Summary
Denne protokollen beskriver genereringen av selvorganiserende blodkar fra humane pluripotente og induserte pluripotente stamceller. Disse blodkarnettverkene viser et omfattende og tilkoblet endotelnettverk omgitt av pericytter, glatt muskelaktin og en kontinuerlig kjellermembran.
Abstract
En organoid er definert som et konstruert multicellulært in vitro-vev som etterligner det tilsvarende in vivo-organet slik at det kan brukes til å studere definerte aspekter av det organet i en vevskulturskål. Bredden og anvendelsen av human pluripotent stamcelle (hPSC) -avledet organoid forskning har avansert betydelig for å inkludere hjernen, netthinnen, tårekanalen, hjertet, lunge, tarm, bukspyttkjertel, nyre og blodkar, blant flere andre vev. Utviklingen av metoder for generering av humane mikrofartøyer har spesielt åpnet veien for modellering av utvikling av humane blodkar og sykdom in vitro og for testing og analyse av nye stoffer eller vevstropisme ved virusinfeksjoner, inkludert SARS-CoV-2. Komplekse og lange protokoller som mangler visuell veiledning, hindrer reproduserbarheten til mange stamcelleavledede organoider. I tillegg nødvendiggjør den iboende stokastisiteten til organoiddannelsesprosesser og selvorganisering generering av optiske protokoller for å fremme forståelsen av celleskjebneoppkjøp og programmering. Her presenteres en visuelt guidet protokoll for generering av 3D humane blodkarorganoider (BVOer) konstruert fra hPSCs. Ved å presentere en kontinuerlig kjellermembran, vaskulære endotelceller og organisert artikulasjon med veggmalericeller, viser BVO-er de funksjonelle, morfologiske, og molekylære egenskapene til human mikrovaskulatur. BVO-dannelse initieres gjennom aggregatdannelse, etterfulgt av mesoderm og vaskulær induksjon. Vaskulær modning og nettverksdannelse initieres og støttes ved å legge inn aggregater i en 3D-kollagen og solubilisert kjellermembranmatrise. Menneskelige fartøynettverk dannes i løpet av 2-3 uker og kan videreutvikles i skalerbare kultursystemer. Det er viktig at BVOer transplanteres i immunkompromitterte musanastomose med den endogene musesirkulasjonen og spesifiserer i funksjonelle arterier, vener og arterioler. Den nåværende visuelt styrte protokollen vil fremme menneskelig organoidforskning, spesielt i forhold til blodkar i normal utvikling, vevvaskularisering og sykdom.
Introduction
Vaskulær dysfunksjon og blodkarsykdommer presenterer markerte komplikasjoner i organfunksjoner. Kardiovaskulær sykdom (CVD) er den ledende dødsårsaken over hele verden1 og er også den primære medvirkende faktoren til å øke helsekostnadene i USA. Antallet tilfeller av CVD øker årlig, og et økende antall av disse tilfellene forekommer i yngre aldersgrupper (20-45 år)2. Flere in vivo-modeller er utviklet for å utforske utvikling og modning av blodkar, vaskulær sykdom og endoteldysfunksjon 3,4. For tiden kan metoder som kombinerer enkle og flere avstamningsdefinerte celler, enten avledet fra stamceller eller isolert fra voksenvev in vivo, skape vaskulære nettverk som replikerer aspekter av human vaskulær funksjon og anatomi 5,6. Blodkar har dukket opp som et av de første funksjonelle systemene under utvikling fra mesoderm, og de organiserer seg enten gjennom en monteringsprosess kalt "vaskulogenese" eller ved utvidelse og forgrening fra eksisterende kar, som kalles "angiogenese"7.
Ved å utnytte kraften i utviklingsbiologi og selvstyrt forsamling, rapporterte Wimmer et al. de første selvorganiserende 3D humane blodkarorganoider fra hPSCs som viser de funksjonelle, morfologiske og molekylære egenskapene til menneskelig mikrovaskulatur8. I likhet med menneskelig vaskulatur9 genereres og presenteres disse hBVOene med et endotel, en kontinuerlig kjellermembran og omkringliggende veggmalericeller 8,10. hBVOene kan transplanteres in vivo og anastomoseres med den endogene sirkulasjonen. De kan også gjennomgå modning in vitro og tjene som modeller for kardiovaskulære sykdommer (dvs. diabetes)8 eller vevstropisme i virusinfeksjoner som SARS-CoV-211. Mens vi tidligere publiserte en skriftlig protokoll10, finnes det ingen tilgjengelig videoprotokoll for denne ellers komplekse teknikken.
Gjennom en kortfattet trinnvis progresjon oppnås hBVO-dannelse gjennom aggregatdannelse, mesoderminduksjon ved bruk av en WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) og benmorfogent protein - 4 (BMP4)12,13, vaskulær induksjon via vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA) og Forskolin (Fors)12, og innebygging i en tilpasset spirematrise 8,10. Vaskulær modning og nettverksdannelse følger innebygging av aggregatene i spirematrisen. Disse menneskelige fartøynettverkene dannes innen 2-3 uker og kan fjernes fra spirematrisen og videre vokse i skalerbare kultursystemer i opptil 6 måneder. Her er optisk veiledede prosedyrer gitt for dannelse og anvendelse av human stamcelleavledet vaskulatur.
Protocol
Alle eksperimenter utført her brukte den kommersielt tilgjengelige H9 humane iPSC-linjen. Vanlige kommersielt og ikke-kommersielt tilgjengelige humane pluripotente stamcellelinjer (dvs. H9, NC8) har også blitt testet og vist seg effektive for generering av humane blodkarorganoider ved bruk av denne protokollen. For detaljer, se våre tidligere publiserte rapporter 8,10.
1. Medie- og reagensformulering for generering av humane blodkarorganoider
- Forbered aggregeringsmediet.
- Bland 40 ml utslått DMEM/F12 (medium med lav osmolalitet uten L-glutamin eller HEPES-buffer optimalisert for human ESC- og iPSC-vekst), 10 ml serumerstatter (KOSR), 0,5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85 % NaCl, 0,5 ml ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 35 μl beta-merkaptoetanol (BME, 100 μL 2-merkaptoetanol i 10 ml steril PBS), og Y-27632 (cellepermeabel og selektiv hemmer av Rho-assosiert, spiralholdig proteinkinase [ROCK]14 [10 mM] ved 1:200) (se materialtabell).
- Forbered N2B27 (N2 og B27 supplert basisk medium).
- Bland 25 ml DMEM / F12, 25 ml neurobasal media, 1 ml B27-supplement, 0,5 ml N2-tilskudd, 250 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl og 35 mikrol beta-merkaptoetanol (se materialfortegnelse).
- Forbered mesoderminduksjonsmediet.
- Suppler N2B27 medium med ChiR (12 μM, GSK3a/b-hemmer stimulerer mesoderminduksjon) og BMP-4 (30 ng/ml, MSX2-aktivator induserer mesodermavstamning).
MERK: Lager (ChiR): 10 mM (bruk 1:833, eller 1,2 μL / ml N2B27). Lager (BMP-4): 100 μg/ml (bruk 1:3333 eller 0,3 μL/ml N2B27) (se materialtabell).
- Suppler N2B27 medium med ChiR (12 μM, GSK3a/b-hemmer stimulerer mesoderminduksjon) og BMP-4 (30 ng/ml, MSX2-aktivator induserer mesodermavstamning).
- Forbered vaskulært induksjonsmedium.
- Suppler N2B27 medium med VEGFA (100 ng/ml) og forskolin (2 μM) (se materialfortegnelse).
- Forbered den ekstracellulære matrisen (ECM).
- Bruk 1 ml ECM for en brønn på en 12-brønnsplate (for innebygging av 30-50 aggregater). Av 1 ml ECM-løsning som brukes for hver brønn, bruk 0,5 ml for å lage et bunnlag, "lag 1", som vil fungere som et ECM-fundament, og 0,5 ml pluss aggregater for topplaget, "lag 2". Ved hjelp av denne tilnærmingen gir, gjennom ECM-suspensjonen, tilstrekkelig plass og støtte for at de menneskelige blodkarnettverkene kan spire i alle retninger.
MERK: Totalt inneholder 1 ml ECM 500 μL renset bovint kollagen type I, 250 μL løselig kjellermembranmatrise utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm-musesarkomceller (se materialfortegnelse) og 250 μL grunnmatriksløsning (trinn 1.5.2). Forbered den frisk og hold på is til den er klar til bruk. - For å klargjøre grunnmatriseløsningen for fire 12-brønnsplater (48 brønner), bland 5,627 ml 0,1 N NaOH, 2,498 ml 10x DMEM, 473 μL HEPES, 368 μL 7,5 % natriumbikarbonat, 233 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85 % NaCl og 3,451 ml Hams F-12 (se materialtabell).
MERK: Den gjenværende grunnmatriksoppløsningen kan plasseres i et lukket 50 ml konisk rør av polypropylen med høy klarhet og oppbevares ved 4 °C for bruk i opptil 2 måneder.
- Bruk 1 ml ECM for en brønn på en 12-brønnsplate (for innebygging av 30-50 aggregater). Av 1 ml ECM-løsning som brukes for hver brønn, bruk 0,5 ml for å lage et bunnlag, "lag 1", som vil fungere som et ECM-fundament, og 0,5 ml pluss aggregater for topplaget, "lag 2". Ved hjelp av denne tilnærmingen gir, gjennom ECM-suspensjonen, tilstrekkelig plass og støtte for at de menneskelige blodkarnettverkene kan spire i alle retninger.
- Forbered spiremediet.
- Spesielt formulere 50 ml fleksibelt serumfritt medium (SFM) for å støtte utviklingen av humane hematopoietiske celler, en 1,3 ml alikot av det fleksible serumfrie medium næringstilskuddet, 15% føtal bovint serum (FBS), 250 μL penicillin-streptomycin, 500 μL 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, VEGFA (100 ng / ml) og FGF2 (100 ng / ml) (se materialtabell).
- Forbered blokkeringsbufferen.
- Bland 0,5 g bovint serumalbumin, 1,5 ml føtal bovint serum, 250 mikrol mellom 20, 250 mikrol Triton X-100, 500 mikrol natriumdeoksykolat (1 % vekt/vol-stam) og 47,5 ml 1x fosfatbufret saltvann (se materialfortegnelse). Pipett opp og ned til alle komponentene er godt innarbeidet og løsningen er klar.
2. Vedlikehold og dyrkning av humane pluripotente og induserte pluripotente stamceller
- Utføre cellekultur ved bruk av LDEV-fri basementmembranmatrise med redusert vekstfaktor (1:50 fortynning)-belagte 6-brønns vevskulturplater med stamcellekulturmedium (se materialtabell).
- Når cellene når ~ 70% konfluens, passér dem ved hjelp av 1 ml pattedyrcelledissosierende enzym (se materialtabell) i 3-4 minutter ved 37 ° C.
MERK: Splitting av cellene i forholdet 1: 6 forbedrer cellens levedyktighet og oppnår konfluens innen 2-4 dager for de fleste menneskelige stamcellelinjer. For å øke cellenes levedyktighet, brukes ROCK-inhibitor Y-27632-supplert (10 mM, 1:1,000) kulturmedium i 24 timer etter passasje. - Endre kulturmediet daglig til en sammenløp på 70% er nådd.
MERK: For denne studien, ved 70% sammenløp, inneholder en brønn av en 6-brønns cellekulturplate rundt 1 million H9 hPSCs.
3. Dag 0 - Generering av pluripotente aggregater fra en enkeltcellesuspensjon
MERK: En sammenløp på 70% i to brønner på en 6-brønns kulturplate vil gi ca. 175 hBVOer.
- Bruk enten en pipette eller et vakuumsystem, aspirer kulturmediet, erstatt det med 1 ml celledissosiasjonsreagens (se materialtabellen) og inkuber i 5 minutter ved 37 °C.
- Mens cellene er under celledissosiasjonsreagenset, klargjør det nødvendige volumet av aggregeringsmedium (trinn 1.1) i et 15 ml konisk rør etter behov for ønsket antall brønner i en 6-brønns ultra-lav vedleggskulturplate (se materialtabell).
- Aspirer 1 ml av celledissosiasjonsreagens, og suspender cellene i 1 ml aggregeringsmedium. Lag en encelles suspensjon med forsiktig opp-ned pipettering før du teller prøvene.
FORSIKTIG: hPSC er ganske følsomme for mekanisk belastning og tåler ikke aggressiv pipettering. - Tell cellene ved hjelp av en automatisert celletelleenhet10 eller et standardisert system under et mikroskop. Beregn cellenummeret som trengs for eksperimentet.
MERK: Avhengig av cellelinjen anses 200.000 celler / brønn til 300.000 celler / brønn som ideell for aggregatdannelse (dvs. 4 brønner = 800.000 til 1.200.000 celler totalt). - Tilsett passende volum av cellesuspensjonen til aggregeringsmediet i 15 ml konisk polypropylenrør med høy klarhet. Pipetter den fortynnede cellesuspensjonen forsiktig opp og ned for å sikre en homogen cellefordeling.
- Pipett 3 ml av den fortynnede cellesuspensjonen i hver ønsket brønn på 6-brønns dyrkningsplaten med ultralavt festeinnhold.
- Plasser platen i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2, >90% fuktighet), og unngå å åpne og lukke inkubatordørene så mye som mulig.
MERK: Dette første trinnet fullføres best om kvelden eller under lav inkubatortrafikk. Selv små vibrasjoner kan påvirke størrelsen og formen på aggregatene, noe som kan svekke resultatene.
4. Dag 1 - Mesoderm induksjon av aggregater
- Sørg for at 24 timer etter såing, små aggregater bestående av 2-10 celler er synlige under mikroskopet. Samle aggregatene, og la dem sette seg før du endrer mediet til mesoderminduksjonsmediet (trinn 1.3).
- Sett opp ett 15 ml konisk polypropylenrør med høy klarhet per brønn på den 6-brønns ultra-lave festeplaten.
- Bruk en sirkulær bevegelse (dvs. som en orbital shaker) for å samle aggregatene i midten av hver brønn, bruk en 1 ml pipette for å forsiktig samle aggregatene og det omkringliggende mediet fra hver brønn, plasser dem i deres tilsvarende 15 ml høyklare polypropylen koniske rør, og la aggregatene sedimentere ved romtemperatur.
- Når den er samlet, sett en timer på 1 time, som er tiden som kreves for de fleste cellelinjer / aggregater å sedimentere på dette stadiet.
MERK: Hvis tiden er mindre enn 1 time, kan man miste aggregater som kanskje ikke har lagt seg til bunnen av det koniske røret på 15 ml. - Når timen har gått, må du forsiktig aspirere supernatanten med en pipette eller en aspirasjonspumpe med høy følsomhet. Sørg for at aggregatene forblir uforstyrret i bunnen av det koniske røret på 15 ml.
- Resuspender aggregatene av hvert 15 ml konisk rør i 2 ml mesoderminduksjonsmedium, og plasser dem tilbake i deres respektive brønner på 6-brønns ultra-low attachment culture plate.
- Legg platen tilbake i inkubatoren (37 °C), og la den stå til dag 4.
MERK: Hvis aggregatene fester seg og vokser på eller inn i hverandre ved hjelp av en 1 ml pipette, pipetterer du forsiktig hver brønn med tilslag opp og ned en gang per dag for å holde aggregatene like store.
5. Dag 4 - Vaskulær induksjon og priming av aggregatene
- Samle aggregatene, og la dem sette seg før du endrer mediet til det vaskulære induksjonsmediet (trinn 1.4).
- Sett opp ett 15 ml konisk rør per brønn på den 6-brønns ultra-lave festekulturplaten.
- Bruk en sirkulær bevegelse (dvs. som en orbital shaker) for å samle aggregatene i midten av hver brønn, bruk en 1 ml pipette for å forsiktig samle aggregatene og det omkringliggende mediet fra hver brønn, og plasser dem i deres tilsvarende 15 ml koniske rør.
- Når den er samlet, sett en timer i 30 minutter for å la aggregatene sedimentere.
MERK: En tid på 30 min er nødvendig for de fleste cellelinjer på dette stadiet. Hvis tiden er mindre enn 30 min, er det fare for å miste tilslag som kanskje ikke har lagt seg til bunnen av det koniske røret på 15 ml. - Etter 30 minutter, med forsiktighet, aspirer supernatanten med en pipette eller en aspirasjonspumpe med høy følsomhet. Sørg for at aggregatene forblir uforstyrret i bunnen av det koniske røret på 15 ml.
- Resuspender aggregatene av hvert 15 ml konisk rør i 2 ml vaskulært induksjonsmedium, og plasser dem tilbake i deres respektive brønner på 6-brønns ultra-lav festekulturplate.
- Legg platen tilbake i inkubatoren (37 °C), og la den stå til dag 6.
MERK: Bruk en 1 ml pipette til å pipette hver brønn med tilslag opp og ned én gang per dag for å holde aggregatene like store og hindre at de vokser inn i eller fester seg til hverandre.
6. Dag 6 - Aggregat embedding og fartøyspire induksjon
- Mens du arbeider på is, klargjør du ønsket sluttvolum av ECM-løsningen (trinn 1.5).
MERK: Følgende er protokollen for en brønn på en 12-brønns plate (30-50 aggregater), som kan justeres etter behov.- For en brønn på en 12-brønnsplate, bruk 0,5 ml ECM som bunnlag, og bruk 0,5 ml ECM pluss aggregater på topplaget. Dette skaper ECM "sandwich" som er nødvendig for effektiv 3D-aggregatspiring.
- Pipett 500 μL ECM i en brønn på en 12-brønnsplate. Sørg for at det ikke dannes bobler og at brønnbunn- og sidemenisken er helt belagt. Dette omfatter lag 1 av ECM-sandwichen.
- Sett platen tilbake ved 37 °C i 2 timer.
MERK: En tid på 2 timer er nødvendig for effektiv polymerisering. Kortere tid risikerer å kompromittere ECM-integriteten. - Mot slutten av lag 1-polymerisasjonen, bruk en sirkulær bevegelse for å samle aggregatene i midten av hver brønn, bruk en 1 ml pipette for å forsiktig samle aggregatene og det omkringliggende mediet fra hver brønn, og plasser dem i deres tilsvarende 15 ml koniske rør.
- La aggregatene legge seg i 10-15 min, og aspirer supernatanten.
- Plasser aggregatene i det koniske røret på 15 ml på is i 5 minutter. Under avkjøling, ta 12-brønnplaten med det nå polymeriserte lag 1 ut av inkubatoren.
MERK: Kjøling av aggregatene bidrar til å forhindre tidlig polymerisering av lag 2 ECM. - Arbeid raskt og forsiktig for å forhindre bobledannelse, resuspender aggregatene i 500 μL ECM, og pipett ECM-aggregatsuspensjonen på toppen av det allerede polymeriserte laget 1. Vær forsiktig så du ikke berører lag 1, og bruk en 200 μL pipettespiss for å forsiktig fordele lag 2 og aggregatene rundt brønnen.
- Sett platen tilbake ved 37 °C i 2 timer.
MERK: En inkubasjonstid på 2 timer er nødvendig for effektiv ECM-polymerisering. Kortere tid risikerer å kompromittere ECM-integriteten og kan forhindre sterk vedheft mellom lag 1 og lag 2. - Tilsett 1 ml forvarmet (37 °C) spiremedium (trinn 1,6) for å indusere differensiering av blodkar. Spirende fartøy må vises 1 dag til 3 dager etter innebygging. Bytt medium etter 3 dager og deretter annenhver dag.
NOTAT: Spiremediet må være forvarmet; Ellers kan det oppstå lagavløsning, og ECM-integriteten kan påvirkes.
7. Dag 11 - Isolering og modning av BVOene
- Arbeid under sterile forhold, bruk den avrundede enden av en steril spatel for å løsne ECM-spiringmatrisen som inneholder de vaskulære nettverkene. På dette stadiet må gelen ligne en frittflytende disk.
- Bruk steril tang og den avrundede enden av en steril spatel, overfør forsiktig gelskiven (inkludert de vaskulære nettverkene) til lokket på en 10 cm kulturfat.
- Plasser lokket pluss gel under et stereomikroskop justert til ønsket forstørrelse og fokus, og bruk sterile nåler til å kutte ut enkeltblodkarnettverk, og prøv å begrense mengden ikke-vaskularisert ECM oppnådd i prosessen.
MERK: Cellene nedbryter naturlig den omkringliggende ECM over tid; Å redusere mengden kuttet ut med hver organoid øker imidlertid bildekvaliteten og det frittstående fartøyets nettverksintegritet. - Når alle organoider er isolert fra gelen, overfør dem forsiktig tilbake til en brønn med en 6-brønnsplate med ultralavt vedlegg med 3 ml spirende medium . På dette stadiet kan organoidene stå over natten, eller man kan umiddelbart fortsette til trinn 7.4.
- Bruk en 1 ml pipette til å overføre enkeltorganoider fra 6-brønnsplaten til brønnene i en 96-brønnsplate med ultralavt vedlegg. Når den er overført, tilsett 200 μL forvarmet (37 °C) spiremedium til hver brønn på 96-brønnplaten.
MERK: En brønn med vaskulære organoider fra en 12-brønnsplate må fylle 30-40 brønner på en 96-brønnsplate. - Ved 4-6 dager etter isolering i 96-brønnplatene, sørg for at organoidene har en rund og sunn morfologi. På dette stadiet er organoidene klare til å festes og tilberedes for farging.
8. Dag 15 - Fiksering, blokkering og farging av BVOene
- Bruk en kuttet 1 ml spiss, overfør organoidene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Vær forsiktig med å unngå aspirasjon av BVOer, bruk en 200 μL eller 1,000 μL pipette for å fjerne det gjenværende spiremediet i mikrosentrifugerøret, og tilsett deretter 1 ml 4% PFA i PBS i 1 time.
MERK: Fiksering på en orbital shaker (125 rpm) ved romtemperatur anbefales. Maksimalt 60 BVO/mikrosentrifugerør er akseptabelt. Eventuelle flere BVOer vil svekke fikserings- og vaskeeffektiviteten.
FORSIKTIG: PFA er et skadelig kjemikalie. Bruk den med forsiktighet i en avtrekkshette, og følg produsentens bruksanvisning og passende avhendingsmetoder. - Vask de nylig faste BVOene 3x i 15 min hver gang med 0,25% PBS-Tween.
- Hvis organoidene er større enn 1 mm i diameter, permeabiliser BVOene med 1% Triton X-100 i PBS i 30-60 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer alle 0,25% PBS-Tween, og legg til 1 ml blokkeringsbuffer (trinn 1,7).
MERK: Selv om antistoffavhengig, er 2 timer ved romtemperatur på en orbital shaker (125 rpm) tilstrekkelig til å redusere ikke-spesifikk antistoffbinding under fargeprosessen. Organoidene kan ligge i blokkeringsbufferen ved 4 °C i opptil 2 uker. - Fjern blokkeringsbufferen og tilsett det primære antistoffet (1:100) fortynnet i 1 ml av blokkeringsbufferen. Oppbevares over natten ved 4 °C på en orbital shaker (12 rpm), og sikre at organoiden(e) forblir nedsenket i den primære antistoffløsningen.
MERK: Primær antistoffinkubasjon over natten er egnet for antistoffene som brukes i denne studien. De nødvendige primære og sekundære antistoffene og deres respektive fortynninger er angitt i materialfortegnelsen. - Etter primær antistoffinkubasjon over natten, fjern den primære antistoffløsningen og vask 3x i 15 minutter hver gang med 0,25% PBS-Tween.
- Tilsett det sekundære antistoffet (1:250) pluss DAPI (1:1000) fortynnet i 1 ml blokkerende buffer, og inkuber i 2 timer ved romtemperatur eller ved 4 °C over natten.
MERK: Hvis prøvene tilberedes riktig (som beskrevet ovenfor), er inkubasjon i 2 timer ved romtemperatur eller ved 4 °C over natten egnet for antistoffene som ble brukt i denne studien. - Etter inkubering, fjern den sekundære antistoffoppløsningen, og vask 3x i 15 minutter hver gang med 0,25% PBS-Tween.
MERK: Etter fargingen kan organoidene oppbevares i PBS i opptil 2 uker.
9. Montering av blodkarorganoider (BVO)
- Lim avstandsstykker på ønskede bildedeksler (se materialfortegnelse).
- Bruk en 1 ml pipette til å overføre enkle organoider til avstandsbrønnene ved hjelp av en kuttet 1 ml pipette og aspirer gjenværende PBS.
- Fyll brønnen med 150-200 μL ryddeoppløsning (se materialfortegnelse) oppvarmet til 75 °C, og senk organoiden helt.
MERK: Prøvene skal bli klare innen 1 time etter eksponering for den oppvarmede clearingoppløsningen.- La organoidene bli klare i en tildekket boks i mørket ved romtemperatur i 6 timer til over natten hvis 1 times ryddetid er utilstrekkelig. Hvis du lar prøven stå over natten, må du sørge for at den har nok ryddeoppløsning for å unngå uttørking.
- Etter tømming, aspirer ryddeoppløsningen forsiktig med en 100-200 μL pipettespiss. Manøvrer organoiden forsiktig til midten av avstandsstykket godt, og tilsett dråper monteringsgel (se materialfortegnelse) (oppvarmet til 75 °C i en kontrollert varmeblokk) til brønnen er full.
- Plasser forsiktig den andre dekselslipen på toppen av monteringsavstandsstykket for å forsegle prøvene i rommet mellom bunn- og toppdekselene. La monteringsgelen herde i mørket ved 4 °C over natten.
MERK: Etter herdingen kan topplakk med neglelakk brukes til å forsegle de monterte prøvene ytterligere.
Representative Results
Trinnene beskrevet i denne protokollen ble utviklet spesielt for å gi en kontrollert og presis metode for generering av humane blodkarorganoider fra hPSCs. Genereringen av aggregater på 30-100 μm i diameter fra hPSC-kulturer markerer utgangspunktet for protokollen (figur 1, figur 2B). Aggregatene ledes gjennom trinnvise induksjoner mot mesoderm (dag 1-dag 4) og vaskulære linjer (dag 4-dag 6) før innebygging (dag 6) (figur 2A-D), som er nødvendig for dannelse av fartøynettverk. Nær-radialt symmetrisk karspiring må være synlig ved d7 eller d8 (figur 2E) og fortsette gjennom d10 (figur 2F,G). Eksplantasjonen av hBVOene fra ECM til 96-brønns ultra-lave festeplater reduserer skjørheten til spirenettverkene og muliggjør fortsatt vedlikehold i fjæringskulturforhold (figur 2H) i opptil 6 måneder. Ved d15 viser hBVOene et omfattende og tilkoblet endotelnettverk (CD31+) omgitt av pericytter (PDGFR-ß+) og glatt muskelaktin (SMA+) (figur 3A-D). En kontinuerlig kollagen IV (ColIV+) kjellermembran omslutter karnettene (figur 3E). Endotelceller (CD31+, VE-Cadherin+) og pericytter (PDGFR-ß+) utgjør henholdsvis ca. 30%-35% og 60%-65% av organoidcellepopulasjonene8. Den aktive spiringen av karene skjer under ledelse av en endogent organisert spisscellepopulasjon (CD31+) som presenterer typisk spisscellemorfologi, slik som overdreven filipodia 8,10. Presentasjonen av PDGFR-ß+ og SMA+ veggmalericeller som innkapsler endotelkarnettverkene kan sees ved d15 i den organoide modningsprosessen (figur 3A,C). Etter fjerning fra ECM og modning i suspensjonskultur (dvs. d15), er hBVOene holdbare for respektive analyser eller transplantasjon under nyrekapselen fra mus.
Figur 1: Skjematisk av hBVO-protokollen som fremhever timing og trinnvis progresjon. Fra tilsynelatende homogene hPSC- eller hiPSC-kulturer oppstår aggregatdannelse i nærvær av Rho-kinaseinhibitoren Y27632. BMP4 og CHiR-supplert medium brukes til å instruere aggregatene mot mesodermal skjebne. Mesoderm induksjonsmedium erstattes av VEGFA og forskolin-supplert medium for å stimulere aggregatene mot en vaskulær avstamning. Mekaniske og kjemiske køer oppnådd gjennom innebygging av aggregatene i en kollagen I og solubilisert kjellermembranmatrise og eksponering for VEGFA og FGF2-holdig medium resulterer i nesten radialt symmetrisk vaskulær spiring fra aggregatlegemet. De genererte karnettverkene kan fjernes fra kollagen I og løselig kjellermembran og plasseres i suspensjonskultur for videre modning, analyse eller transplantasjon in vivo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvis progresjon av hBVO-generasjonen fanget under brightfield. (A) Typisk morfologi av hPSC (H9) kolonier på dag −1. (B) Generering av hPSC-aggregater (dag 0) på 6-brønns ultra-lave festeplater i nærvær av Y-27632. (C) Mesodermal induksjon av aggregater ved bruk av BMP4 og ChiR-supplert medium (dag 1). Subtile endringer i samlet størrelse og form kan også observeres. (D) Dag 4 aggregater primet mot en vaskulær avstamning ved bruk av VEGFA og forskolin-supplert medium. (E) Tidlig spiring på dag 7, en dag etter at aggregatene er lagt inn i spirematrisen og eksponering for VEGFA og FGF2-supplert spiremedium (dag 7). (F) Sunn organoid morfologi og fortsatt spiring på dag 9. (G) Senfasefartøy som spirer på dag 10. Ideelt sett har de tette cellestrukturene i organoidsenteret forsvunnet på dette tidspunktet. (H) Typisk morfologi av modne (dag 15) humane blodkarorganoider. Fjerningen av den omkringliggende matrisen ved kutting og modning i 96-brønns kulturplater med ultralavt feste former organoidene sfærisk, med fartøyets nettverk plassert internt. Skala barer: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Helmontert farging av modne (dag 15) humane blodkarorganoider. (A) Presentasjon av modne (dag 15) humane blodkarorganoider med selvorganiserte endotelnettverk (CD31+, magenta) og omkringliggende pericyttnettverk (PDGFR-β+, cyan) og alfa-glatt muskelaktin (SMA+, gul). (B) Høyere forstørrelse av A som beskriver SMA+ (gul) og PDGFR-β+ (cyan) uttrykk for fartøysnettverkene. (C) Detaljert presentasjon av endotelial (CD31+, magenta), pericytt (PDGFR-β+, cyan) og alfa-glatt muskelaktin (SMA+, gul) interaksjon. (D) Helmontert farging av karendotelial (CD31+, magenta)-glatt muskulatur (SMA+, gul) interaksjon i et tverrsnitt (venstre) og en høyere forstørrelse (høyre) av modne blodkarorganoider. (E) Selvstyrt dannelse av en vaskulær kjellermembran (Col IV +, gråtoner) gjennom nær tilknytning av veggmalericeller og endotelrør. Skalastenger: (A,D[venstre]) 100 μm; (B,D[høyre],E) 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Nylige gjennombrudd i stamcelleavledede organoidkulturer har gitt rammen for mer avanserte og fysiologisk relevante modeller av menneskelig vaskulatur. Den humane blodkarorganoidmodellen (hBVO) som presenteres her, utviklet i vårt laboratorium 8,10, gir et kraftig middel til å utforske ikke bare ytterligere aspekter av human vaskulogenese, men også nye veier for sykdomsmodellering og regenerativ terapi 8,10,11. Flere in vivo-modeller har blitt brukt til å utforske utvikling og modning av blodkar, vaskulær sykdom og endoteldysfunksjon 3,4. Varierende tilnærminger kombinerer enkle og flere avstamningsdefinerte celler enten avledet fra stamceller eller isolert fra voksne vev in vivo for å skape replikerende humane vaskulære nettverk 5,6. Protokollen som presenteres her utnytter prinsippet om utviklingsbiologi og selvorganisering for å gi de første flercellede avstamningsnettverkene av menneskelige blodkar som i hovedsak kan genereres fra en enkelt hPSC 8,10.
Hver stamcellelinje har en unik genetisk sammensetning og skiller seg fra andre når det gjelder kilde, funksjon og respons15. Derfor ble protokollen for humane blodkarorganoider (hBVOer) utviklet og optimalisert for å sikre en robust og reproduserbar protokollkompatibilitet med flere (>12) forskjellige hPSC-linjer 8,10. Metoden beskrevet her genererer hPSC-avledede blodkarorganoider over 2 uker. Imidlertid kan endringer i mediesammensetningen og eller teknikkene i hBVO-generering føre til ineffektivt fartøynettverk og organoidgenerering. De varierende proliferasjonshastighetene av individuelle stamcellelinjer påvirker også reproduserbarheten av stamcelleeksperimenter15 og dermed organoidkulturer. For eksempel, ved generering av BVOer, er flere proliferative celler eller høyere antall store dag 1-aggregater iboende gjenstand for forskjellige metabolske miljøer og gass- og næringsdiffusjonsparametere. Dette endrer i sin tur vekstfaktoreksponeringstider og effektivitet, graden av differensiering og vaskulær priming, og, viktigst av alt, evnen til å danne fartøynettverk ved innebygging av aggregatene i kollagen 1 og solubilisert kjellermembranmatrise.
Den passive diffusjonen av oksygen og administrering av essensielle næringsstoffer fra et eksternt miljø er ikke ideell for langsiktig cellevekst av 3D-organoider og vevsmorfogenese in vitro16. Selv om det er avhengig av flere faktorer (dvs. vevets metabolske hastighet, nærings- og gassbiotilgjengeligheten, et statisk eller dynamisk miljø), er det etablert en generell 150 μmO2 og næringsdiffusjonsgrense for vev dyrket in vitro, med tanke på at fysiologisk humant vev presenterer ledninger av levende celler innen 150 μm perfuserte blodkar17. Selv om effektive gass- og næringsdiffusjonsavstander på 70-200 μm også har blitt foreslått18,19,20,21, påvirker konstruksjonstettheten, temperaturen, pH og mediesammensetningen diffusjonseffekten betydelig. På grunn av overflatearealoptimalisering og integrin-beta-reseptorkommunikasjon etter dag 6-innebygging, fungerer aggregater på 250-300 μm i diameter bedre enn de >500-600 μm i diameter, noe som resulterer i en komplett spiringsprosess og en minimalt kondensert organoidkjerne. Dermed er den samlede størrelsen avgjørende og kan påvirkes av både antall celler som brukes under den første såingen og tiden som er tildelt for aggregatdannelse. Microwell-plater som tillater kontroll over aggregatstørrelse og antall22 er et levedyktig alternativ til den ellers stokastiske aggregatdannelsesteknikken som følge av bruk av 6-brønnsplater med ultralavt feste i denne protokollen. Konsistens i timing og styring av de samlede størrelsene i løpet av de første 6 dagene av hBVO-protokollen er en av, om ikke den mest, avgjørende indikatorene for vellykket utvikling av bona fide blodkarorganoider.
Middels forandringer dag 1 (mesoderminduksjon) og dag 4 (vaskulær induksjon) må fullføres i kombinasjon med sedimentering av aggregatene. Selv om sentrifugering er et fristende alternativ, kan de ekstra kreftene som påføres de svakt monterte aggeratene forårsake uønsket klumping, montering og skjæring, noe som negativt påvirker differensiering, modning og spiringseffektivitet i de senere stadiene av protokollen. Arbeid på is i dag 6 innebyggingsprosess er avgjørende for å bevare riktig ECM-polymerisering og lagdannelse. Under den samlede innebyggings- og spiringsinduksjonen vil eksponering av ECM for temperaturer over 4 °C og/eller en ECM pH annet enn 7,4 ikke bare påvirke polymerisasjonshastighetene og ECM-lagsintegriteten, men også spiringseffektiviteten til de innebygde aggregatene. Den elastiske naturen til ECM-spirematrisen muliggjør enkel løsrivelse og transport fra 12-brønnskulturskålen til den sterile skjæreflaten. Individuelle organoider fjernet fra matrisen og overført til 96-brønnsplater med ultralavt vedlegg vil konsumere de gjenværende omkringliggende ECM og beholde selvorganiserte veggmalericellebelagte endotelmikrofartøynettverk med en kontinuerlig kjellermembran.
Selv om det ikke dekkes av dette forslaget, kan endringer i mediesammensetningene replikere sykdommer som igjen provoserer patologiske responser i hBVOs 8,11. Grensene for sykdomsmodellering ved hjelp av hBVO-systemet er langt fra kjent, og dette er absolutt et område som trenger utforskning. Anvendelsen av vår blodkarorganoidteknologi i vaskularisering av tidligere avaskulære organoidkonstruksjoner23 er også av betydelig innvirkning og interesse.
Disclosures
Det er ingen sammenheng mellom forfatternes økonomiske interesser og forskningen som presenteres. Blodkarorganoidteknologien er lisensiert til Stemcell Technologies. J.M.P. er grunnlegger og aksjonær i Angios Biotech som utvikler blodkarorganoider som vaskulær transplantasjonsterapi. En patentsøknad knyttet til dette arbeidet er innlevert under pat. nr. US20200199541A1, og lister opp Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger og Dontscho Kerjaschki som oppfinnere.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av våre laboratorier for kritiske innspill og diskusjoner. JMP mottok finansiering fra T. von Zastrow-stiftelsen, FWF Wittgenstein-prisen (Z 271-B19), det østerrikske vitenskapsakademiet, Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) under tilskuddsavtale No 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program og Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 samt Canadian Institutes of Health Research COVID-19-tilskudd F20-02343 og F20-02015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
| 7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
| Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
| Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
| Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
| Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
| B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
| Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
| BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
| CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
| CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
| Cellulose wipes | |||
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
| CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
| Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
| Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
| Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | |||
| Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
| Eppendorf tubes | |||
| Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
| Fine forceps | FST | 11254-20 | |
| Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
| Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
| Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
| KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
| PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
| PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
| Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
| PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
| RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
| Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
| SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
| Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
| Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
| Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
| StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
| Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
| Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
| Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
| Y-27632 | Calbiochem | 688000 |
References
- Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
- Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
- Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
- Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581 (2018).
- Risau, W.
- Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
- Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).
- Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
- Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
- Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
- Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846 (2014).
- Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
- McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
- McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
- Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
- Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
- Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).
- Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707 (2022).
