Summary
Detta protokoll beskriver genereringen av självorganiserande blodkärl från humana pluripotenta och inducerade pluripotenta stamceller. Dessa blodkärlsnätverk uppvisar ett omfattande och anslutet endotelnätverk omgivet av pericyter, glatt muskelaktin och ett kontinuerligt basalmembran.
Abstract
En organoid definieras som en konstruerad multicellulär in vitro-vävnad som efterliknar dess motsvarande in vivo-organ så att den kan användas för att studera definierade aspekter av det organet i en vävnadsodlingsrätt. Bredden och tillämpningen av mänsklig pluripotent stamcellsforskning (hPSC) -härledd organoidforskning har avancerat avsevärt för att inkludera hjärnan, näthinnan, tårkanalen, hjärtat, lungan, tarmen, bukspottkörteln, njuren och blodkärlen, bland flera andra vävnader. Utvecklingen av metoder för generering av mänskliga mikrokärl har specifikt öppnat vägen för modellering av humant blodkärlsutveckling och sjukdom in vitro och för testning och analys av nya läkemedel eller vävnadstropism vid virusinfektioner, inklusive SARS-CoV-2. Komplexa och långa protokoll som saknar visuell vägledning hindrar reproducerbarheten hos många stamcellshärledda organoider. Dessutom kräver den inneboende stokasticiteten hos organoidbildningsprocesser och självorganisation generering av optiska protokoll för att främja förståelsen av cellens ödesförvärv och programmering. Här presenteras ett visuellt styrt protokoll för generering av 3D-organoider (BVO) konstruerade från hPSC. Genom att presentera ett kontinuerligt basalmembran, vaskulära endotelceller och organiserad artikulation med väggceller, uppvisar BVOs de funktionella, morfologiska och molekylära egenskaperna hos human mikrovaskulatur. BVO-bildning initieras genom aggregatbildning, följt av mesoderm och vaskulär induktion. Vaskulär mognad och nätverksbildning initieras och stöds genom inbäddning av aggregat i en 3D-kollagen och solubiliserad basalmembranmatris. Mänskliga fartygsnätverk bildas inom 2-3 veckor och kan odlas ytterligare i skalbara kultursystem. Det är viktigt att BVOs transplanteras i immunkomprometterade mössanastomos med den endogena muscirkulationen och specificerar i funktionella artärer, vener och arterioler. Det nuvarande visuellt styrda protokollet kommer att främja mänsklig organoidforskning, särskilt i förhållande till blodkärl i normal utveckling, vävnadsvaskularisering och sjukdom.
Introduction
Vaskulär dysfunktion och blodkärlssjukdomar uppvisar markerade komplikationer i organfunktioner. Kardiovaskulär sjukdom (CVD) är den ledande dödsorsaken över hela världen1 och är också den främsta bidragande faktorn till ökande sjukvårdskostnader i USA. Antalet CVD-fall ökar årligen, och ett ökande antal av dessa fall förekommer i yngre åldersgrupper (20–45 år)2. Flera in vivo-modeller har utvecklats för att utforska utveckling och mognad av blodkärl, kärlsjukdom och endoteldysfunktion 3,4. För närvarande kan metoder som kombinerar enstaka och multipla härstamningsdefinierade celler antingen härledda från stamceller eller isolerade från vuxna vävnader in vivo skapa vaskulära nätverk som replikerar aspekter av mänsklig vaskulär funktion och anatomi 5,6. Blodkärl har uppstått som ett av de första funktionella systemen under utvecklingen från mesodermen, och de organiserar antingen genom en monteringsprocess som kallas "vaskulogenes" eller genom expansion och förgrening från befintliga kärl, som kallas "angiogenes"7.
Genom att utnyttja kraften i utvecklingsbiologi och självstyrd montering rapporterade Wimmer et al. de första självorganiserande 3D-humana blodkärlsorganoiderna från hPSC som uppvisar de funktionella, morfologiska och molekylära egenskaperna hos human mikrovaskulatur8. I likhet med mänsklig vaskulatur9 genereras dessa hBVOs och presenteras med ett endotel, ett kontinuerligt basalmembran och omgivande väggceller 8,10. hBVOs kan transplanteras in vivo och anastomoseras med den endogena cirkulationen. De kan också genomgå mognad in vitro och fungera som modeller för hjärt-kärlsjukdomar (dvs. diabetes)8 eller vävnadstropism vid virusinfektioner som SARS-CoV-211. Medan vi tidigare publicerat ett skriftligt protokoll10 finns det inget tillgängligt videoprotokoll för denna annars komplexa teknik.
Genom en kortfattad stegvis progression uppnås hBVO-bildning genom aggregatbildning, mesoderminduktion med användning av en WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) och benmorfogent protein - 4 (BMP4)12,13, vaskulär induktion via vaskulär endotelial tillväxtfaktor A (VEGFA) och Forskolin (Fors)12, och inbäddning i en anpassad groddmatris 8,10. Vaskulär mognad och nätverksbildning följer inbäddningen av aggregaten i spridningsmatrisen. Dessa mänskliga kärlnätverk bildas inom 2-3 veckor och kan avlägsnas från groddmatrisen och odlas vidare i skalbara odlingssystem i upp till 6 månader. Här tillhandahålls optiskt styrda procedurer för bildning och tillämpning av human stamcellshärledd vaskulatur.
Protocol
Alla experiment som utfördes här använde den kommersiellt tillgängliga H9 humana iPSC-linjen. Vanliga kommersiellt och icke-kommersiellt tillgängliga humana pluripotenta stamcellslinjer (dvs. H9, NC8) har också testats och visat sig vara effektiva för generering av humana blodkärlsorganoider med hjälp av detta protokoll. För detaljer, se våra tidigare publicerade rapporter 8,10.
1. Media och reagensformulering för generering av humana blodkärlsorganoider
- Förbered aggregeringsmediet.
- Blanda 40 ml knock-out DMEM/F12 (medium med låg osmolalitet utan L-glutamin eller HEPES-buffert optimerad för human ESC- och iPSC-tillväxt), 10 ml knock-out serumersättning (KOSR), 0,5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, 0,5 ml icke-essentiella aminosyror (NEAA), 35 μL beta-merkaptoetanol (BME, 100 μL 2-merkaptoetanol i 10 ml steril PBS), och Y-27632 (cellpermeabel och selektiv hämmare av Rho-associerad, lindad spole innehållande proteinkinas [ROCK] 14 [10 mM] vid 1:200) (se materialförteckning).
- Förbered N2B27 (N2 och B27 kompletterat basmedium).
- Blanda 25 ml DMEM/F12, 25 ml neurobasala medier, 1 ml B27-tillskott, 0,5 ml N2-tillskott, 250 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85 % NaCl och 35 μL beta-merkaptoetanol (se materialtabell).
- Förbered mesoderminduktionsmediet.
- Tillägg N2B27 medium med ChiR (12 μM, GSK3a / b-hämmare stimulerande mesoderm induktion) och BMP-4 (30 ng / ml, MSX2 aktivator inducerande mesoderm härstamning).
OBS: Lager (ChiR): 10 mM (använd 1:833 eller 1,2 μL / ml N2B27). Lager (BMP-4): 100 μg/ml (använd 1:3333 eller 0,3 μl/ml N2B27) (se materialförteckning).
- Tillägg N2B27 medium med ChiR (12 μM, GSK3a / b-hämmare stimulerande mesoderm induktion) och BMP-4 (30 ng / ml, MSX2 aktivator inducerande mesoderm härstamning).
- Förbered vaskulärt induktionsmedium.
- Tillägg N2B27 medium med VEGFA (100 ng / ml) och forskolin (2 μM) (se Materialförteckning).
- Förbered den extracellulära matrisen (ECM).
- Använd 1 ml ECM för en brunn på en 12-brunnsplatta (för inbäddning av 30-50 aggregat). Av 1 ml ECM-lösning som används för varje brunn, använd 0,5 ml för att skapa ett bottenskikt, "lager 1", som kommer att fungera som en ECM-grund och 0,5 ml plus aggregat för toppskiktet, "lager 2". Genom att använda detta tillvägagångssätt får ECM-suspensionen tillräckligt med utrymme och stöd för att de mänskliga blodkärlsnätverken ska gro i alla riktningar.
OBS: Totalt innehåller 1 ml ECM 500 μL renat bovint kollagen typ I, 250 μL solubiliserad basalmembranmatris utsöndrad av Engelbreth-Holm-Swarm mussarkomceller (se materialtabell) och 250 μL basisk matrislösning (steg 1.5.2). Förbered den färsk och håll på is tills den är klar att användas. - För att förbereda basmatrislösningen för fyra 12-brunnsplattor (48 brunnar), blanda 5,627 ml 0,1 N NaOH, 2,498 ml 10x DMEM, 473 μL HEPES, 368 μL 7,5% natriumbikarbonat, 233 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl och 3,451 ml Hams F-12 (se materialtabell).
OBS: Den överblivna basmatrislösningen kan placeras i ett täckt 50 ml polypropenkoniskt rör med hög klarhet och förvaras vid 4 ° C för användning i upp till 2 månader.
- Använd 1 ml ECM för en brunn på en 12-brunnsplatta (för inbäddning av 30-50 aggregat). Av 1 ml ECM-lösning som används för varje brunn, använd 0,5 ml för att skapa ett bottenskikt, "lager 1", som kommer att fungera som en ECM-grund och 0,5 ml plus aggregat för toppskiktet, "lager 2". Genom att använda detta tillvägagångssätt får ECM-suspensionen tillräckligt med utrymme och stöd för att de mänskliga blodkärlsnätverken ska gro i alla riktningar.
- Förbered spridningsmediet.
- Formulera specifikt 50 ml flexibelt serumfritt medium (SFM) för att stödja utvecklingen av humana hematopoetiska celler, en 1,3 ml alikvot av det flexibla serumfria medelnäringstillskottet, 15% fetalt bovint serum (FBS), 250 μL penicillin-streptomycin, 500 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, VEGFA (100 ng / ml) och FGF2 (100 ng / ml) (se materialförteckning).
- Förbered blockeringsbufferten.
- Blanda 0,5 g bovint serumalbumin, 1,5 ml fetalt bovint serum, 250 μl Tween 20, 250 μL Triton X-100, 500 μL natriumdeoxikolat (1% vikt/volym) och 47,5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (se materialtabell). Pipettera upp och ner tills alla komponenter är väl införlivade och lösningen är klar.
2. Underhåll och odling av humana pluripotenta och inducerade pluripotenta stamceller
- Utför cellodling med LDEV-fri basalmembranmatris med reducerad tillväxtfaktor (1:50 utspädning)-belagda 6-brunns vävnadsodlingsplattor med stamcellsodlingsmedium (se materialtabell).
- När cellerna når ~ 70% sammanflöde, passera dem med 1 ml däggdjurscelldissocierande enzym (se materialtabell) i 3-4 minuter vid 37 ° C.
OBS: Att dela cellerna i förhållandet 1: 6 förbättrar cellens livskraft och uppnår sammanflöde inom 2-4 dagar för de flesta mänskliga stamcellslinjer. För att öka cellviabiliteten används ROCK-hämmare Y-27632-kompletterat (10 mM, 1:1 000) odlingsmedium under 24 timmar efter passaging. - Byt odlingsmedium dagligen tills ett sammanflöde på 70% uppnås.
OBS: För den aktuella studien, vid 70% sammanflöde, innehåller en brunn av en 6-brunns cellodlingsplatta cirka 1 miljon H9 hPSC.
3. Dag 0 - Generering av pluripotenta aggregat från en encellssuspension
OBS: En sammanflöde på 70% i två brunnar i en 6-brunns odlingsplatta ger cirka 175 hBVO.
- Använd antingen pipett eller vakuumsystem, aspirera odlingsmediet, ersätt det med 1 ml celldissociationsreagens (se Materialförteckning) och inkubera i 5 minuter vid 37 °C.
- Medan cellerna är under celldissociationsreagenset, förbered den nödvändiga volymen aggregeringsmedium (steg 1.1) i ett 15 ml koniskt rör efter behov för önskat antal brunnar i en 6-brunns ultralåg fästodlingsplatta (se materialtabell).
- Aspirera 1 ml celldissociationsreagens och suspendera cellerna i 1 ml aggregeringsmedium. Skapa en encellssuspension med försiktig upp-ned-pipettering innan proverna räknas.
VARNING: hPSC är ganska känsliga för mekanisk påfrestning och tål inte aggressiv pipettering. - Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräkningsenhet10 eller ett standardiserat system under ett mikroskop. Beräkna det cellnummer som behövs för experimentet.
OBS: Beroende på cellinjen anses 200 000 celler / brunn till 300 000 celler / brunn vara idealisk för aggregerad bildning (dvs 4 brunnar = 800 000 till 1 200 000 celler totalt). - Tillsätt lämplig volym av cellsuspensionen till aggregeringsmediet i det 15 ml koniska röret av polypropen med hög klarhet. Pipettera försiktigt den utspädda cellsuspensionen upp och ner för att säkerställa en homogen cellfördelning.
- Pipettera 3 ml av den utspädda cellsuspensionen i varje önskad brunn på 6-brunnsodlingsplattan med ultralåg fastsättning.
- Placera plattan i inkubatorn (37 °C, 5%CO2, >90% luftfuktighet) och undvik att öppna och stänga inkubatordörrarna så mycket som möjligt.
OBS: Detta första steg genomförs bäst på kvällarna eller under låg inkubatortrafik. Även små vibrationer kan påverka ballastens storlek och form, vilket kan försämra resultaten.
4. Dag 1 - Mesoderminduktion av aggregat
- Se till att 24 timmar efter sådd är små aggregat bestående av 2-10 celler synliga under mikroskopet. Samla upp aggregaten och låt dem sedimentera innan mediet byts till mesoderminduktionsmediet (steg 1.3).
- Ställ in ett 15 ml koniskt rör med hög klarhet av polypropen per brunn på 6-brunnsodlingsplattan med ultralåg fastsättning.
- Använd en cirkulär rörelse (dvs. som en orbitalskakare) för att samla aggregaten i mitten av varje brunn, använd en 1 ml pipett för att försiktigt samla aggregaten och det omgivande mediet från varje brunn, placera dem i motsvarande 15 ml koniska rör med hög klarhet av polypropen och låt aggregaten sedimentera vid rumstemperatur.
- När den har samlats in, ställ in en timer på 1 timme, vilket är den tid som krävs för de flesta cellinjer / aggregat att sedimentera i detta skede.
OBS: Om tiden är mindre än 1 h kan man förlora alla aggregat som kanske inte har satt sig till botten av det 15 ml koniska röret. - När timmen har gått, med försiktighet, aspirera supernatanten med en pipett eller en högkänslig aspirerande pump. Se till att ballasten förblir ostörd i botten av det 15 ml koniska röret.
- Resuspendera aggregaten av varje 15 ml koniskt rör i 2 ml mesoderminduktionsmedium och placera dem tillbaka i sina respektive brunnar på 6-brunnens ultralåga fästodlingsplatta.
- Lägg tillbaka plattan i inkubatorn (37 °C) och låt den stå till dag 4.
OBS: Om aggregaten fäster och växer på eller in i varandra, med hjälp av en 1 ml pipett, pipettera försiktigt varje brunn av aggregat upp och ner en gång per dag för att hålla aggregaten lika stora.
5. Dag 4 - Vaskulär induktion och priming av aggregaten
- Samla upp aggregaten och låt dem sedimentera innan mediet byts till kärlinduktionsmediet (steg 1.4).
- Ställ in ett 15 ml koniskt rör per brunn på 6-brunnens ultralåga fästkulturplatta.
- Använd en cirkulär rörelse (dvs. som en orbitalskakare) för att samla aggregaten i mitten av varje brunn, använd en 1 ml pipett för att försiktigt samla aggregaten och det omgivande mediet från varje brunn och placera dem i motsvarande 15 ml koniska rör.
- När den har samlats in, ställ in en timer på 30 minuter så att aggregaten kan sedimentera.
OBS: En tid på 30 min krävs för de flesta cellinjer i detta skede. Om tiden är mindre än 30 minuter finns det risk för att man förlorar aggregat som kanske inte har satt sig till botten av det 15 ml koniska röret. - Efter 30 minuter, med försiktighet, aspirera supernatanten med en pipett eller en högkänslig aspirerande pump. Se till att ballasten förblir ostörd i botten av det 15 ml koniska röret.
- Resuspendera aggregaten i varje 15 ml koniskt rör i 2 ml vaskulärt induktionsmedium och placera dem tillbaka i sina respektive brunnar på 6-brunnsodlingsplattan med ultralåg fastsättning.
- Lägg tillbaka plattan i inkubatorn (37 °C) och låt den stå till dag 6.
OBS: Använd en 1 ml pipett, pipettera försiktigt varje brunn av aggregat upp och ner en gång per dag för att hålla aggregaten lika stora och förhindra att de växer in i eller fäster vid varandra.
6. Dag 6 - Inbäddning av ballastmaterial och induktion av kärlgroddar
- Medan du arbetar på is, förbered önskad slutlig volym av ECM-lösningen (steg 1.5).
OBS: Följande är protokollet för en brunn av en 12-brunnsplatta (30-50 aggregat), som kan justeras vid behov.- För en brunn av en 12-brunnsplatta, applicera 0,5 ml ECM som bottenskikt och använd 0,5 ml ECM plus aggregat på toppskiktet. Detta skapar ECM "sandwich" som är nödvändig för effektiv 3D-aggregatspiring.
- Pipettera 500 μL ECM i en brunn på en 12-brunnsplatta. Se till att inga bubblor bildas och att brunnens botten och sidomenisken är helt belagda. Detta omfattar lager 1 av ECM-smörgåsen.
- Sätt tillbaka plattan vid 37 °C i 2 timmar.
OBS: En tid på 2 h är nödvändig för effektiv polymerisation. Kortare tid riskerar att äventyra ECM:s integritet. - Mot slutet av skikt 1-polymerisation, använd en cirkulär rörelse för att samla aggregaten i mitten av varje brunn, använd en 1 ml pipett för att försiktigt samla aggregaten och det omgivande mediet från varje brunn och placera dem i motsvarande 15 ml koniska rör.
- Låt aggregaten sätta sig i 10-15 minuter och aspirera supernatanten.
- Placera aggregaten i det 15 ml koniska röret på is i 5 minuter. Under kylning, ta 12-brunnsplattan med det nu polymeriserade skiktet 1 ur inkubatorn.
OBS: Kylning av aggregaten hjälper till att förhindra tidig polymerisation av lager 2 ECM. - Arbeta snabbt och försiktigt för att förhindra bubbelbildning, resuspendera aggregaten i 500 μL ECM och pipettera ECM-aggregatsuspensionen ovanpå det redan polymeriserade skiktet 1. Var försiktig så att du inte vidrör lager 1, använd en 200 μL pipettspets för att försiktigt fördela lager 2 och aggregaten runt brunnen.
- Sätt tillbaka plattan vid 37 °C i 2 timmar.
OBS: En inkubationstid på 2 timmar är nödvändig för effektiv ECM-polymerisation. Kortare tid riskerar att äventyra ECM-integriteten och kan förhindra stark vidhäftning mellan lager 1 och lager 2. - Tillsätt 1 ml förvärmt (37 °C) groddmedium (steg 1.6) för att inducera blodkärlsdifferentiering. Spirande kärl måste visas 1 dag till 3 dagar efter inbäddning. Byt medium efter 3 dagar och sedan varannan dag.
OBS: Spridningsmediet måste förvärmas; Annars kan lageravlossning uppstå och ECM-integriteten kan påverkas.
7. Dag 11 - Isolering och mognad av BVO: erna
- Arbeta under sterila förhållanden, använd den rundade änden av en steril spatel för att lossa ECM-spiringsmatrisen som innehåller kärlnätverken. Vid detta tillfälle måste gelén likna en fritt flytande skiva.
- Använd sterila pincett och den rundade änden av en steril spatel, överför försiktigt gelskivan (inklusive kärlnätverken) till locket på en 10 cm odlingsskål.
- Placera locket plus gel under ett stereomikroskop justerat till önskad förstoring och fokus, och använd sterila nålar för att skära ut enstaka blodkärlsnätverk och försök att begränsa mängden icke-vaskulariserat ECM som erhålls i processen.
OBS: Cellerna bryter naturligt ner den omgivande ECM över tiden; Att minska mängden som skärs ut med varje organoid ökar dock bildkvaliteten och det fristående kärlnätverkets integritet. - När alla organoider har isolerats från gelén, överför dem försiktigt tillbaka till en brunn med en 6-brunnsplatta med ultralåg fastsättning med 3 ml groddmedium. I detta skede kan organoiderna lämnas över natten, eller man kan omedelbart fortsätta till steg 7.4.
- Använd en 1 ml pipett för att överföra enstaka organoider från 6-brunnsplattan till brunnarna på en 96-brunnsplatta med extremt låg fastsättning. Efter överföring tillsätts 200 μl förvärmt (37 °C) groddmedium till varje brunn på 96-brunnsplattan.
OBS: En brunn av vaskulära organoider från en 12-brunnsplatta måste fylla 30-40 brunnar på en 96-brunnsplatta. - Vid 4-6 dagar efter isolering i 96-brunnsplattorna, se till att organoiderna har en rund och hälsosam morfologi. I detta skede är organoiderna redo att fixeras och förberedas för färgning.
8. Dag 15 - Fixering, blockering och färgning av BVO: erna
- Använd en skuren 1 ml spets och överför organoiderna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Var försiktig för att undvika aspiration av BVO, använd en 200 μL eller 1,000 μL pipett för att avlägsna det återstående groddmediet i mikrocentrifugröret och tillsätt sedan 1 ml 4% PFA i PBS i 1 h.
OBS: Fixering på en orbitalskakapparat (125 rpm) vid rumstemperatur rekommenderas. Högst 60 BVO/mikrocentrifugrör är acceptabelt. Alla fler BVO kommer att försämra fixeringen och tvätteffekten.
VARNING: PFA är en skadlig kemikalie. Använd den med försiktighet i dragskåp och följ tillverkarens bruksanvisning och lämpliga bortskaffningsmetoder. - Tvätta de nyligen fixade BVO: erna 3x i 15 minuter varje gång med 0,25% PBS-Tween.
- Om organoiderna är större än 1 mm i diameter, permeabilisera BVO: erna med 1% Triton X-100 i PBS i 30-60 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera alla 0,25 % PBS-Tween och tillsätt 1 ml blockerande buffert (steg 1,7).
OBS: Även om det är antikroppsberoende är 2 timmar vid rumstemperatur på en orbitalskakare (125 rpm) tillräckligt för att minska icke-specifik antikroppsbindning under färgningsprocessen. Organoiderna kan lämnas i blockeringsbufferten vid 4 °C i upp till 2 veckor. - Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt den primära antikroppen (1:100) utspädd i 1 ml av blockeringsbufferten. Förvaras vid 4 °C vid en orbitalskakapparat (12 varv/min) och säkerställ att organoiden/organoiderna förblir nedsänkta i den primära antikroppslösningen.
OBS: Primär antikroppsinkubation över natten är lämplig för de antikroppar som används för denna studie. De nödvändiga primära och sekundära antikropparna och deras respektive utspädningar anges i materialtabellen. - Efter primär antikroppsinkubation över natten, ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta 3x i 15 minuter varje gång med 0,25% PBS-Tween.
- Tillsätt den sekundära antikroppen (1:250) plus DAPI (1:1 000) utspädd i 1 ml blockerande buffert och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur eller 4 °C över natten.
OBS: Om proverna bereds korrekt (enligt beskrivningen ovan) är inkubation i 2 timmar vid rumstemperatur eller vid 4 °C över natten lämplig för de antikroppar som används i den aktuella studien. - Efter inkubation, ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta 3x i 15 minuter varje gång med 0,25% PBS-Tween.
OBS: Efter färgningen kan organoiderna förvaras i PBS i upp till 2 veckor.
9. Montering av blodkärlsorganoider (BVO)
- Limma monteringsdistanser på önskade bildtäckglas (se Materialförteckning).
- Använd en 1 mm pipettspets med en 1 ml pipett för att överföra enstaka organoider till distansbrunnarna och aspirera återstående PBS.
- Fyll brunnen med 150–200 μl rensningslösning (se materialförteckning) uppvärmd till 75 °C, helt nedsänkt organoiden.
OBS: Proverna ska bli klara inom 1 timme efter exponering för den uppvärmda rensningslösningen.- Låt organoiderna bli klara i en täckt låda i mörkret vid rumstemperatur i 6 timmar till över natten om 1 timmars rensningstid är otillräcklig. Om du lämnar provet över natten, se till att det har tillräckligt med rensningslösning för att undvika uttorkning.
- Efter rensning aspirerar du försiktigt rensningslösningen med en pipettspets på 100–200 μl. Manövrera försiktigt organoiden till mitten av distansbrunnen och tillsätt droppar monteringsgel (se materialtabell) (uppvärmd till 75 ° C i ett kontrollerat värmeblock) tills brunnen är full.
- Placera försiktigt det andra täckglaset ovanpå monteringsdistansen för att försegla proverna i utrymmet mellan botten- och topplocket. Låt monteringsgelen härda i mörker vid 4 °C över natten.
OBS: Efter härdningen kan topplackat nagellack användas för att ytterligare försegla de monterade proverna.
Representative Results
Stegen som beskrivs i detta protokoll utvecklades specifikt för att ge en kontrollerad och exakt metod för generering av humana blodkärlsorganoider från hPSC. Genereringen av ballast med en diameter på 30–100 μm från hPSC-kulturer utgör protokollets utgångspunkt (figur 1, figur 2B). Aggregaten leds genom stegvisa induktioner mot mesoderm (dag 1 dag 4) och vaskulära linjer (dag 4 dag 6) före inbäddning (dag 6) (figur 2A-D), vilket är nödvändigt för bildandet av kärlnätverk. Spirande nästan radiellt symmetriska kärl skall vara synlig med d7 eller d8 (figur 2E) och fortsätta genom d10 (figur 2F,G). Explantationen av hBVOs från ECM till 96-brunns ultralåga fästplattor minskar bräckligheten i groddnätverken och möjliggör fortsatt underhåll i suspensionskultur (figur 2H) förhållanden i upp till 6 månader. Vid d15 uppvisar hBVO: erna ett omfattande och anslutet endotelialt (CD31 +) nätverk omgivet av pericyter (PDGFR-ß +) och glatt muskelaktin (SMA +) (figur 3A-D). Ett kontinuerligt kollagen IV (ColIV +) basalmembran omsluter kärlnätverken (figur 3E). Endotelceller (CD31+, VE-Cadherin+) och pericyter (PDGFR-ß+) utgör cirka 30%-35% respektive 60%-65% av organoidcellpopulationerna8. Den aktiva spiringen av kärlen sker under ledning av en endogent organiserad spetscell (CD31 +) -population som uppvisar typisk spetscellmorfologi, såsom överdriven filipodia 8,10. Presentationen av PDGFR-ß+ och SMA+ väggceller som kapslar in endotelkärlsnätverken kan ses av d15 i organoidmognadsprocessen (figur 3A, C). Efter avlägsnande från ECM och mognad i suspensionskulturen (dvs. d15) är hBVOs hållbara för respektive analys eller transplantation under musnjurkapseln.
Figur 1: Schematisk bild av hBVO-protokollet som belyser tidpunkten och stegvis progression. Från till synes homogena hPSC- eller hiPSC-kulturer sker aggregerad bildning i närvaro av Rho-kinashämmaren Y27632. BMP4 och CHiR-kompletterat medium används för att instruera aggregaten mot det mesodermala ödet. Mesoderm induktionsmedium ersätts av VEGFA och forskolin-kompletterat medium för att stimulera aggregaten mot en vaskulär härstamning. Mekaniska och kemiska köer som uppnås genom inbäddning av aggregaten i en kollagen I och solubiliserad basalmembranmatris och exponering för VEGFA- och FGF2-innehållande medium resulterar i nästan radiellt symmetrisk vaskulär spiring från aggregatkroppen. De genererade kärlnätverken kan avlägsnas från kollagen I och solubiliserat basalmembran och placeras i suspensionskultur för vidare mognad, analys eller transplantation in vivo. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Stegvis progression av hBVO-generationen fångad under ljusfält. (A) Typisk morfologi för hPSC (H9)-kolonier dag −1. (B) Generering av hPSC-aggregat (dag 0) på 6-brunns ultralåga fästplattor i närvaro av Y-27632. (C) Mesodermal induktion av ballast med hjälp av BMP4- och ChiR-kompletterat medium (dag 1). Subtila förändringar i aggregatstorlek och form kan också observeras. (D) Dag 4 aggregat grundade mot en vaskulär härstamning med användning av VEGFA och forskolin-kompletterat medium. (E) Tidig kärlspirning på dag 7, en dag efter inbäddning av aggregaten i groddmatrisen och exponering för VEGFA och FGF2-kompletterat groddmedium (dag 7). (F) Frisk organoidmorfologi och fortsatt kärlspiring på dag 9. (G) Kärl i sen fas som spirar på dag 10. Helst har de täta cellstrukturerna vid organoidcentret försvunnit vid denna tid. H) Typisk morfologi hos mogna (dag 15) organoider i mänskliga blodkärl. Avlägsnandet av den omgivande matrisen genom skärning och mognad i 96-brunnsodlingsplattor med ultralåg infästning formar organoiderna sfäriskt, med kärlnätverken inrymda internt. Skalstänger: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm. (G,H) 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Helmonterad färgning av mogna (dag 15) organoider i mänskliga blodkärl. (A) Presentation av mogna (dag 15) humana blodkärlsorganoider med självorganiserade endoteliala (CD31 +, magenta) nätverk och omgivande pericyt (PDGFR-β+, cyan) och alfa-glatt muskelaktin (SMA +, gul) täckning. (B) Högre förstoring av A som beskriver uttrycket SMA+ (gult) och PDGFR-β+ (cyan) i fartygsnätverken. (C) Detaljerad presentation av endotelial (CD31 +, magenta), pericyt (PDGFR-β +, cyan) och alfa-glatt muskelaktin (SMA +, gul) interaktion. (D) Helmonterad färgning av kärlets endotelial (CD31+, magenta)-glatta muskelinteraktion (SMA+, gul) i ett tvärsnitt (vänster) och en högre förstoring (höger) av mogna blodkärlsorganoider. (E) Självstyrd bildning av ett vaskulärt basalmembran (Col IV+, gråskala) genom nära förening av väggcellerna och endotelrören. Skalstreck: (A,D[vänster]) 100 μm; (B,D[höger],E) 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
De senaste genombrotten i stamcellshärledda organoidkulturer har gett ramverket för mer avancerade och fysiologiskt relevanta modeller av mänsklig vaskulatur. Den mänskliga blodkärlsorganoidmodellen (hBVO) som presenteras här, utvecklad i vårt laboratorium 8,10, ger ett kraftfullt sätt att utforska inte bara ytterligare aspekter av mänsklig vaskulogenes utan också nya vägar för sjukdomsmodellering och regenerativ terapi 8,10,11. Flera in vivo-modeller har använts för att utforska utveckling och mognad av blodkärl, kärlsjukdom och endoteldysfunktion 3,4. Olika tillvägagångssätt kombinerar enstaka och flera härstamningsdefinierade celler antingen härledda från stamceller eller isolerade från vuxna vävnader in vivo för att skapa replikativa humana vaskulära nätverk 5,6. Protokollet som presenteras här utnyttjar principen om utvecklingsbiologi och självorganisation för att ge det första mänskliga blodkärlsnätverket någonsin med flera celler som i huvudsak kan genereras från en enda hPSC 8,10.
Varje stamcellslinje har en unik genetisk sammansättning och skiljer sig från andra när det gäller dess källa, funktion och lyhördhet15. Därför utvecklades och optimerades protokollet för humana blodkärlsorganoider (hBVO) för att säkerställa en robust och reproducerbar protokollkompatibilitet med flera (>12) olika hPSC-linjer 8,10. Metoden som beskrivs här genererar hPSC-härledda blodkärlsorganoider under 2 veckor. Förändringar i mediesammansättningen och/eller teknikerna vid hBVO-generering kan dock leda till ineffektivt kärlnätverk och organoidgenerering. De varierande spridningshastigheterna för enskilda stamcellslinjer påverkar också markant reproducerbarheten av stamcellsexperiment15 och därmed organoidkulturer. Till exempel, vid generering av BVO: er, är mer proliferativa celler eller högre antal stora dag 1-aggregat i sig föremål för olika metaboliska miljöer och gas- och näringsdiffusionsparametrar. Detta förändrar i sin tur tillväxtfaktorns exponeringstider och effektivitet, graden av differentiering och vaskulär priming, och, viktigast av allt, förmågan att bilda kärlnätverk vid inbäddning av aggregaten i kollagen 1 och solubiliserad basalmembranmatris.
Den passiva diffusionen av syre och administrering av väsentliga näringsämnen från en yttre miljö är inte idealisk för långsiktig celltillväxt av 3D-organoider och vävnadsmorfogenes in vitro16. Även om det är beroende av flera faktorer (dvs. vävnadens metaboliska hastighet, biotillgängligheten av näringsämnen och gaser, en statisk eller dynamisk miljö) har ett allmänt gränsvärde på 150 μmO2 och näringsdiffusion fastställts för vävnader som odlas in vitro, med tanke på att mänskliga vävnader fysiologiskt uppvisar strängar av levande celler inom 150 μm från perfuserade blodkärl17. Även om effektiva gas- och näringsdiffusionsavstånd på 70-200 μm också har föreslagits18,19,20,21, påverkar konstruktionsdensiteten, temperaturen, pH och mediekompositionen signifikant diffusionseffektiviteten. På grund av ytoptimering och integrin-beta-receptorkommunikation efter inbäddning dag 6 presterar aggregat med en diameter på 250-300 μm bättre än de >500-600 μm i diameter, vilket resulterar i en komplett kärlspirningsprocess och en minimalt kondenserad organoidkärna. Således är den aggregerade storleken avgörande och kan påverkas av både antalet celler som används under den initiala sådden och den tid som tilldelats för aggregatbildning. Mikrobrunnsplattor som möjliggör kontroll över aggregatstorleken och nummer22 är ett livskraftigt alternativ till den annars stokastiska ballastbildningstekniken som härrör från användningen av 6-brunnsplattor med ultralåg fastsättning i detta protokoll. Konsekvens i timing och hantering av aggregatstorlekarna under de första 6 dagarna av hBVO-protokollet är en av, om inte den mest, avgörande indikatorn för att framgångsrikt utveckla bona fide blodkärlorganoider.
Medieförändringar dag 1 (mesoderminduktion) och dag 4 (vaskulär induktion) måste slutföras i kombination med sedimentering av aggregaten. Även om centrifugering är ett frestande alternativ, kan de ytterligare krafterna som appliceras på de svagt monterade aggeraten orsaka oönskad klumpning, montering och skjuvning, vilket negativt påverkar differentiering, mognad och spirande effektivitet i de senare stadierna av protokollet. Att arbeta på is under dag 6-inbäddningsprocessen är avgörande för att bevara korrekt ECM-polymerisation och skiktbildning. Under inbäddningen och spiringinduktionen kommer exponering av ECM för temperaturer över 4 ° C och / eller ett annat ECM-pH än 7,4 att påverka inte bara polymerisationshastigheterna och ECM-skiktets integritet utan också spridningseffektiviteten hos de inbäddade aggregaten. ECM-groddmatrisens elastiska natur möjliggör enkel lossning och transport från odlingsskålen med 12 brunnar till den sterila skärytan. Individuella organoider som avlägsnas från matrisen och överförs till 96-brunnsplattor med ultralåg infästning kommer att konsumera den återstående omgivande ECM och behålla självorganiserade väggcellsbelagda endotelmikrokärlnätverk med ett kontinuerligt källarmembran.
Även om det inte omfattas av detta förslag kan ändringar av mediekompositionerna replikera sjukdomar som i sin tur framkallar patologiska reaktioner i hBVO 8,11. Gränserna för sjukdomsmodellering med hBVO-systemet är långt ifrån kända, och detta är verkligen ett område som behöver utforskas. Tillämpningen av vår blodkärlsorganoidteknologi vid vaskularisering av tidigare avaskulära organoidkonstruktioner23 är också av betydande inverkan och intresse.
Disclosures
Det finns inget samband mellan författarnas ekonomiska intressen och den forskning som presenteras. Blodkärlsorganoidtekniken har licensierats till Stemcell Technologies. J.M.P. är grundare och aktieägare i Angios Biotech som utvecklar blodkärlsorganoider som vaskulär transplantationsterapi. En patentansökan relaterad till detta arbete har lämnats in under Pat. No. US20200199541A1 och listade Reiner A. Wimmer, Josef M. Roper och Dontscho Kerjaschki som uppfinnare.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i våra laboratorier för kritiska synpunkter och diskussioner. JMP fick finansiering från T. von Zastrow-stiftelsen, FWF Wittgenstein-priset (Z 271-B19), den österrikiska vetenskapsakademin, det gemensamma företaget för innovativa läkemedel 2 (JU) enligt bidragsavtal nr 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program och Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 samt Canadian Institutes of Health Research COVID-19-bidrag F20-02343 och F20-02015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
| 7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
| Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
| Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
| Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
| Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
| Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
| BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
| CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
| CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
| Cellulose wipes | |||
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
| CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
| Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
| Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
| Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | |||
| Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
| Eppendorf tubes | |||
| Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
| Fine forceps | FST | 11254-20 | |
| Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
| Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
| Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
| KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
| PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
| PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
| Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
| PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
| RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
| Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
| SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
| Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
| Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
| Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
| StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
| Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
| Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
| Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 |
References
- Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
- Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
- Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
- Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581 (2018).
- Risau, W.
- Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
- Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).
- Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
- Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
- Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
- Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846 (2014).
- Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
- McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
- McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
- Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
- Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
- Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).
- Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707 (2022).
