Summary
簡単な実験ツールを使用して、シロイヌナズナとメディカゴの根系アーキテクチャ(RSA)を調べます。小植物はメッシュ上で水耕栽培され、アートブラシを使用して広げられ、RSAが明らかになります。画像はスキャンまたは高解像度カメラを使用して撮影され、ImageJで分析されて形質をマッピングします。
Abstract
植物の根系構造(RSA)開発に関する包括的な知識は、栄養素の使用効率を改善し、環境問題に対する作物品種の耐性を高めるために重要です。水耕栽培システムのセットアップ、植物の成長、RSAの拡散、およびイメージングのための実験プロトコルが提示されます。このアプローチでは、ポリカーボネートウェッジで支えられたポリプロピレンメッシュを含むマゼンタボックスベースの水耕栽培システムを使用しました。実験設定は、様々な栄養素(リン酸塩[Pi])供給下での苗床のRSAを評価することによって例示される。このシステムはシロイヌナズナのRSAを調べるために設立されましたが、 メディカゴサティバ (アルファルファ)などの他の植物の研究にも容易に適応できます。 シロイヌナ ズナ(Col-0)の植物を本調査では、植物RSAを理解するための例として用いる。種子は、エタノールと希釈された市販の漂白剤を処理することによって表面滅菌され、層別化のために4°Cに保たれます。種子を発芽させ、ポリカーボネートウェッジで支持されたポリプロピレンメッシュ上の液体ハーフMS培地上で成長させる。植物を標準的な生育条件下で所望の日数だけ生育させ、メッシュから穏やかに摘み取り、含水寒天プレートに浸す。小植物の各根系は、丸いアートブラシの助けを借りて、水で満たされたプレート上に穏やかに広げられます。これらのペトリプレートは、RSA特性を文書化するために高解像度で撮影またはスキャンされます。一次根、側根、分岐ゾーンなどの根形質は、無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して測定されます。この研究は、制御された環境環境における植物の根の特性を測定するための技術を提供します。(1)苗を育て、根のサンプルを採取して広げる方法、(2)拡散したRSAサンプルの写真を取得する方法、(3)画像をキャプチャする方法、(4)画像解析ソフトウェアを使用して根の属性を定量化する方法について説明します。本方法の利点は、RSA形質の汎用性が高く、簡単で効率的な測定である。
Introduction
地下にある根系アーキテクチャ(RSA)は、植物の成長と生産性にとって重要な器官です1,2,3。胚期の後、植物はそれらの最も重要な形態学的変化を経験する。根が土壌中で成長する方法は、地上の植物部分の成長に大きく影響します。根の成長は発芽の最初のステップです。それは異なる利用可能な栄養素1,2,3,4に独自に反応するので、それは有益な形質です。RSAは高度な発達可塑性を示し、これは環境が常に開発に関する決定を行うために使用されることを意味します2,5。環境の変化により、現在のシナリオでは作物生産がより困難になっています。RSAは継続的に、環境シグナルを発達上の選択に組み込んでいます5。その結果、根の発達の背後にある原理を完全に理解することは、植物が変化する環境にどのように反応するかを学ぶために不可欠です2,5。
RSAは、さまざまな栄養素濃度を感知し、表現型の変化をレンダリングします4、6、7、8、9、10、11、12。研究によると、根の形態/ RSAはシュートの形態と比較して非常に可塑性が高いことが示唆されています1,3。RSA形質マッピングは、周囲の土壌環境を変化させる効果を記録するのに非常に有効である1、11、12。
一般に、根の表現型に対する様々な栄養欠乏の影響の不一致は、多くの以前の研究で報告されている3、11、13、14、15。たとえば、リン酸塩(Pi)飢餓による側根(LR)の数、長さ、密度の変化については、いくつかの対照的な報告があります。LR密度の増加は、Pi欠乏条件6,8の下で報告されています。対照的に、Pi欠損条件下でのLR密度の減少は、他の著者によっても報告されています3,13,16。これらの不一致の顕著な原因の1つは、寒天がしばしば10を含む元素汚染しやすいゲル化培地の使用です。研究者は通常、寒天ベースのプレートシステムで実験植物を育て、根の形質を記録します。多くのRSA形質は、寒天物質内に隠蔽または定着していることが多く、文書化することはできません。ユーザーが培地から1つの成分を完全に排除することが多い栄養欠乏症の誘発に関連する実験は、元素汚染が発生しやすいゲル化培地では実行できません11、14、15。寒天培地には、P、Zn、Feなど、多数の栄養素が大量に頻繁に存在します11、14、15。さらに、RSAの成長は、非寒天ベースの液体培地よりも寒天ベースの培地の方が遅い。その結果、RSAの表現型を定量化し定性的に記録するための代替の非寒天ベースのアプローチを確立する必要があります。その結果、ポリカーボネートウェッジ1,10,11で支持されたポリプロピレンメッシュの上にマゼンタボックスベースの水耕栽培システムで苗を飼育する現在の方法が開発されました。
この研究は、Jainらによって記述された以前の方法の詳細な即興バージョンを提示します10。この戦略は、植物の根生物学における現在の需要に合わせて調整されており、モデル植物以外のアルファルファのような植物にも使用できます。プロトコルは、RSAの変化を測定するための主要な方法であり、必要なのは単純な機器だけです。本プロトコルは、正常および改変培地(Pi欠損)において一次根および側根などのいくつかの根の特徴を表現型化する方法を示す。著者の経験から収集された段階的な指示やその他の役立つヒントは、研究者がこの方法で提供される方法論に従うのを助けるために提供されます。本研究は、高次LRを含む植物の根系全体を簡便かつ効果的に明らかにする手法を提供することを目的とする。この方法では、丸い水彩アートブラシを使用して根系を手動で広げ、根の露出を正確に制御できます1,10,11,12。高価な機器や複雑なソフトウェアは必要ありません。この方法は、栄養素の取り込みと成長率を改善しました。植物は根に吸収されやすい栄養豊富な溶液を持っています。この方法は、特に発育初期(発芽後10〜15日)に、植物の根系の形質を詳細にマッピングしたい研究者に適しています。小さな根系、シロイヌナズナやタバコなどのモデル植物、アルファルファなどの非従来型植物に、根系がマゼンタの箱に収まるまで適しています。
シロイヌナズナにおけるRSA発生の表現型分析のステップは、このプロトコルで次のように概説されています:(1)植物の種子表面滅菌の方法(シロイヌナズナ)、(2)水耕システムをセットアップするステップ、続いて培地に種子を播種するステップ、(3)RSA分析のために完全な播種を取り出してペトリプレート上に広げる手順、 (4)RSA用の画像を記録する方法、および(5)ImageJソフトウェアを使用して重要なRSAパラメータを計算する方法。
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Protocol
プロトコル全体を 図1に概略的に要約し、プラントレットのルートシステムアーキテクチャ(RSA)を明らかにするために必要なすべての重要なステップを示しています。プロトコルの手順を以下に詳しく説明します。
1.シロイヌナズナ種子表面殺菌
- 種子の小さなスクープ(約100種子=約2.5 mg)を微量遠心チューブに移し、室温(RT)の蒸留水に30分間浸します。この手順全体は無菌状態で実行されます。
- 種子を含む微量遠心チューブを500 x g で5秒間短時間遠心分離し、RTの卓上遠心分離機を使用して種子を落ち着かせます。
- 水をデカントし、700 μLの70%(v / v)エタノールを加え、数秒間ボルテックスし、回転させます。必要に応じてボルテックスとスピニングを繰り返しますが、70%エタノールの処理時間が3分のままであることを確認してください。
- 3分後、直ちに滅菌水で一度すすいでください。長時間のエタノール曝露は発芽を減少させるので、エタノール洗浄ステップをできるだけタイムリーに保ってください。
- 種子を希釈した市販の漂白剤(4%v / v)でTween-20を7分間滴下して処理します。チューブを8〜12回急速に反転させて種子を漂白剤溶液と混合し、続いて短時間遠心分離機(RTで5秒間500 x g )を行います。チューブに泡が現れているのが見られます。
- 1 mLピペットを使用して上清をデカントし、同じボルテックス手順に従って、滅菌水で少なくとも5回の洗浄で種子を洗い流します。
- 表面滅菌した種子を水中に放置し、成層10のために4°Cで2〜3日間インキュベートします。
2.種子発芽のための水耕栽培システムの設定
- 標準のマゼンタの箱に蒸留水を半分入れ、オートクレーブします。ポリカーボネートシート(透明な色と滑らかな質感)をオートクレーブし、4cm×8cmの長方形を切り取り、2つの長方形が一緒にスロットしてX字形10を形成することができるように、長方形の半分以上中点に切り欠きを入れます。このセットアップを使用して、12x 24インチシート10から切り取ったポリプロピレンメッシュ(250 μmの孔径の6 cm x 6 cm正方形、または要件に応じて)を保持します。
注意: ポリプロピレンは酸、アルカリ、およびその他の化学物質に対して非常に耐性があります。したがって、それは選択されています。オートクレーブはポリプロピレンメッシュを歪める傾向があります。したがって、アルミホイルで包んで別々に運ぶことをお勧めします。16分、121°C、15psi、または775mmHgの標準的なオートクレーブ条件が推奨されます。 - Shuklaら1で説明されているように、ビタミン+ 1.5%(w / v)スクロースを含む滅菌ハーフMS基礎培地を各ボックスに追加して、層流でポリプロピレンメッシュの下端に到達します。全ての手順は無菌条件下で行われる。
- 表面滅菌した種子をメッシュ(孔径250μm)に水耕栽培で播種し、3日間生育させます。
- 3日後、苗をメッシュ(500μmの孔径)に移し、2日間成長させます。
- 2日後(合計5日後)、苗を対照培地(すなわち、2.0 mM NH4 NO 3、1.9 mM KNO3、0.15 mM MgSO4・7H2O、0.1 mM MnSO4・Oを含有する改変MS栄養培地1)に移し替える。H2O、3.0μM ZnSO4·7H 2O、0.1 μM CuSO 4·5H 2 O、0.3 mM CaCl 2·2H 2 O、5.0 μM KI、0.1 μM CoCl 2·6H 2 O、0.1 mM FeSO 4·7H 2 O、0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O、1.25mM KH 2PO 4、100 μM H 3 BO3、 1 μM Na2MoO4·2H2O、1.5%スクロース、1.25 mM MES、0.1 M MES [pH 6.1]で調整したpH 5.7)および実験培地(例えば、P-[0 mM]処理;KH2PO4は、上記1のような対照培地組成物由来の0.62mMK2SO4に置き換えられる。過剰なPi処理の場合、KH 2 PO4の濃度を修飾MS培地[2.5、5.0、10.0、20.0 mM]1)で増加させ、種子を7日間成長させます。
注:メッシュの孔径(500 μm)が大きいため、胚軸での損傷や切断を必要とせずに、苗全体をスムーズに摘み取りやすくなります。植物は、23°Cで標準的な成長条件(すなわち、16時間の明周期/8時間の暗日長、150μmol・m-2・s-1光強度、60%- 70%湿度)で成長します。
3. RSAの審査
- 根の広がりのために寒天(1.1%)プレートを準備します(ペトリプレートサイズ:150 mm x 15 mm)。
- 上記のように、オートクレーブ滅菌したろ過した水道水を10〜20 mLのペトリプレートに追加します。メッシュ(500 μm)から苗をそっと引き出し、プレート上の水に浸します。
- 丸い水彩画のアートブラシ(サイズ:14、16、18、20番)を使用して、水で満たされたプレートに各小植物の根をそっと広げます。
注:根系の拡散を実行している間、最初に一次根をつかみ、それが軸として機能するので、それを直線に広げます。次に、可能な限り、LRを一次根の両側に対称的に広げます。その後、1次LRにリンクされた2次LRを広げます。この拡散プロセスは一種の芸術です。RSAのイメージを描くアーティストのように、ゆっくりとゆっくりと行います。 - プレートを少し傾けて水を取り除きます。
注:この時点で、これらのスプレッドプレートを4°Cに置くことで手順を一時停止できます。 後で画像処理が必要になったら、プレートを取り出し、しばらくRTに置きます。凝縮した水を拭き取ると、画像を便利に処理できます。
4. RSA用の画像記録
- これらのペトリプレートを適切にスキャンまたは撮影します。
注意: 高品質の写真を取得するには、スキャンには600 dpiの解像度が推奨され、写真撮影には少なくとも12メガピクセルのカメラが推奨されます。 - 無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して、ルートシステムのアーキテクチャ特性を測定します(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)。ImageJソフトウェアを使用して根の長さを測定する手順をすばやく実行するには、「DNA輪郭長の測定」17の例を参照してください。
注意: 高解像度スキャナーまたはカメラを使用してキャプチャされた画像のルートの長さを測定するには、次の手順に従います。- 指定された長さの距離を使用して、スケールを設定します。 図3 のスケールバーの既知の距離は2cmです。ImageJ ツールバーから 直線 ツールを選択します (左から 5 番目のツール)。 直線 ツールを使用して、縮尺記号の輪郭を描く線の選択範囲を作成します。アウトラインを完了したら、右クリック、ダブルクリック、または先頭のボックス内をクリックします。
- 既知の縮尺記号の長さをピクセル単位で計測するには 、[解析] ツールバー> [計測] ツールバーを使用します。ピクセルの長さをメモします。
- [解析] タブの [縮尺の設定] タブをクリックして、[縮尺の設定] ダイアログ ボックスを開きます。[ピクセル単位の距離] フィールドに、ピクセルの長さを入力します (上記のとおり)。次に、[既知の距離]フィールドに、縮尺記号で示されている値を入力します(ここでは20 mmです)。[長さの単位] を mm に設定します。ピクセル縦横比は 1.0 です。これで、スケールはミリメートルあたりのxピクセル数で指定されます。この特定の画像のスケールをロックするには、[OK]をクリックします。
- [セグメント化されたライン] ツールを使用して、ルートの長さの輪郭を描くライン選択を作成します。アウトラインを完了したら、右クリック、ダブルクリック、または先頭のボックス内をクリックします。アウトラインに沿って小さな白黒の「ハンドル」をクリックしてドラッグし、必要に応じて線の選択を調整します。
- ImageJ の [解析] タブにある [計測] コマンドを使用して、ルートの長さを定量化します。測定データをスプレッドシートに転送するには、[結果]ウィンドウを右クリックし、ポップアップメニューから[すべてコピー]を選択し、スプレッドシートに切り替えてデータを貼り付けます。
注: 上記のように、ImageJ の [縮尺を設定] オプションで縮尺記号の既知の距離を使用して縮尺を設定します。これにより、単位長さあたりのピクセル数が得られます。新しい画像が分析されるたびに、スケールを新たに設定する必要があります。
- RSA特性の測定と計算
- 胚軸接合部から根の先端までの一次根の長さを測定します。
- 1次および2次のLR長を測定します。
- 一次根の分岐ゾーン(BZ)を測定します。1 次ルート (BZPR) の分岐ゾーンは、最初の LR 出現点から最後の LR 出現点まで広がっています。
- BZPR の境界内で発生する LR の数である LR の数を記録します。
- 1°LRの全長を1°LRの総数で割ることにより、1次LRの平均長さ(1°LR)(根当たりセンチメートル)を導き出します。
- 2次LRの平均長さを測定します。2°LRの全長を2°LRの総数で割って、2次LR(2°LR)の平均長さを計算します。
- 1°LR密度を測定します。1°LRの数をBZ PRの長さで割ることにより、1°LR密度(BZPRの単位長さあたりの1°LRの数)を計算します。
- 2°LR密度を測定します。2°LRの数を1°LRのBZの長さで割って、2°LR密度を計算します(1°側根のBZの単位長さあたりの2°LRの数)。
- 合計ルート長 (TRL) を測定します。これは、一次根、1°LR、および2°LR(存在する場合はそれ以上)の長さの合計です。
5.根毛測定
注:水耕栽培システムは根毛の成長と発達を促進するのに適していませんが、固体の成長培地と同じくらい堅牢であるにもかかわらず、現在の文脈でそれを研究することは依然として重要です。以下の手順に従って、苗の一次根の先端から5mmの切片で根毛の発達を分析します。
- 根の先端から一次根の2 cmの部分を切り取ります。
- 根元部分をスライドにマウントし、10%グリセロールを封入剤として使用します。
- スライドを実体顕微鏡の下に置きます。
- 軸方向キャリアを使用して、根毛の画像を視覚化およびキャプチャします。
- 前述のように、ImageJソフトウェアを使用して画像を分析して根毛の構造と特性を調べます。
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Representative Results
ルートシステムアーキテクチャ(RSA)のさまざまな形態測定特性は、簡単な実験ツールを使用して測定され、その手順は 図1に概略的に示されています。水耕栽培のセットアップの詳細は、RSAの測定におけるプロトコルの可能性を示しています(図1 および 図2)。
ゲル化剤の観察された違いを考慮して、水耕栽培システムを使用してすべての研究を実施しました3,10。概念実証として、この水耕栽培システムはうまく機能し、Pi不足および十分な条件下での明らかな対照的な表現型を反映しています(図3)。シロイヌナズナの種子を、図2に示すように、ポリプロピレンメッシュ上のハーフMS培地で5日間水耕栽培しました。5日後にパイ不足十分条件に苗を移植し、7日間生育させた(図3)。
さまざまな栄養素(Pi)供給下でのRSA形質の実証
RSA3の特性を分析および記録するための確立されたスキームに従いました。異なるRSA形質は、水耕栽培条件下で対照的なPiレジームの下で分析されました(図3)。Pi欠損処理(0 mM Pi)は、Pi十分な条件と比較して、より短く、より浅く、そしてより少ない分岐RSAを示す典型的に報告された根の表現型を誘発した(図3A)。一次根長は、Pi欠損条件下で有意に減衰した(図3A、B)。一次根の長さは、Pi(1.25 mM)の存在下で急速に増加し、生理形態学的変化を適切に反映した水耕栽培システムの効率を示しています(図3A、B)。TRLはPi欠乏条件下で有意に減少した(図3B)。分岐帯(BZPRs)は、図3Aに示すように、Pi欠乏条件下で有意に減衰した(図3B)。
これらの形質のうち、2つのPi条件間のLR数の差が大きいため、最も影響を受けたのはTRLでした。Pi十分条件(1.25 mM)でのRSAの活発な成長は、1°LRの数と長さの大幅な増加によるものでした。したがって、主にLR開発の変更により、RSAの急速な変化が発生しました。一次根の分岐ゾーンの境界内で発生するLRの数は、より意味があると考えられているため、測定しました1,3,18。1°LRの平均長さ(根当たりセンチメートル)は、Pi欠損状態で有意に減少した(図3C)。平均2°LR長は、P0条件のために同様に減少した。ただし、平均1°LR長よりも量が少なかった(図3C)。P0条件では、P1.25条件と比較して、1°LRと2°LRの数が大幅に減少しました(図3D)。1°LR密度(BZPR長のセンチメートル当たりの1°LRの数)は、P1.25条件に対してP0条件下で変化しなかった(図3E)。2°LR密度(1°LRのBZのセンチメートルあたりの2°LRの数)も有意な変化を示さなかった(図3E)。その結果、LRの密度を決定することは、RSAの可塑性に関する有用な洞察を得るために不可欠です。
さまざまなリン酸(Pi)レジームの下での根毛発生の解析
根毛の発達に及ぼすPi供給の影響を実生の一次根で研究した。根毛の長さは、Piの濃度が2.5 mMまで増加するにつれて増加しましたが、5 mMと10 mMで減少しました。しかし、20 mMでは、根毛の長さはピークに近いレベルに戻りました(補足図1)。根毛の数は、他のすべてのPi供給と比較して0 mMで有意に多く、20 mMで最大数が観察されました(補足図1)。
シロイヌナズナ以外の植物への本手法の適用
シロイヌナズナ以外の植物では、メディカゴサティバ(アルファルファ)を試験植物として本手法の実現可能性を検討した。プロトコルは、(1)種子表面滅菌法、および(2)ポリプロピレンメッシュの孔径(現在は1,000μm)の2つの側面の要件に従って変更されています。表面種子の滅菌および層別化プロトコルは、研究する選択された植物に応じて常に最適化する必要があります。アルファルファについては、Weeksら19で説明されているように手順が続いた。表面滅菌後、種子を4°Cで7日間インキュベートし、成層した。その後、このプロトコルで説明されているのと同じ手順に従って、メッシュの細孔サイズを変更しました。図4A,Bに示すように、苗はよく育ち、Piの供給が変化する下でRSAが変化しました。図4Cは、1.25、0、および20 mMのPi栄養溶液の下での根系の可塑性を示しています。過剰なPi(20 mM)と不十分なPi供給は、Pi十分(1.25 mM)条件(対照)と比較して、根系の発達を減少させました(図4C)。RSAは、プロトコルに記載されているImageJソフトウェアを使用して、さまざまな特性にマッピングできます。したがって、プロトコルはシンプルで効率的であり、選択した植物種に応じて簡単に変更できます。それは異なる栄養条件下で多様な植物種のRSAを研究する機会を提供します。
図1:手順の概略図。 概略図は、RSAをマッピングするためのメソッドプロトコルに関連する主要なステップの概要を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:小植物を育てるためのマゼンタの箱の水耕栽培のセットアップの表示。 (Jainら10によって記載されたように、修正を加えた)。(A)セットアップを組み立てるためのポリカーボネートウェッジのノッチを備えた2つの長方形のピース(4 cm x 8 cm)。(B)メッシュ表面を支えるためにX字型に変わるノッチを介してポリカーボネートくさびを互いに組み立てます。(C)250μmのポリプロピレンメッシュシート(6cm×6cm)。(D)マゼンタボックス内のポリカーボネートウェッジのアセンブリの上面図。(E)メディアで満たされたマゼンタ色の箱の中のポリカーボネートウェッジ上のポリプロピレンメッシュの組み立て。(F)メッシュ上で発芽したシロイヌナズナの植物体の展示。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:この表現型法を使用した、さまざまな栄養条件(Pi欠乏[0 mM]および十分な[1.25 mM])での典型的なRSA変調のデモンストレーション。 シロイヌナズナ(Col-0)苗を0.5倍MS培地で5日間水耕栽培し、その後、 図2に示すように、Pi不足で十分な供給量(それぞれ0および1.25 mM)に供し、7日間生育させた。(A)個々の苗をポリプロピレンメッシュ(500μm)から引き出し、丸いアートブラシと水を使って寒天ペトリプレートに広げます。RSA形質のデータは、(B)一次根(PR)長、総根長(TRL)、分岐帯(BZ)、(C)平均(Av.)一次側根長(1°LR長)、平均(Av.)二次側根長(2°LR長)、(D)1°LRおよび2°LRの数、および(E)1°LRおよび2°LR密度について提示される。値はSE±手段です。n = 21。この図はShuklaら1から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:シロイヌナズナ以外の他の植物へのこの方法の適用性を示す例としての メディカゴサティバ (アルファルファ)根系のデモンストレーション 。 (A)アルファルファの小植物の成長を示すマゼンタの箱の側面図。(B)マゼンタ色の箱の上面図は、ポリプロピレンメッシュ(孔径1,000μm)上でのシュートの出現を示しています。(C)このRSA表現型法を使用した、さまざまな栄養条件(Pi欠乏[0 mM]、過剰Pi[20 mM]、および十分または制御[1.25 mM])でのアルファルファ調節の典型的な根系構造(RSA)。アルファルファの苗を0.5倍のMS培地で5日間水耕栽培し、Pi不足、十分、および過剰供給(それぞれ0、1.25、および20 mM)にさらし、7日間成長させます。個々の苗をポリプロピレンメッシュ(1,000μm)から引き出し、アートブラシと水を使って Cに示すように寒天ペトリプレートに広げます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:異なる過剰Pi濃度は根毛の発達を調節する。 WT実生は、プロトコルに記載されているように、水耕栽培で成長させた。(A)一次根の先端から1〜2 cmの切片を切り刻んで10%グリセロールでスライドに取り付け、先端から5 mmの領域に根毛の数と長さを記録しました。(B)根毛の長さと(C)一次根の先端の5 mm領域における根毛の数についてのデータが提示される。値はSE±手段です。n = 10(B および C)。異なる英字のバーは、スチューデントの対応のあるt検定に従って有意に異なります(p ≤ 0.05)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この作業では、シンプルな実験装置を使用したRSAのマッピングを実証しました。この方法を使用して、表現型の変化が洗練されたレベルで記録されます。この戦略の利点は、シュート部分がメディアと接触することがないため、小植物の表現型がオリジナルであることです。この方法では、プロトコルに記載されているように、水耕栽培システムを設定して小植物を栽培します。次に、各苗をそのまま取り出し、寒天を充填したペトリプレートに置く。次に、アートブラシを使用して手動でルートシステムを広げ、写真を撮影してImageJソフトウェア1,10,11,12で分析します。
種子の発芽には、細菌、真菌、ウイルスを除去するための種子表面の滅菌が必要です。アルコール - 70%エタノール - は種子表面の殺菌に使用されます。種子を破壊せずに消毒するには、アルコール滅菌の処理時間に注意深く従う必要があります。アルコール殺菌がやり過ぎると種子の発芽が減少します。処理のタイミングは植物種によって異なります(たとえば、シロイヌナズナの場合、制限時間は3分1,10,11,12,20のみですが、メディカゴサティバの場合は5分19です。分析のためのRSAの円滑なピッキングを容易にするために、それ自体の間で根系の絡み合いを防ぐために、メッシュまたはマゼンタボックスあたりのシードの数を制限することが重要である1,10,11,12。これは、メッシュあたりのシード数を減らすことで実現できます。たとえば、メッシュごとに4つのシードを使用すると、ルートシステムの堅牢な成長と発達を可能にしながら、絡み合いのリスクを減らすのに役立ちます。メッシュあたりの最適な種子数は、特定の植物種とRSA分析の目的によって異なることに注意することが重要です。たとえば、RNA単離などのさらなる下流処理要件のために組織を必要とする実験の場合、この場合、バルク播種が推奨されます(シロイヌナズナの場合はメッシュあたり100種子)1,10,11,12。メッシュから苗を摘むことは細心の注意と注意を必要とする繊細なプロセスです1,10,11。繊細な小植物を傷つけないように、ゆっくりと、穏やかに、そして慎重にこの作業に取り組むことが重要です。メッシュから小植物を選ぶには、細いピンセットまたは鉗子を使用して、小植物を優しくしっかりとつかむことをお勧めします。根系を乱したり、小植物に損傷を与えたりしないように、小植物をメッシュから慎重に持ち上げる必要があります。辛抱強く、時間をかけてメッシュから各苗を慎重に取り除き、プロセス中に損傷を受けないようにすることが不可欠です。これは段階的なプロセスであり、実験の成功を確実にするためにゆっくりと、穏やかに、そして慎重に実行する必要があります。植物レットのRSAを正確に測定するためには、ペトリプレートにスケールをマークして正確な測定を可能にすることが重要です1,10,11。これは、永久マーカーを使用して、1 cmや2 cmなどの既知の距離でペトリプレートに線を引くことによって行うことができます。スケールは、ペトリプレートの端に沿って目に見える場所に配置する必要があります。ブラシを使用して、RSAを広げるときに細心の注意を払うことも不可欠です。一次根はペトリプレートの中央に注意深く配置し、側根は一次根の両側に広げる必要があります。根系は、拡散を容易にするために部分的に水に沈める必要があります。新しいペトリプレートを測定するには、毎回ImageJソフトウェアでスケールを設定する必要があります。
RSA分析の効率、非侵襲性、および有効性を向上させるために採用できる変更はほとんどありません1。そのような改善の1つは、小植物を保持するために使用されるポリプロピレンメッシュの孔径を変更することです。メッシュの孔径は、研究対象の植物種の特定のニーズに合わせて調整し、根系の成長と発達を最適化することができます1,10,11,12。例えば、より大きなメッシュ孔径(500μm)は、以前に実施された胚軸を切断することなく、苗全体のスムーズな摘み取りを容易にする10,11,12。さらに、より大きな細孔径はより大きな植物種RSAにより適している可能性があり、一方、より小さな孔径はより小さな植物種により適している可能性がある。行うことができる別の変更は、ポリプロピレンメッシュをアルミホイルで包み、曲がらないようにすることです。これにより、メッシュの形状と完全性を維持し、平らな床マトリックスとして機能するのに適しています。これらの変更に加えて、RSA分析中に発生する可能性のある問題に対処するために、他のトラブルシューティング手法を使用できます。たとえば、苗が期待どおりに成長または発達していない場合は、温度、湿度、光レベルなどの環境条件を調整する必要がある場合があります。根系が絡み合っている場合は、上記のように、メッシュあたりのシード数を減らす必要があるかもしれません。
RSA分析の主な利点の1つは、寒天を必要とせずに植物の根系を研究できることです。寒天は、植物組織培養および種子発芽実験における固化剤として一般的に使用される。ただし、寒天を使用すると元素汚染が発生し、アーティファクトが発生し、結果の精度に影響を与える可能性があります10。寒天の要件を除外することにより、RSA分析は寒天由来の元素汚染のリスクとアーチファクトの可能性を排除します。これにより、RSA分析は、植物の根系を研究するためのより信頼性が高く正確な方法になります1,3,10,11,12。例えば、側根密度に対するPi剥奪の影響は、多くの矛盾した報告の対象となっている。Piが低いとLR密度が増加することが報告されています6,8。対照的に、側根密度の低下は、Pi欠損条件でも見られました3,13,16。これらの不一致は、労働者が異なるブランドの寒天を利用して、さまざまな程度のPi汚染を持つ培地をゼリー化する寒天ベースの成長培地システムに起因する可能性があります10。繰り返しになりますが、RSAに対するZn欠乏の影響を説明しようとする実験は、寒天ベースのゲル化媒体にもZn汚染が含まれているため、寒天ベースのペトリプレート法を十分に利用して行われない可能性があります11。したがって、RSA分析を実行することは、寒天ベースのゲル化培地を使用して栄養欠乏を調査するのに適切ではない場合があります。第二に、寒天ベースのゲル化培地で栽培された植物体は、水耕栽培で栽培されたものほど速く成長しません。第三に、RSAは通常寒天培地に埋め込まれているため、多くの根の特徴が正しく表示されません。第 4 に、RSA をメディアから除去すると、RSA に大きな損傷を与えることが多く、破壊的なサンプリング手法になります。
Jainら10によって発表された以前の水耕栽培技術は、250μmのポリプロピレンメッシュサイズを使用していましたが、これは細孔が狭く、無傷のRSAを引き出すことができませんでした。その結果、その特定のケースでは、RSAを分離するために胚軸領域から苗条を切り取り、それを破壊的なサンプリング方法に変えなければなりませんでした10,11,12。既存の方法は、RSA1に損傷を与えることなくシロイヌナズナの小植物全体を無傷で引き抜くことができる、より大きな孔径(500μm)のポリプロピレンメッシュを使用して、非破壊的に変えるために即興です。植物の種類に応じて、ポリプロピレンメッシュの細孔サイズをいつでも調整できることに注意する価値があります。たとえば、図4は、同様のアプローチを使用して、メディカゴサティバ(アルファルファ)などのさまざまな植物のRSAをマッピングする方法を示しています。メディカゴの根系に対応するために、ポリプロピレンの細孔サイズを1mmにしました。
このシステムの欠点の1つは、寒天プレートシステムと比較して水耕栽培システムでは繁栄しないことが多い根毛の発生である可能性があります。主な原因は、固体培地ではなく液体培地で栄養素を簡単に入手できることです。同じ系で根毛(頑健ではない)の発達を観察し、結果を得たにもかかわらず(補足図1)。Piの利用可能性は根毛の発達に強く影響します10,11。ここで、根毛の長さは最初は2.5 mMまで増加し、その後減少しました。
全体として、システムの主な利点は次のとおりです:(1)洗練されたハイエンド機器を必要としないシンプルで正確な方法です。(2)この方法は、その水耕的性質のために苗条の急速な成長を可能にする。(3)それは非破壊的な方法です。(4)RSAを手動で拡散することで、各特性を適切に表示でき、隠れたRSAが明らかになり、ユーザーに完全な制御が提供されます。(5)この方法は、自由に入手可能なイメージングソフトウェア(すなわち、ImageJ)を採用しており、これも使いやすい。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
私たちは、この研究を支援してくれた米国農務省(Grant 58-6406-1-017)に感謝しています。また、米国ケンタッキー州ボーリンググリーンの西ケンタッキー大学のWKUバイオテクノロジーセンターと、インドのラクナウにあるCSIR薬用芳香植物中央研究所の所長が機器の設備とサポートを提供してくれたことに感謝します(CSIR CIMAP原稿通信番号CIMAP / PUB / 2022/103)。SSは、米国フィラデルフィアのセントジョセフ大学からの財政的支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
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