Summary
Utilizziamo semplici strumenti di laboratorio per esaminare l'architettura del sistema di root (RSA) di Arabidopsis e Medicago. Le piantine vengono coltivate idroponicamente su rete e distribuite usando un pennello artistico per rivelare la RSA. Le immagini vengono scattate utilizzando la scansione o una fotocamera ad alta risoluzione, quindi analizzate con ImageJ per mappare i tratti.
Abstract
Una conoscenza completa dello sviluppo dell'architettura del sistema radicale delle piante (RSA) è fondamentale per migliorare l'efficienza nell'uso dei nutrienti e aumentare la tolleranza delle cultivar alle sfide ambientali. Viene presentato un protocollo sperimentale per la configurazione del sistema idroponico, la crescita delle piantine, la diffusione di RSA e l'imaging. L'approccio ha utilizzato un sistema idroponico a base di scatola magenta contenente rete in polipropilene supportata da cunei in policarbonato. Le impostazioni sperimentali sono esemplificate valutando l'RSA delle piantine sotto apporto variabile di nutrienti (fosfato [Pi]). Il sistema è stato istituito per esaminare la RSA di Arabidopsis, ma è facilmente adattabile per studiare altre piante come Medicago sativa (Alfalfa). Le piantine di Arabidopsis thaliana (Col-0) sono utilizzate in questa indagine come esempio per comprendere la pianta RSA. I semi vengono sterilizzati in superficie trattando etanolo e candeggina commerciale diluita e mantenuti a 4 °C per la stratificazione. I semi vengono germinati e coltivati su un mezzo liquido semi-MS su una rete di polipropilene sostenuta da cunei in policarbonato. Le piantine vengono coltivate in condizioni di crescita standard per il numero desiderato di giorni, raccolte delicatamente dalla rete e immerse in piastre di agar contenenti acqua. Ogni apparato radicale delle piantine viene distribuito delicatamente sulla piastra piena d'acqua con l'aiuto di un pennello rotondo. Queste lastre di Petri vengono fotografate o scansionate ad alta risoluzione per documentare i tratti RSA. I tratti radice, come la radice primaria, le radici laterali e la zona di ramificazione, vengono misurati utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente. Questo studio fornisce tecniche per misurare le caratteristiche delle radici delle piante in ambienti ambientali controllati. Discutiamo su come (1) coltivare le piantine e raccogliere e diffondere campioni di radici, (2) ottenere immagini di campioni RSA diffusi, (3) acquisire le immagini e (4) utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare gli attributi radice. Il vantaggio del presente metodo è la misurazione versatile, facile ed efficiente dei tratti RSA.
Introduction
L'architettura del sistema radicale (RSA), che è sotterranea, è un organo vitale per la crescita e la produttività delle piante 1,2,3. Dopo lo stadio embrionale, le piante subiscono i loro cambiamenti morfologici più significativi. Il modo in cui le radici crescono nel terreno influisce notevolmente sulla crescita delle parti delle piante fuori terra. La crescita delle radici è il primo passo nella germinazione. È un tratto informativo in quanto risponde in modo univoco ai diversi nutrienti disponibili 1,2,3,4. L'RSA presenta un alto grado di plasticità dello sviluppo, il che significa che l'ambiente viene sempre utilizzato per prendere decisioni sullo sviluppo 2,5. I cambiamenti nell'ambiente hanno reso la produzione agricola più difficile nello scenario attuale. Su base continuativa, la RSA incorpora i segnali ambientali nelle scelte di sviluppo5. Di conseguenza, una conoscenza approfondita dei principi alla base dello sviluppo delle radici è essenziale per imparare come le piante rispondono ai cambiamenti ambientali 2,5.
L'RSA rileva concentrazioni variabili di nutrienti e rende alterazioni fenotipiche 4,6,7,8,9,10,11,12. Gli studi suggeriscono che la morfologia delle radici/RSA è altamente plastica rispetto alla morfologia del germoglio 1,3. La mappatura dei tratti RSA è altamente efficace nel registrare l'effetto del cambiamento dell'ambiente circostante del suolo 1,11,12.
In generale, discrepanze nell'effetto di varie carenze nutrizionali sul fenotipo radicale sono state riportate in molti studi precedenti 3,11,13,14,15. Ad esempio, ci sono diversi rapporti contrastanti sui cambiamenti indotti dalla fame di fosfato (Pi) nel numero, nella lunghezza e nella densità delle radici laterali (LR). Un aumento della densità di LR è stato riportato nella condizione di deficit di Pi 6,8. Al contrario, una diminuzione della densità di LR in condizioni di carenza di Pi greco è stata riportata anche da altri autori 3,13,16. Una delle cause principali di queste incongruenze è l'uso del mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare, che l'agar spesso contiene10. I ricercatori in genere coltivano le loro piante sperimentali su un sistema di piastre a base di agar e registrano i tratti delle radici. Numerosi tratti RSA sono spesso nascosti o trincerati all'interno del materiale agar e non possono essere documentati. Gli esperimenti legati all'induzione di carenza di nutrienti, in cui gli utenti spesso escludono totalmente un componente dal mezzo, non possono essere eseguiti in un mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare11,14,15. Numerosi nutrienti sono frequentemente presenti in quantità significative nei mezzi agar, tra cui P, Zn, Fe e molti altri11,14,15. Inoltre, la crescita dell'RSA è più lenta nei terreni a base di agar rispetto ai mezzi liquidi non a base di agar. Di conseguenza, è necessario stabilire un approccio alternativo non basato su agar per quantificare e registrare qualitativamente il fenotipo di RSA. Di conseguenza, è stato sviluppato il metodo attuale, in cui le piantine vengono allevate in un sistema idroponico a base di scatola magenta in cima a una rete di polipropilene supportata da cunei in policarbonato 1,10,11.
Questo studio presenta una versione improvvisata dettagliata del metodo precedente descritto da Jain et al.10. Questa strategia è stata messa a punto per le attuali esigenze della biologia delle radici delle piante e può essere utilizzata anche per piante come l'erba medica, diverse dalle piante modello. Il protocollo è il modo principale per misurare i cambiamenti in RSA e richiede solo apparecchiature semplici. Il presente protocollo illustra come fenotipizzare diverse caratteristiche della radice, come le radici primarie e laterali in mezzo normale e modificato (deficit di Pi greco). Vengono fornite indicazioni passo-passo e altri suggerimenti utili raccolti dalle esperienze dell'autore per aiutare i ricercatori a seguire le metodologie offerte in questo metodo. Il presente studio mira a fornire un metodo semplice ed efficace per rivelare l'intero apparato radicale delle piante, compresi gli LR di ordine superiore. Questo metodo prevede la diffusione manuale del sistema radicale con un pennello rotondo per acquerello, consentendo un controllo preciso sull'esposizione delle radici 1,10,11,12. Non richiede attrezzature costose o software complicati. Questo metodo ha migliorato l'assorbimento dei nutrienti e il tasso di crescita; Le piante hanno una soluzione ricca di sostanze nutritive facilmente assorbita dalle loro radici. Il presente metodo è adatto per i ricercatori che desiderano mappare i tratti del sistema radicale di una pianta in dettaglio, in particolare durante lo sviluppo precoce (10-15 giorni dopo la germinazione). È adatto per piccoli sistemi radicali, piante modello come Arabidopsis e tabacco e piante non convenzionali come l'erba medica fino a quando il loro apparato radicale non si adatta alle scatole magenta.
Le fasi per l'analisi fenotipica dello sviluppo di RSA in Arabidopsis sono descritte in questo protocollo come segue: (1) il metodo di sterilizzazione della superficie del seme per le piante (Arabidopsis), (2) le fasi per impostare il sistema idroponico, seguite dalla semina dei semi su un terreno, (3) procedura per estrarre le piantine complete e spargere sulla piastra di Petri per l'analisi RSA, (4) come registrare le immagini per RSA e (5) calcolare importanti parametri RSA utilizzando il software ImageJ.
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Protocol
L'intero protocollo è riassunto schematicamente nella Figura 1, mostrando tutti i passaggi essenziali coinvolti nella rivelazione dell'architettura del sistema di root (RSA) delle piantine. I passaggi del protocollo sono riportati in dettaglio di seguito:
1. Sterilizzazione della superficie dei semi di Arabidopsis
- Trasferire un piccolo misurino (circa 100 semi = circa 2,5 mg) di semi in un tubo di microfuge e immergere per 30 minuti in acqua distillata a temperatura ambiente (RT). L'intera procedura viene eseguita in condizioni asettiche.
- Centrifugare brevemente il tubo di microfuge contenente semi a 500 x g per 5 s, usando qualsiasi centrifuga da tavolo a RT per lasciare che i semi si depositino.
- Decantare l'acqua, aggiungere 700 μL di etanolo al 70% (v/v), vortice per alcuni secondi e centrifugare. Ripetere il vortice e la rotazione se necessario, ma assicurarsi che il tempo di trattamento del 70% di etanolo rimanga a 3 minuti.
- Dopo 3 minuti, sciacquare immediatamente una volta con acqua sterile. Mantenere la fase di lavaggio dell'etanolo il più tempestiva possibile, poiché l'esposizione prolungata all'etanolo diminuisce la germinazione.
- Trattare i semi con candeggina commerciale diluita (4% v/v) con una goccia di Tween-20 per 7 minuti. Mescolare i semi con la soluzione di candeggina capovolgendo rapidamente i tubi 8-12 volte, seguita da una breve centrifuga (500 x g per 5 s a RT). La schiuma è vista apparire nel tubo.
- Decantare il surnatante con una pipetta da 1 mL e sciacquare i semi con almeno cinque lavaggi con acqua sterile, seguendo la stessa procedura di vortice.
- Lasciare i semi sterilizzati in superficie in acqua e incubare per 2-3 giorni a 4 °C per la stratificazione10.
2. Impostazione di un sistema idroponico per la germinazione dei semi
- Riempire a metà una scatola standard di magenta con acqua distillata e sterilizzarla in autoclave. Autoclavare il foglio di policarbonato (colore chiaro e texture liscia) e tagliare rettangoli di 4 cm x 8 cm, con un punto medio dentellato più di metà del rettangolo in modo che due rettangoli possano incastrarsi insieme per formare una forma X10. Utilizzare questa configurazione per tenere la rete in polipropilene (quadrati di 6 cm x 6 cm di dimensione dei pori di 250 μm, o a seconda del requisito) tagliata da fogli 12x 24 pollici10.
NOTA: Il polipropilene è altamente resistente agli acidi, agli alcali e ad altre sostanze chimiche; pertanto, è stato optato. L'autoclave tende a distorcere la rete in polipropilene; Quindi, si consiglia di essere trasportato separatamente avvolto in un foglio di alluminio. Si raccomandano condizioni tipiche di autoclave di 16 min, 121 °C, 15 psi o 775 mm Hg. - Aggiungere mezzi basali sterili semi-MS con vitamine + 1,5% (p / v) di saccarosio, come descritto da Shukla et al.1, a ciascuna scatola per raggiungere il bordo inferiore della rete di polipropilene in un flusso laminare. Tutte le procedure vengono eseguite in condizioni asettiche.
- Seminare i semi sterilizzati in superficie sulla rete (dimensione dei pori di 250 μm) idroponicamente e lasciarli crescere per 3 giorni.
- Dopo 3 giorni, trasferire le piantine su una rete (dimensione dei pori di 500 μm) e lasciarle crescere per 2 giorni.
- Dopo 2 giorni (totale di 5 giorni), trasferire le piantine sui terreni di controllo (cioè terreni nutritivi MS modificati 1 contenenti 2,0 mM NH 4 NO 3, 1,9 mM KNO3, 0,15 mM MgSO 4·7H2O,0,1 mM MnSO 4· H 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μM Na 2 MoO4·2H2O, 1,5% saccarosio, 1,25 mM MES, pH 5,7 aggiustato con 0,1 M MES [pH 6,1]) e ai terreni sperimentali (ad esempio, trattamento P- [0 mM]; KH2 PO 4 è sostituito con 0,62 mM K2SO4 dalla composizione del mezzo di controllo come indicato sopra1. Per i trattamenti con Pi in eccesso, la concentrazione di KH 2 PO4 viene aumentata nel mezzo MS modificato [2,5, 5,0, 10,0, 20,0 mM]1) e lascia crescere i semi per 7 giorni.
NOTA: Una dimensione dei pori a maglia più ampia (500 μm) facilita la raccolta regolare di intere piantine senza alcun danno o necessità di taglio all'ipocotile. Le piantine crescono in condizioni di crescita standard (cioè 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro, 150 μmol·m-2·s-1 di intensità luminosa, 60%- 70% di umidità) a 23 °C.
3. Esame della RSA
- Preparare piastre di agar (1,1%) per lo spargimento delle radici (dimensioni della piastra di Petri: 150 mm x 15 mm).
- Aggiungere 10-20 ml di acqua di rubinetto filtrata in autoclave alla piastra di Petri, come menzionato sopra. Estrarre delicatamente le piantine dalla rete (500 μm) e immergerle in acqua sui piatti.
- Stendere delicatamente la radice di ogni piantina nel piatto pieno d'acqua con l'aiuto di un pennello rotondo per acquerello (dimensioni: n. 14, 16, 18 e 20).
NOTA: Mentre si esegue la diffusione del sistema di root, prima afferrare la radice primaria e diffonderla in linea retta, poiché funge da asse. Quindi, distribuire gli LR simmetricamente su ciascun lato della radice primaria, ove possibile. Successivamente, diffondi il LR del secondo ordine collegato al LR del primo ordine. Questo processo di diffusione è una sorta di arte; fallo delicatamente, lentamente, come un artista che disegna un'immagine della RSA. - Inclinare leggermente la piastra per rimuovere l'acqua.
NOTA: A questo punto, la procedura può essere messa in pausa mettendo queste piastre di diffusione a 4 °C. Successivamente, quando è necessaria l'elaborazione delle immagini, estrarre le lastre e posizionarle su RT per un po '. Pulire l'acqua condensata, quindi l'immagine può essere elaborata comodamente.
4. Registrazione di immagini per RSA
- Scansiona o fotografa queste lastre di Petri in modo appropriato.
NOTA: per ottenere fotografie di alta qualità, si consiglia la risoluzione di 600 dpi per la scansione e almeno una fotocamera da 12 megapixel per la fotografia. - Misurare le caratteristiche dell'architettura del sistema radice utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) disponibile gratuitamente. Per seguire rapidamente i passaggi per misurare la lunghezza della radice utilizzando il software ImageJ, fare riferimento all'esempio "misurazione della lunghezza del contorno del DNA"17.
NOTA: questi passaggi vengono seguiti per misurare le lunghezze delle radici sulle immagini acquisite utilizzando uno scanner o una fotocamera ad alta risoluzione.- Utilizzare una determinata distanza di lunghezza per impostare la scala. La distanza nota della barra della scala nella figura 3 è di 2 cm. Selezionate lo strumento Linea retta dalla barra degli strumenti ImageJ (quinto strumento da sinistra). Usate lo strumento linea retta per creare una selezione di linea che delinei la barra della scala. Completare la struttura facendo clic con il pulsante destro del mouse, facendo doppio clic o facendo clic nella casella all'inizio.
- Misurare la lunghezza della barra della scala nota in pixel utilizzando la barra degli strumenti Analizza > misura . Prendi nota della lunghezza in pixel.
- Aprire la finestra di dialogo Imposta scala facendo clic sulla scheda Imposta scala nella scheda Analizza. Nel campo Distanza in pixel, immettete la lunghezza in pixel (come indicato sopra). Quindi, nel campo Distanza nota, inserisci il valore, come mostrato dalla barra della scala (qui, è 20 mm). Impostare l'unità di lunghezza come mm. Le proporzioni pixel sono 1,0. Ora, la scala è specificata dal numero x di pixel per millimetro. Per bloccare la scala per questa particolare immagine, fare clic su OK.
- Create una selezione di linea che delinei la lunghezza della radice utilizzando lo strumento Linea segmentata . Completare la struttura facendo clic con il pulsante destro del mouse, facendo doppio clic o facendo clic nella casella all'inizio. Fare clic e trascinare le piccole "maniglie" bianche e nere lungo il contorno per regolare la selezione della linea in base alle esigenze.
- Utilizzare il comando Misura nella scheda Analizza di ImageJ per quantificare la lunghezza della radice. Per trasferire i dati misurati in un foglio di calcolo, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra Risultati , selezionare Copia tutto dal menu a comparsa, passare al foglio di calcolo, quindi incollare i dati.
NOTA: come descritto in precedenza, impostare la scala utilizzando la distanza nota della barra della scala nell'opzione ImageJ set scale. Questo dà il numero di pixel per unità di lunghezza. È necessario impostare la scala ogni volta, ogni volta che viene analizzata una nuova immagine.
- Misurazione e calcolo dei tratti RSA
- Misurare la lunghezza della radice primaria tra la giunzione ipocotilicica e l'estremità della punta della radice.
- Misurare la lunghezza LR del primo e del secondo ordine.
- Misurare la zona di diramazione (BZ) della radice primaria. La zona di ramificazione della radice primaria (BZPR) si estende dal primo punto emergente LR all'ultimo punto emergente LR.
- Registrare il numero di LR, che è il numero di LR originati all'interno del confine del BZPR.
- Misurare la lunghezza media degli LR di primo e di ordine superiore. Ricavare la lunghezza media della LR del primo ordine (1° LR) (centimetro per radice) dividendo la lunghezza totale della 1° LR per il numero totale di 1° LR.
- Misurare la lunghezza media del LR del secondo ordine. Calcolare la lunghezza media del LR del secondo ordine (2° LR) dividendo la lunghezza totale del 2° LR per il numero totale di 2° LR.
- Misurare la densità di 1° LR. Calcolare la densità di 1° LR (numero di 1° LR per unità di lunghezza di BZ PR) dividendo il numero di 1° LR per la lunghezza del BZPR.
- Misurare la densità di 2° LR. Calcolare la densità di 2° LR dividendo il numero di 2° LR per la lunghezza del BZ di 1° LR (numero di 2° LR per unità di lunghezza del BZ di 1° radici laterali).
- Misurare la lunghezza totale della radice (TRL). Questo è l'aggregato delle lunghezze della radice primaria, 1° LR e 2° LR (e più se presente).
5. Misurazione dei peli radicali
NOTA: Sebbene il sistema idroponico non sia in grado di promuovere la crescita e lo sviluppo dei peli radicali, nonostante sia robusto come lo è nei terreni di crescita solidi, è comunque importante studiarlo nel contesto attuale. Seguire i passaggi seguenti per analizzare lo sviluppo dei peli radicali in una sezione di 5 mm dalla punta della radice primaria delle piantine.
- Tagliare una sezione di 2 cm della radice primaria dalla punta della radice.
- Montare la sezione della radice su una diapositiva utilizzando il 10% di glicerolo come mezzo di montaggio.
- Posizionare il vetrino sotto un microscopio stereo.
- Utilizzare il supporto assiale per visualizzare e catturare immagini dei peli radicali.
- Analizza le immagini per studiare la struttura e le caratteristiche dei peli radicali utilizzando il software ImageJ come descritto in precedenza.
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Representative Results
I diversi tratti morfometrici dell'architettura del sistema radicale (RSA) sono misurati utilizzando semplici strumenti di laboratorio e i passaggi sono rappresentati schematicamente nella Figura 1. I dettagli della configurazione idroponica dimostrano il potenziale del protocollo nella misurazione dell'RSA (Figura 1 e Figura 2).
Date le differenze osservate negli agenti gelificanti, abbiamo utilizzato un sistema di coltivazione idroponica per condurre tutti gli studi 3,10. Come prova di concetto, questo sistema idroponico funziona bene, riflettendo l'apparente fenotipo contrastante in condizioni di carenza di Pi e sufficiente (Figura 3). I semi di Arabidopsis sono stati coltivati idroponicamente per 5 giorni in mezzo MS su una rete di polipropilene, come illustrato nella Figura 2. Le piantine sono state trapiantate dopo 5 giorni in condizioni carenti di Pi e sufficienti e lasciate crescere per 7 giorni (Figura 3).
Dimostrazione dei tratti RSA sotto apporto di nutrienti vari (Pi)
Abbiamo seguito uno schema stabilito per analizzare e registrare i tratti di RSA3. Diversi tratti RSA sono stati analizzati in regimi Pi contrastanti in condizioni idroponiche (Figura 3). Il trattamento con deficit di Pi (0 mM Pi) ha invocato un fenotipo radicolare tipicamente riportato che mostra un RSA più corto, meno profondo e meno ramificato rispetto alla condizione sufficiente per Pi (Figura 3A). La lunghezza della radice primaria era significativamente attenuata nella condizione di carenza di Pi greco (Figura 3A,B). La lunghezza della radice primaria, rapidamente acquisita in presenza di Pi greco (1,25 mM), mostra l'efficienza del sistema idroponico riflettendo adeguatamente i cambiamenti fisiomorfologici (Figura 3A,B). Il TRL è stato significativamente ridotto nella condizione di carenza di Pi (Figura 3B). La zona di ramificazione (BZPR), come mostrato in Figura 3A, era significativamente attenuata nella condizione di carenza di Pi (Figura 3B).
Di questi tratti, il più colpito è stato il TRL, a causa dell'elevata differenza nel numero di LR tra le due condizioni Pi. La crescita vigorosa dell'RSA in condizioni di sufficiente Pi (1,25 mM) era dovuta ad un aumento significativo del numero e della lunghezza di 1° LR. Pertanto, si è verificato un rapido cambiamento di RSA, principalmente a causa dell'alterazione nello sviluppo di LR. Abbiamo misurato il numero di LR originati all'interno del confine della zona di ramificazione della radice primaria, poiché sono considerati più significativi 1,3,18. La lunghezza media del 1° LR (centimetro per radice) è stata significativamente ridotta nella condizione di carenza di Pi (Figura 3C). La lunghezza media di 2° LR è stata analogamente ridotta, a causa della condizione P0; tuttavia, era inferiore in quantità alla lunghezza media di 1° LR (Figura 3C). Il numero di 1° LR e 2° LR è fortemente diminuito nella condizione P0 rispetto alla condizione P1,25 (Figura 3D). La densità di 1° LR (numero di 1° LR per centimetro di lunghezza BZPR) non è stata modificata nella condizione P0 rispetto alla condizione P1,25 (Figura 3E). Anche la densità di 2° LR (numero di 2° LR per centimetro del BZ di 1° LR) non ha mostrato variazioni significative (Figura 3E). Di conseguenza, determinare la densità degli LR è essenziale per ottenere informazioni utili sulla plasticità RSA.
Analisi dello sviluppo dei peli radicali in vari regimi di fosfato (Pi)
L'effetto della fornitura di Pi sullo sviluppo dei peli radicali è stato studiato nella radice primaria delle piantine. È stato riscontrato che la lunghezza dei peli radicali aumentava con l'aumentare delle concentrazioni di Pi fino a 2,5 mM, ma diminuiva a 5 mM e 10 mM. Tuttavia, a 20 mM, la lunghezza dei peli radicali è tornata a livelli vicini al picco (Figura supplementare 1). Il numero di peli radicali era significativamente più alto a 0 mM rispetto a tutte le altre forniture di Pi, con il numero più alto osservato a 20 mM (Figura supplementare 1).
Applicazione del presente metodo su vegetali diversi da Arabidopsis
Abbiamo esaminato la fattibilità del presente metodo su piante diverse da Arabidopsis, prendendo Medicago sativa (Alfalfa) come pianta di prova. Il protocollo è stato modificato in base ai requisiti di due aspetti: (1) il metodo di sterilizzazione della superficie del seme e (2) la dimensione dei pori della rete in polipropilene (ora più grande, 1.000 μm). Il protocollo di sterilizzazione e stratificazione delle sementi superficiali deve sempre essere ottimizzato a seconda delle piante selezionate da studiare. Per l'erba medica, sono stati seguiti i passaggi descritti da Weeks et al.19. Dopo la sterilizzazione superficiale, i semi sono stati incubati a 4 °C per 7 giorni per la stratificazione. Successivamente, abbiamo seguito la stessa procedura descritta in questo protocollo con una modifica della dimensione dei pori della mesh. Come mostrato nella Figura 4A,B, le piantine erano ben cresciute, con un RSA alterato sotto diverse forniture di Pi. La figura 4C mostra la plasticità del sistema radicale sotto 1,25, 0 e 20 mM di soluzione nutritiva Pi. L'eccesso di Pi greco (20 mM) e l'insufficiente apporto di Pi greco hanno portato a diminuire lo sviluppo del sistema radicale, rispetto alla condizione di Pi sufficiente (1,25 mM) (controllo) (Figura 4C). L'RSA può essere mappato per diversi tratti utilizzando il software ImageJ descritto nel protocollo. Quindi, il protocollo è semplice, efficiente e può essere facilmente modificato in base alle specie vegetali selezionate. Offre l'opportunità di studiare la RSA di diverse specie vegetali in diverse condizioni nutrizionali.
Figura 1: Schema della procedura. Il diagramma schematico delinea i passaggi principali coinvolti nel protocollo del metodo per la mappatura dell'RSA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione della configurazione idroponica in scatole magenta per coltivare piantine . (Come descritto da Jain et al.10, con modifiche). (A) Due pezzi rettangolari (4 cm x 8 cm) con tacche di cunei in policarbonato per il montaggio della configurazione. (B) L'assemblaggio di cunei di policarbonato l'uno nell'altro attraverso la tacca che si trasforma in una forma a X per sostenere la superficie della rete. (C) Un foglio di maglia di polipropilene da 250 μm (6 cm x 6 cm). (D) Vista dall'alto dell'assemblaggio di cunei in policarbonato nella scatola magenta. (E) Assemblaggio della rete di polipropilene sui cunei di policarbonato in una scatola magenta riempita di supporto. (F) Un'esposizione di piantine di Arabidopsis germinate sulla maglia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Dimostrazione della modulazione tipica di RSA in condizioni nutrizionali variabili (Pi carente [0 mM] e sufficiente [1,25 mM]) utilizzando questo metodo di fenotipizzazione. Le piantine di Arabidopsis (Col-0) vengono coltivate idroponicamente in mezzi 0,5x MS per 5 giorni, e successivamente sottoposte a scorte carenti di Pi e sufficienti (0 e 1,25 mM, rispettivamente) e coltivate per 7 giorni, come mostrato nella Figura 2. (A) Le singole piantine vengono estratte dalla rete di polipropilene (500 μm) e distribuite sulle piastre di agar Petri con l'aiuto di un pennello rotondo e acqua. I dati dei tratti RSA sono presentati per (B) lunghezza della radice primaria (PR), lunghezza totale della radice (TRL), zona di ramificazione (BZ), (C) media (Media) lunghezza della radice laterale del primo ordine (lunghezza 1° LR), lunghezza media (Media) della radice laterale del secondo ordine (lunghezza 2° LR), (D) numero di 1° LR e 2° LR e (E) densità di 1° LR e 2° LR. I valori sono mezzi ± SE; n = 21. Questa cifra è stata modificata da Shukla et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Dimostrazione del sistema radicale di Medicago sativa (Alfalfa) come esempio per mostrare l'applicabilità di questo metodo ad altre piante oltre all'Arabidopsis. (A) Vista laterale della scatola magenta che mostra la crescita delle piantine di erba medica. (B) La vista dall'alto della scatola magenta mostra l'emergere del germoglio sulla rete di polipropilene (dimensione dei pori di 1.000 μm). (C) L'architettura tipica del sistema radicale (RSA) della modulazione dell'erba medica in condizioni nutrizionali variabili (Pi carente [0 mM], eccesso di Pi [20 mM] e sufficiente o di controllo [1,25 mM]) utilizzando questo metodo di fenotipizzazione RSA. Le piantine di erba medica vengono coltivate idroponicamente in mezzi MS 0,5x per 5 giorni, sottoposte a carenze di Pi, sufficienti e in eccesso (0, 1,25 e 20 mM, rispettivamente) e coltivate per 7 giorni. Le singole piantine vengono estratte dalla rete di polipropilene (1.000 μm) e distribuite sulle piastre di agar Petri, come mostrato in C, con l'aiuto di un pennello artistico e acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Diverse concentrazioni di Pi in eccesso modulano lo sviluppo dei peli radicali. Le piantine WT sono state coltivate idroponicamente, come descritto nel protocollo. (A) Una sezione di 1-2 cm dalla punta della radice primaria è stata tagliata e montata su un vetrino con il 10% di glicerolo, e una regione di 5 mm dalla punta è stata documentata per il numero e la lunghezza dei peli della radice. I dati sono presentati per (B) la lunghezza dei peli della radice e (C) il numero di peli radicali in una regione di 5 mm della punta della radice primaria. I valori sono mezzi ± SE; n = 10 (B e C). Le barre con diverse lettere alfa differiscono significativamente (p ≤ 0,05) in base al test t accoppiato di Student. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo lavoro ha dimostrato la mappatura di RSA utilizzando semplici apparecchiature di laboratorio. Utilizzando questo metodo, le alterazioni fenotipiche vengono registrate a livello raffinato. Il vantaggio di questa strategia è che la porzione di germoglio non entra mai in contatto con i media, quindi il fenotipo delle piantine è originale. Questo metodo prevede la creazione di un sistema idroponico per coltivare le piantine come descritto nel protocollo. Quindi, ogni piantina viene estratta intatta e posta su una piastra di Petri piena di agar. Il sistema di root può quindi diffondersi manualmente utilizzando un pennello artistico e le fotografie vengono scattate per essere analizzate con il software ImageJ 1,10,11,12.
La germinazione dei semi richiede la sterilizzazione della superficie del seme per rimuovere batteri, funghi e virus. L'alcol - etanolo al 70% - viene utilizzato per sterilizzare le superfici dei semi. Per disinfettare i semi senza distruggerli, il tempo di trattamento della sterilizzazione con alcol deve essere attentamente seguito. La germinazione dei semi diminuisce quando la sterilizzazione con alcol è esagerata. I tempi di trattamento variano a seconda delle specie vegetali (ad esempio, per Arabidopsis, il limite di tempo è di 3 min 1,10,11,12,20 solo, mentre per Medicago sativa, è di 5 min 19. Al fine di facilitare la raccolta regolare dell'RSA per l'analisi, è importante limitare il numero di semi per mesh o scatola magenta, per evitare l'impigliamento del sistema radicale tra di sé 1,10,11,12. Ciò può essere ottenuto utilizzando un numero inferiore di semi per mesh. Ad esempio, l'utilizzo di quattro semi per maglia può aiutare a ridurre il rischio di impigliamento, consentendo al contempo una crescita robusta e lo sviluppo dei sistemi radicali. È importante notare che il numero ottimale di semi per maglia dipende dalle specie vegetali specifiche e dagli obiettivi dell'analisi RSA. Ad esempio, se un esperimento richiede tessuto per ulteriori requisiti di lavorazione a valle come l'isolamento dell'RNA, in questo caso si raccomanda la semina di massa (100 semi per maglia nel caso di Arabidopsis)1,10,11,12. La raccolta delle piantine dalla rete è un processo delicato che richiede la massima cura e attenzione 1,10,11. È importante affrontare questo compito lentamente, delicatamente e con attenzione per evitare di danneggiare le delicate piantine. Per raccogliere le piantine dalla rete, si consiglia di utilizzare pinzette sottili o pinze per afferrare le piantine delicatamente ma con fermezza. Le piantine devono essere accuratamente sollevate dalla rete per evitare di disturbare i sistemi radicali o causare danni alle piantine. È essenziale essere pazienti e prendersi il tempo per rimuovere con cura ogni piantina dalla rete per assicurarsi che non vengano danneggiati durante il processo. È un processo graduale che dovrebbe essere eseguito lentamente, delicatamente e attentamente per garantire il successo dell'esperimento. Per misurare con precisione l'RSA delle piantine, è fondamentale segnare una scala sulla piastra di Petri per consentire una misurazione precisa 1,10,11. Questo può essere fatto utilizzando un marcatore permanente per tracciare una linea sulla piastra di Petri a una distanza nota, ad esempio 1 cm o 2 cm. La scala deve essere posizionata lungo il bordo della piastra di Petri in una posizione visibile. Utilizzando un pennello, è anche essenziale prestare la massima attenzione quando si diffonde l'RSA. La radice primaria deve essere posizionata con cura al centro della piastra di Petri e le radici laterali devono essere distribuite su entrambi i lati della radice primaria. Il sistema radicale dovrebbe essere parzialmente immerso in acqua per facilitare la diffusione. Per misurare ogni nuova piastra di Petri, è necessario impostare ogni volta la scala nel software ImageJ.
Poche modifiche possono essere impiegate per migliorare l'efficienza, la non invasività e l'efficacia dell'analisi RSA1. Uno di questi miglioramenti è quello di modificare la dimensione dei pori della rete in polipropilene utilizzata per contenere le piantine. La dimensione dei pori della maglia può essere regolata per soddisfare le esigenze specifiche delle specie vegetali studiate e per ottimizzare la crescita e lo sviluppo degli apparati radicali 1,10,11,12. Ad esempio, una dimensione dei pori della maglia più grande (500 μm) facilita la raccolta regolare di intere piantine senza tagliare l'ipocotile, che in precedenza era praticato10,11,12. Inoltre, una dimensione dei pori più grande può essere più adatta per le specie di piante più grandi RSA, mentre una dimensione dei pori più piccola può essere più appropriata per le specie di piante più piccole. Un'altra modifica che può essere apportata è quella di avvolgere la rete di polipropilene in un foglio di alluminio per evitare che si pieghi. Questo può aiutare a mantenere la forma e l'integrità della rete, rendendola adatta a fungere da matrice piana. Oltre a queste modifiche, è possibile utilizzare altre tecniche di risoluzione dei problemi per risolvere eventuali problemi che potrebbero verificarsi durante l'analisi RSA. Ad esempio, se le piantine non crescono o non si sviluppano come previsto, potrebbe essere necessario regolare le condizioni ambientali, come la temperatura, l'umidità e i livelli di luce. Se i sistemi di radici sono impigliati, potrebbe essere necessario ridurre il numero di semi per mesh, come menzionato sopra.
Uno dei principali vantaggi dell'analisi RSA è che consente di studiare i sistemi di radici delle piante senza la necessità di agar. L'agar è comunemente usato come agente solidificante nella coltura di tessuti vegetali e negli esperimenti di germinazione dei semi. Tuttavia, l'uso dell'agar può introdurre una contaminazione elementare che può potenzialmente generare artefatti e influire sull'accuratezza dei risultati10. Escludendo il requisito per l'agar, l'analisi RSA elimina il rischio di contaminazione elementare derivata dall'agar e il potenziale di artefatti. Ciò rende l'analisi RSA un metodo più affidabile e accurato per studiare i sistemi di radici delle piante 1,3,10,11,12. Ad esempio, gli effetti della privazione di Pi greco sulla densità delle radici laterali sono stati oggetto di una serie di rapporti contraddittori. È stato riportato che la densità LR aumenta quando Pi greco è basso 6,8. Al contrario, un calo della densità della radice laterale è stato riscontrato anche in condizioni di carenza di Pigreco 3,13,16. Queste discrepanze possono essere attribuibili al sistema di terreni di crescita basato su agar, in cui i lavoratori utilizzano diverse marche di agar per gelificare i terreni con vari gradi di contaminazione da Pi10. Ancora una volta, gli esperimenti che cercano di illustrare l'effetto della carenza di Zn sulla RSA potrebbero non essere condotti adeguatamente utilizzando il metodo della piastra di Petri a base di agar, perché il mezzo gelificante a base di agar include anche la contaminazione da Zn11. Pertanto, l'esecuzione dell'analisi RSA potrebbe non essere appropriata per indagare la carenza di nutrienti utilizzando il mezzo gelificante a base di agar. In secondo luogo, le piantine coltivate su terreni gelificanti a base di agar non si sviluppano così rapidamente come quelle coltivate idroponicamente. In terzo luogo, poiché l'RSA è tipicamente incorporato in un mezzo agar, numerose feature radice non vengono visualizzate correttamente. In quarto luogo, la rimozione dell'RSA dal mezzo spesso causa danni sostanziali all'RSA e lo rende una tecnica di campionamento distruttiva.
La precedente tecnica idroponica, come pubblicato da Jain et al.10, utilizzava una dimensione della maglia in polipropilene di 250 μm, che aveva pori più stretti che non consentivano di estrarre l'RSA intatto. Di conseguenza, in quel caso particolare, abbiamo dovuto tagliare le piantine dalla regione ipocotilica per separare l'RSA, trasformandolo in un metodo di campionamento distruttivo10,11,12. Il metodo esistente è improvvisato per renderlo non distruttivo utilizzando una rete di polipropilene con una dimensione dei pori più grande (500 μm) che consente di estrarre intere piantine di Arabidopsis intatte senza infliggere alcun danno all'RSA1. Vale la pena notare che possiamo sempre regolare la dimensione dei pori della rete in polipropilene, a seconda del tipo di piantina. Ad esempio, la Figura 4 illustra come un approccio simile possa essere utilizzato per mappare l'RSA di diverse piante, come Medicago sativa (Alfalfa). Abbiamo optato per la dimensione dei pori in polipropilene di 1 mm per ospitare il sistema di radici Medicago.
Uno svantaggio di questo sistema potrebbe essere lo sviluppo di peli radicali, che spesso non prosperano sotto sistemi idroponici rispetto ai sistemi di piastre di agar. La causa principale è la facile disponibilità di nutrienti in mezzi liquidi piuttosto che in mezzi solidi. Anche se abbiamo osservato lo sviluppo di peli radicali (non robusti) utilizzando lo stesso sistema e ottenuto i risultati (Figura supplementare 1). La disponibilità di Pi influisce fortemente sullo sviluppo dei peli radicali10,11. Qui, la lunghezza dei peli radicali è aumentata inizialmente fino a 2,5 mM, e poi è diminuita.
Nel complesso, i principali vantaggi del sistema sono: (1) è un metodo semplice e preciso che non richiede alcuna sofisticata attrezzatura di fascia alta; (2) il metodo consente una rapida crescita delle piantine a causa della sua natura idroponica; (3) è un metodo non distruttivo; (4) la diffusione manuale dell'RSA consente la corretta visualizzazione di ogni tratto, rivelando l'RSA nascosto, offrendo il pieno controllo all'utente; e (5) il metodo utilizza un software di imaging disponibile gratuitamente (cioè ImageJ), che è anche semplice da usare.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Riconosciamo il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (sovvenzione 58-6406-1-017) per aver sostenuto questa ricerca. Riconosciamo anche il WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, e il direttore, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, per aver fornito le strutture e il supporto dello strumento (comunicazione manoscritta CSIR CIMAP n. CIMAP / PUB / 2022/103). SS riconosce il sostegno finanziario della Saint Joseph's University, Philadelphia, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
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