's F12  Gibco 11765054
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC  Thermo Scientific Heraguard
Inverted contrasting tissue culture microscope  Zeiss Vert.A1
iSpacer  SunJinLab IS009
KnockOut DMEM/F12  Gibco 12660012
KnockOut Serum Replacement  Gibco 10828028
N2 supplement  Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
non-essential amino acids (NEAAs) Gibco 11140035
Orbital shaker
Parafilm
Paraformaldehyde (4%) in PBS Boston BioProducts BM-155
PDGFR-β Pericyte R&D AF385
PDGFR-β Pericyte Cell Signaling 3169S
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
pH indicator strips (6.5-10) Mquant, Millipore 109543
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipettes (P1000, P200 and P20) Gilson, Integra Pipetboy
Prime Surface-U 96-well plates  Sumilon MS9096-U
PurCol  Advanced BioMatrix 5005
RapiClear CS gel SunJinLab RCCS005
RapiClear CS mounting solution SunJinLab RCCS002
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) Falcon 357529, 357530, 357515
SMA vSMC/Pericyte Sigma 2547
Sodium deoxycholate Sigma D6750
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) Sigma S2770
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) Corning 356231
Stainless steel micro spatula (rounded end) Fisher Scientific 21-401-5
Stainless steel spoon (double-ended) Fisher Scientific BelArt H367290018
Stemflex medium Thermo Scientific A3349401 stem cell culture medium 
StemPro-34 SFM Gibco 10639011 flexible serum-free medium 
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) Biozym, Surphob VT0270, VT0250, VT0220
Tissue culture–treated 12-well plates TC  BD Falcon 353043
Tissue culture–treated 6-well plates  Eppendorf 30720113
Triton X-100  Sigma 93420
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red Thermo Scientific 12605010 mammalian cell dissociating enzyme 
Tween 20 Sigma P7949
Ultra-low-attachment 6-well plates Corning  3471
VEGFA  Peprotech 100-20
Water bath (37 °C) Fisher Scientific Isotemp 210
Y-27632 Calbiochem 688000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
  2. Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
  3. Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
  4. Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
  5. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  6. Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581 (2018).
  7. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  8. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  9. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).
  10. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  11. Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
  12. Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  13. Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
  14. Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846 (2014).
  15. Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
  16. McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  17. McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).
  18. Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
  19. Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
  20. Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
  21. Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
  22. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).
  23. Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707 (2022).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 191 रक्त वाहिका इंजीनियरिंग ऑर्गेनोइड्स ऊतक इंजीनियरिंग स्टेम सेल
प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से मानव रक्त वाहिका ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Werschler, N., Penninger, J.… More

Werschler, N., Penninger, J. Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (191), e64715, doi:10.3791/64715 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter