Summary
Vi använder enkla laboratorieverktyg för att undersöka rotsystemarkitekturen (RSA) hos Arabidopsis och Medicago. Plantorna odlas hydroponiskt över nät och sprids med en konstborste för att avslöja RSA. Bilder tas med skanning eller en högupplöst kamera och analyseras sedan med ImageJ för att kartlägga egenskaper.
Abstract
Omfattande kunskap om utveckling av växtrotsystemarkitektur (RSA) är avgörande för att förbättra effektiviteten i näringsanvändningen och öka grödans odlingstolerans mot miljöutmaningar. Ett experimentellt protokoll presenteras för att inrätta det hydroponiska systemet, växttillväxt, RSA-spridning och avbildning. Tillvägagångssättet använde ett magentaboxbaserat hydroponiskt system innehållande polypropennät som stöds av polykarbonatkilar. Experimentella inställningar exemplifieras genom att bedöma plantlets RSA under varierande näringstillförsel (fosfat [Pi]). Systemet inrättades för att undersöka RSA av Arabidopsis, men det är lätt anpassningsbart att studera andra växter som Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantor används i denna undersökning som ett exempel för att förstå växtens RSA. Frön ytsteriliseras genom behandling av etanol och utspädd kommersiell blekmedel och hålls vid 4 °C för skiktning. Fröna groddar och odlas på ett flytande halv-MS-medium på ett polypropennät som stöds av polykarbonatkilar. Plantorna odlas under standardtillväxtförhållanden under önskat antal dagar, plockas försiktigt ut från nätet och nedsänks i vatteninnehållande agarplattor. Varje rotsystem av plantorna sprids försiktigt på den vattenfyllda plattan med hjälp av en rund konstborste. Dessa Petri-plattor fotograferas eller skannas med hög upplösning för att dokumentera RSA-egenskaperna. Rotegenskaperna, såsom primärrot, laterala rötter och förgreningszon, mäts med hjälp av den fritt tillgängliga ImageJ-programvaran. Denna studie ger tekniker för att mäta växtrotegenskaper i kontrollerade miljöinställningar. Vi diskuterar hur man (1) odlar plantorna och samlar in och sprider rotprover, (2) får bilder av spridda RSA-prover, (3) fångar bilderna och (4) använder bildanalysprogramvara för att kvantifiera rotattribut. Fördelen med den nuvarande metoden är den mångsidiga, enkla och effektiva mätningen av RSA-egenskaperna.
Introduction
Rotsystemarkitekturen (RSA), som är underjordisk, är ett viktigt organ för växttillväxt och produktivitet 1,2,3. Efter embryonalstadiet genomgår växterna sina mest signifikanta morfologiska förändringar. Det sätt på vilket rötterna växer i jorden påverkar i hög grad tillväxten av växtdelar ovan jord. Rottillväxt är det första steget i spiring. Det är ett informativt drag eftersom det unikt svarar på olika tillgängliga näringsämnen 1,2,3,4. RSA uppvisar en hög grad av utvecklingsplasticitet, vilket innebär att miljön alltid används för att fatta beslut om utveckling 2,5. Förändringar i miljön har försvårat växtproduktionen i det nuvarande scenariot. RSA införlivar kontinuerligt miljösignaler i utvecklingsval5. Som ett resultat är en grundlig förståelse av principerna bakom rotutveckling avgörande för att lära sig hur växter svarar på förändrade miljöer 2,5.
RSA känner av varierande näringskoncentrationer och gör fenotypiska förändringar 4,6,7,8,9,10,11,12. Studier tyder på att rotmorfologi/RSA är mycket plastisk jämfört med skottmorfologi 1,3. RSA-egenskapskartläggning är mycket effektiv för att registrera effekten av att förändra den omgivande markmiljön 1,11,12.
I allmänhet har skillnader i effekten av olika näringsbrister på rotfenotypen rapporterats i många tidigare studier 3,11,13,14,15. Till exempel finns det flera kontrasterande rapporter om fosfat (Pi) svältinducerade förändringar i antal, längd och densitet av laterala rötter (LR). En ökning av LR-densiteten har rapporterats under Pi-bristvillkoret 6,8. Däremot har en minskning av LR-densiteten under Pi-bristfälliga förhållanden också rapporterats av andra författare 3,13,16. En av de främsta orsakerna till dessa inkonsekvenser är användningen av det elementära föroreningsbenägna gelningsmediet, vilket agar ofta innehåller10. Forskare odlar vanligtvis sina experimentella växter på ett agarbaserat plattsystem och registrerar rotegenskaperna. Många RSA-egenskaper är ofta dolda eller förankrade i agarmaterialet och kan inte dokumenteras. Experiment kopplade till inducerande näringsbrist, där användare ofta utesluter en komponent helt från mediet, kan inte utföras i elementärt kontamineringsbenägen gelningsmedium11,14,15. Många näringsämnen finns ofta i betydande mängder i agarmediet, inklusive P, Zn, Fe och många fler11,14,15. Dessutom är RSA-tillväxten långsammare i agarbaserade medier än i icke-agarbaserade flytande medium. Som ett resultat finns det ett behov av att fastställa ett alternativt icke-agarbaserat tillvägagångssätt för kvantifiering och kvalitativ registrering av fenotypen av RSA. Följaktligen har den nuvarande metoden utvecklats, där plantor odlas i ett magentaboxbaserat hydroponiskt system ovanpå ett polypropennät som stöds av polykarbonatkilar 1,10,11.
Denna studie presenterar en detaljerad improviserad version av den tidigare metoden som beskrivs av Jain et al.10. Denna strategi har anpassats för nuvarande krav inom växtrotbiologi och kan också användas för växter som Alfalfa, andra än modellväxter. Protokollet är det primära sättet att mäta förändringarna i RSA, och det kräver bara enkel utrustning. Detta protokoll illustrerar hur man fenotypar flera rotfunktioner, såsom primära och laterala rötter i normalt och modifierat medium (Pi-brist). Steg-för-steg-anvisningar och andra användbara tips från författarens erfarenheter tillhandahålls för att hjälpa forskarna att följa med de metoder som erbjuds i denna metod. Den aktuella studien syftar till att ge en enkel och effektiv metod för att avslöja hela växtsystemets rotsystem, inklusive högre ordningens LR. Denna metod innebär att man manuellt sprider rotsystemet med en rund akvarellkonstborste, vilket möjliggör exakt kontroll över exponeringen av rötterna 1,10,11,12. Det kräver inte dyr utrustning eller komplicerad programvara. Denna metod har förbättrat näringsupptag och tillväxthastighet; Växter har en näringsrik lösning som lätt absorberas av sina rötter. Den nuvarande metoden är lämplig för forskare som vill kartlägga egenskaperna hos en växts rotsystem i detalj, särskilt under tidig utveckling (10-15 dagar efter groning). Den är lämplig för små rotsystem, modellväxter som Arabidopsis och tobak och icke-konventionella växter som Alfalfa tills deras rotsystem passar i magentalådorna.
Stegen för fenotypisk analys av RSA-utveckling i Arabidopsis beskrivs i detta protokoll enligt följande: (1) metoden för sterilisering av fröytan för växter (Arabidopsis), (2) stegen för att inrätta det hydroponiska systemet, följt av sådd av utsäde på ett medium, (3) förfarande för att ta ut hela sådden och sprida på Petri-plattan för RSA-analys, (4) hur man spelar in bilderna för RSA, och (5) beräkna viktiga RSA-parametrar med hjälp av ImageJ-programvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hela protokollet sammanfattas schematiskt i figur 1, som visar alla väsentliga steg som är involverade i att avslöja rotsystemarkitekturen (RSA) för plantor. Protokollsteg ges i detalj nedan:
1. Arabidopsis frö yta sterilisering
- Överför en liten skopa (cirka 100 frön = cirka 2,5 mg) frön till ett mikrofugerör och blötlägg i 30 minuter i destillerat vatten vid rumstemperatur (RT). Hela proceduren utförs i aseptiskt tillstånd.
- Centrifugera kortfattat mikrofugeröret som innehåller frön vid 500 x g i 5 s, med vilken bordscentrifug som helst vid RT för att låta fröna slå sig ner.
- Häll av vattnet, tillsätt 700 μL 70% (v/v) etanol, virvel i några sekunder och snurra. Upprepa virvelvridning och centrifugering vid behov, men se till att behandlingstiden för 70% etanol förblir 3 min.
- Efter 3 minuter, skölj omedelbart en gång med sterilt vatten. Håll etanoltvättsteget så snabbt som möjligt, eftersom långvarig etanolexponering minskar grobarheten.
- Behandla fröna med utspädd kommersiell blekmedel (4% v / v) med en droppe Tween-20 i 7 min. Blanda fröna med blekmedelslösning genom att invertera rören snabbt 8-12 gånger, följt av en kort centrifug (500 x g i 5 s vid RT). Skum ses dyka upp i röret.
- Häll av supernatanten med en 1 ml pipett och skölj fröna med minst fem tvättar med sterilt vatten enligt samma virvelprocedur.
- Låt de ytsteriliserade fröna ligga i vatten och inkubera i 2–3 dagar vid 4 °C för skiktning10.
2. Inställning av ett hydroponiskt system för frösprutning
- Halvfyll en vanlig magentalåda med destillerat vatten och autoklavera den. Autoklavera polykarbonatarket (klar färg och jämn textur) och skär rektanglar på 4 cm x 8 cm, med en mittpunkt som är skårad mer än halvvägs genom rektangeln så att två rektanglar kan gå ihop och bilda en X-form10. Använd den här inställningen för att hålla polypropennätet (6 cm x 6 cm rutor med 250 μm porstorlek, eller beroende på behovet) skuren från 12x 24 tums ark10.
OBS: Polypropylen är mycket resistent mot syror, alkalier och andra kemikalier; Därför har man valt det. Autoklavering tenderar att snedvrida polypropennät; Därför rekommenderas det att transporteras separat inslaget i aluminiumfolie. Typiska autoklaveringsförhållanden på 16 min, 121 °C, 15 psi eller 775 mm Hg rekommenderas. - Tillsätt sterila halv-MS basala medier med vitaminer + 1,5% (w/v) sackaros, som beskrivs av Shukla et al.1, till varje låda för att nå den nedre kanten av polypropennätet i ett laminärt flöde. Alla procedurer utförs under aseptiska förhållanden.
- Så de ytsteriliserade fröna på nätet (250 μm porstorlek) hydroponiskt och låt dem växa i 3 dagar.
- Efter 3 dagar, överför plantorna till ett nät (500 μm porstorlek) och låt dem växa i 2 dagar.
- Efter 2 dagar (totalt 5 dagar), överför plantorna till kontrollmediet (dvs. modifierat MS-näringsmedium 1 innehållande 2,0 mM NH 4NO3, 1,9 mM KNO3, 0,15 mM MgSO 4·7H2O,0,1 mM MnSO 4· H2O, 3,0 μM ZnSO4·7H2O, 0,1 μMCuSO4·5H2O, 0,3 mM CaCl 2·2H2O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl2·6H2O, 0,1 mMFeSO4·7H2O, 0,1 mM Na2EDTA·2H2O, 1,25 mM KH2PO4, 100 μM H3BO3, 1 μM Na2MoO4·2H2O, 1,5 % sackaros, 1,25 mM MES, pH 5,7 justerat med 0,1 M MES [pH 6,1]) och till experimentmediet (t.ex. P- [0 mM] behandling; KH 2 PO4 ersätts med 0,62 mM K2SO4 frånkontrollmediekompositionen som nämnts ovan1. För överskott av Pi-behandlingar ökas koncentrationen av KH 2 PO4 i modifierat MS-medium [2,5, 5,0, 10,0, 20,0 mM] 1) och låt fröna växa i 7 dagar.
OBS: En större maskporstorlek (500 μm) underlättar smidig plockning av hela plantor utan skada eller behov av skärning vid hypokotylen. Plantlets växer under normala tillväxtförhållanden (dvs. 16 h ljus / 8 h mörk fotoperiod, 150 μmol · m-2 · s-1 ljusintensitet, 60% - 70% luftfuktighet) vid 23 ° C.
3. Undersökning av RSA
- Förbered agarplattor (1,1%) för rotspridning (Petri-plattstorlek: 150 mm x 15 mm).
- Tillsätt 10-20 ml autoklaverat filtrerat kranvatten till Petri-plattan, som nämnts ovan. Dra försiktigt ut plantorna från nätet (500 μm) och sänk ner dem i vatten på plattorna.
- Bred försiktigt ut varje plantlets rot i den vattenfyllda tallriken med hjälp av en rund akvarellkonstpensel (storlekar: nr 14, 16, 18 och 20).
OBS: När du utför spridningen av rotsystemet, ta först tag i den primära roten och sprid den i en rak linje, eftersom den fungerar som en axel. Sprid sedan LR symmetriskt på vardera sidan av primärroten, där det är möjligt. Därefter sprider du andra ordningens LR kopplad till första ordningens LR. Denna spridningsprocess är en slags konst; gör det försiktigt, långsamt, som en konstnär som ritar en bild av RSA. - Luta plattan något för att ta bort vattnet.
OBS: Vid denna tidpunkt kan proceduren pausas genom att sätta dessa spridningsplattor vid 4 °C. Senare, när bildbehandling krävs, ta ut plattorna och placera dem på RT ett tag. Torka ut det kondenserade vattnet och sedan kan bilden bearbetas bekvämt.
4. Spela in bilder för RSA
- Skanna eller fotografera dessa Petri-plattor på lämpligt sätt.
OBS: För att få högkvalitativa fotografier rekommenderas 600 dpi-upplösningen för skanning och minst en 12 megapixelkamera rekommenderas för fotografering. - Mät egenskaperna hos rotsystemets arkitektur med hjälp av fritt tillgänglig ImageJ-programvara (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). För att snabbt följa stegen för att mäta rotlängden med hjälp av ImageJ-programvaran, se exemplet "mäta DNA-konturlängd"17.
Dessa steg följs för att mäta rotlängderna på bilder som tagits med en högupplöst skanner eller kamera.- Använd ett visst längdavstånd för att ställa in skalan. Det kända avståndet för skalstången i figur 3 är 2 cm. Välj verktyget Rak linje i verktygsfältet ImageJ (femte verktyget från vänster). Använd verktyget Rak linje för att skapa en linjemarkering som konturerar skalstapeln. Slutför dispositionen genom att högerklicka, dubbelklicka eller klicka i rutan i början.
- Mät längden på den kända skalstapeln i pixlar med verktygsfältet Analysera > Mät. Anteckna pixellängden.
- Öppna dialogrutan Ange skala genom att klicka på fliken Ange skala på fliken Analysera. I fältet Avstånd i pixlar anger du pixellängden (enligt ovan). Ange sedan värdet i fältet Känt avstånd, vilket visas av skalfältet (här är det 20 mm). Ställ in längdenheten som mm. Pixelproportionerna är 1,0. Nu anges skalan med x antal pixlar per millimeter. För att låsa skalan för just den här bilden, klicka på OK.
- Skapa en linjemarkering som visar rotlängden med verktyget Segmenterad linje . Slutför dispositionen genom att högerklicka, dubbelklicka eller klicka i rutan i början. Klicka och dra de små svartvita "handtagen" längs konturen för att justera linjevalet efter behov.
- Använd kommandot Mät under fliken Analysera i ImageJ för att kvantifiera rotens längd. För att överföra mätdata till ett kalkylblad, högerklicka på resultatfönstret , välj Kopiera alla från popup-menyn, växla till kalkylbladet och klistra sedan in data.
Som beskrivits ovan ställer du in skalan med det kända avståndet för skalstapeln i alternativet ImageJ set scale. Detta ger antalet pixlar per längdenhet. Det är nödvändigt att ställa in skalan varje gång, när en ny bild analyseras.
- Mätning och beräkning av RSA-egenskaper
- Mät den primära rotlängden mellan hypokotylkorsningen till rotspetsens ände.
- Mät första och andra ordningens LR-längd.
- Mät förgreningszonen (BZ) för den primära roten. Förgreningszonen för den primära roten (BZPR) sträcker sig från den första LR-framväxande punkten till den sista LR-framväxande punkten.
- Registrera antalet LR, vilket är antalet LR med ursprung inom gränsen för BZPR.
- Mät den genomsnittliga längden på första och högre ordningens LR. Härled den genomsnittliga längden på första ordningens LR (1 ° LR) (centimeter per rot) genom att dividera den totala längden på 1 ° LR med det totala antalet 1 ° LR.
- Mät den genomsnittliga längden på andra ordningens LR. Beräkna den genomsnittliga längden på andra ordningens LR (2 ° LR) genom att dividera den totala längden på 2 ° LR med det totala antalet 2 ° LR.
- Mät densiteten 1° LR. Beräkna densiteten 1° LR (antal 1° LR per längdenhet BZPR) genom att dividera antalet 1° LR med längden på BZPR.
- Mät densiteten 2° LR. Beräkna densiteten 2° LR genom att dividera antalet 2° LR med längden på BZ på 1° LR (antal 2° LR per längdenhet på BZ på 1° laterala rötter).
- Mät den totala rotlängden (TRL). Detta är aggregatet av primärroten, 1° LR och 2° LR (och mer om det finns) längder.
5. Mätning av rothår
OBS: Även om det hydroponiska systemet inte är bra på att främja rothårväxt och utveckling, trots att det är lika robust som det är i fasta tillväxtmedier, är det fortfarande viktigt att studera det i nuvarande sammanhang. Följ stegen nedan för att analysera rothårsutveckling i en 5 mm sektion från spetsen av plantornas primära rot.
- Hugg av en 2 cm sektion av primärroten från rotspetsen.
- Montera rotsektionen på en bild med 10% glycerol som monteringsmedium.
- Placera bilden under ett stereomikroskop.
- Använd den axiella bäraren för att visualisera och ta bilder av rothåren.
- Analysera bilderna för att studera strukturen och egenskaperna hos rothåren med hjälp av ImageJ-programvara som tidigare beskrivits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De olika morfometriska egenskaperna hos rotsystemarkitektur (RSA) mäts med enkla laboratorieverktyg, och stegen visas schematiskt i figur 1. Detaljerna i den hydroponiska installationen visar protokollets potential vid mätning av RSA (figur 1 och figur 2).
Med tanke på de observerade skillnaderna i gelningsmedel använde vi ett hydroponiskt odlingssystem för att genomföra alla studier 3,10. Som ett bevis på konceptet fungerar detta hydroponiska system bra, vilket återspeglar den uppenbara kontrasterande fenotypen under Pi-bristfälliga och tillräckliga förhållanden (figur 3). Arabidopsisfrön odlades hydroponiskt i 5 dagar i ett halv-MS-medium på ett polypropennät, vilket illustreras i figur 2. Plantorna transplanterades efter 5 dagar till Pi-brist och tillräckliga förhållanden och fick växa i 7 dagar (figur 3).
Demonstration av RSA-egenskaper under varierad näringstillförsel (Pi)
Vi har följt ett etablerat system för att analysera och registrera egenskaperna hos RSA3. Olika RSA-egenskaper analyserades under kontrasterande Pi-regimer under hydroponiska förhållanden (figur 3). Pi bristfällig behandling (0 mM Pi) åberopade en typiskt rapporterad rotfenotyp som uppvisar en kortare, grundare och mindre grenad RSA jämfört med Pi tillräckligt tillstånd (figur 3A). Primärrotlängden försvagades signifikant under tillståndet med Pi-brist (figur 3A,B). Primärrotlängd, som snabbt uppnås i närvaro av Pi (1,25 mM), visar effektiviteten hos det hydroponiska systemet som återspeglar de fysiomorfologiska förändringarna på ett adekvat sätt (figur 3A, B). TRL minskade signifikant under Pi-bristtillståndet (figur 3B). Förgreningszonen (BZPR), som visas i figur 3A, försvagades signifikant under Pi-bristtillståndet (figur 3B).
Av dessa egenskaper var den mest drabbade TRL, på grund av den höga skillnaden i LR-tal mellan de två Pi-förhållandena. Den kraftiga tillväxten av RSA under Pi-tillräckligt tillstånd (1,25 mM) berodde på en signifikant ökning av antalet och längden på 1 ° LR. Således inträffade en snabb RSA-förändring, främst på grund av förändringen i LR-utvecklingen. Vi mätte antalet LR med ursprung inom gränsen för primärrotens förgreningszon, eftersom de anses vara mer meningsfulla 1,3,18. Den genomsnittliga längden på 1 ° LR (centimeter per rot) reducerades signifikant i Pi-bristtillståndet (figur 3C). Den genomsnittliga längden på 2 ° LR reducerades på liknande sätt på grund av P0-tillståndet; Det var dock lägre i kvantitet än den genomsnittliga 1 ° LR-längden (figur 3C). Antalet 1° LR och 2° LR minskade kraftigt under P0-villkoret jämfört med P1.25-villkoret (figur 3D). Densiteten 1° LR (antal 1° LR per centimeter BZPR-längd) ändrades inte under P0-villkoret i förhållande till P1.25-villkoret (figur 3E). Densiteten 2° LR (antal 2° LR per centimeter av BZ av 1° LRs) visade inte heller någon signifikant förändring (figur 3E). Som ett resultat är det viktigt att bestämma densiteten hos LR för att få användbar inblick i RSA-plasticiteten.
Analys av rothårutveckling under varierande fosfat (Pi) regimer
Effekten av Pi-tillförsel på rothårutveckling studerades i den primära roten av plantor. Det visade sig att rothårlängden ökade med ökande koncentrationer av Pi upp till 2,5 mM, men minskade vid 5 mM och 10 mM. Men vid 20 mM återgick rothårets längd till nära toppnivåer (kompletterande figur 1). Antalet rothår var signifikant högre vid 0 mM jämfört med alla andra Pi-leveranser, med det högsta antalet observerat vid 20 mM (kompletterande figur 1).
Tillämpning av denna metod på andra växter än Arabidopsis
Vi har undersökt genomförbarheten av den nuvarande metoden på andra växter än Arabidopsis, med Medicago sativa (Alfalfa) som testanläggning. Protokollet har modifierats i enlighet med kravet på två aspekter: (1) steriliseringsmetoden för fröytan och (2) porstorleken på polypropennätet (nu större, 1 000 μm). Ytfrösteriliserings- och stratifieringsprotokollet måste alltid optimeras beroende på de valda växterna att studera. För Alfalfa följdes stegen enligt beskrivningen av Weeks et al.19. Efter ytsterilisering inkuberades fröna vid 4 °C i 7 dagar för stratifiering. Därefter följde vi samma procedur som beskrivs i detta protokoll med en modifiering av maskporstorleken. Som visas i figur 4A, B var plantorna välvuxna, med en förändrad RSA under varierande tillgång på Pi. Figur 4C visar rotsystemets plasticitet under 1,25, 0 och 20 mM Pi-näringslösning. Överskott av Pi (20 mM) och bristfällig Pi-tillförsel ledde till minskad utveckling av rotsystemet, jämfört med Pi-tillräckligt (1,25 mM) tillstånd (kontroll) (figur 4C). RSA kan mappas för olika egenskaper med hjälp av ImageJ-programvaran som beskrivs i protokollet. Därför är protokollet enkelt, effektivt och kan enkelt modifieras enligt de valda växtarterna. Det ger möjlighet att studera RSA av olika växtarter under olika näringsförhållanden.
Figur 1: Schematisk bild av förfarandet. Det schematiska diagrammet beskriver de viktigaste stegen i metodprotokollet för kartläggning av RSA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Visning av hydroponisk inställning i magenta lådor för att odla plantor . (Som beskrivits av Jain et al.10, med modifikationer). (A) Två rektangulära bitar (4 cm x 8 cm) med skåror av polykarbonatkilar för montering av uppställningen. (B) Montering av polykarbonatkilar i varandra genom skåra som förvandlas till en X-form för att stödja maskytan. c) En 250 μm polypropennätsfolie (6 cm x 6 cm). (D) Ovanifrån av sammansättningen av polykarbonatkilar i magentaboxen. E) Montering av polypropennätet på kilarna av polykarbonat i en magentalåda fylld med medier. F) En uppvisning av Arabidopsis-plantor som groddar på nätet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Påvisande av typisk RSA-modulering under varierande näringsbetingelser (Pi-brist [0 mM] och tillräcklig [1,25 mM]) med hjälp av denna fenotypningsmetod. Arabidopsis (Col-0) plantor odlas hydroponiskt i 0,5x MS-media i 5 dagar och utsätts därefter för Pi-brist och tillräckliga leveranser (0 respektive 1,25 mM) och odlas i 7 dagar, som visas i figur 2. (A) Enskilda plantor dras ut från polypropennätet (500 μm) och sprids på agar Petri-plattorna med hjälp av en rund konstborste och vatten. Data för RSA-egenskaper presenteras för (B) primärrotens (PR) längd, total rotlängd (TRL), förgreningszon (BZ), (C) medelvärde (Av.) första ordningens laterala rotlängd (1° LR-längd), medelvärde (Av.) andra ordningens laterala rotlängd (2° LR-längd), (D) antal 1°LR och 2° LR, och (E) 1° LR och 2° LR-densitet. Värden är medel ± SE; n = 21. Denna siffra har modifierats från Shukla et al.1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Demonstration av Medicago sativa (Alfalfa) rotsystem som ett exempel för att visa tillämpligheten av denna metod på andra växter förutom Arabidopsis . (A) Sidovy av magentaboxen som visar tillväxten av Alfalfa-plantor. (B) Den övre bilden av magentaboxen visar skottets uppkomst på polypropennätet (porstorlek 1 000 μm). (C) Den typiska rotsystemarkitekturen (RSA) för Alfalfa-modulering under varierande näringsförhållanden (Pi-brist [0 mM], överskott av Pi [20 mM] och tillräcklig eller kontroll [1,25 mM]) med hjälp av denna RSA-fenotypningsmetod. Alfalfa plantor odlas hydroponiskt i 0,5x MS media i 5 dagar, utsätts för Pi-brist, tillräcklig och överflödig tillförsel (0, 1,25 respektive 20 mM) och odlas i 7 dagar. Enskilda plantor dras ut från polypropennätet (1 000 μm) och sprids på agar Petri-plattorna, som visas i C, med hjälp av en konstborste och vatten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Olika överskott av Pi-koncentrationer modulerar rothårsutvecklingen. WT-plantor odlades hydroponiskt, som beskrivs i protokollet. (A) En 1-2 cm sektion från spetsen av primärroten hackades och monterades på en bild med 10% glycerol, och en 5 mm region från spetsen dokumenterades för rothårets antal och längd. Data presenteras för (B) rothårets längd och (C) antalet rothår i ett 5 mm område av den primära rotspetsen. Värden är medel ± SE; n = 10 (B och C). Staplar med olika alfabokstäver skiljer sig signifikant (p ≤ 0,05) enligt Students parade t-test. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete demonstrerade kartläggning av RSA med hjälp av enkel laboratorieutrustning. Med hjälp av denna metod registreras fenotypiska förändringar på raffinerad nivå. Fördelen med denna strategi är att skottdelen aldrig kommer i kontakt med media, så fenotypen hos plantorna är original. Denna metod innebär att man inrättar ett hydroponiskt system för att odla plantor som beskrivs i protokollet. Därefter tas varje planta ut intakt och placeras på en agarfylld petriska. Rotsystemet får sedan spridas manuellt med hjälp av en konstpensel, och fotografier tas för att analyseras med ImageJ-programvaran 1,10,11,12.
Frösprutning kräver sterilisering av fröytan för att avlägsna bakterier, svampar och virus. Alkohol - 70% etanol - används för att sterilisera fröytor. För att desinficera frön utan att förstöra dem måste behandlingstiden för alkoholsterilisering följas noggrant. Frösprutning minskar när alkoholsterilisering överdrivs. Behandlingstiderna varierar med olika växtarter (t.ex. för Arabidopsis är tidsgränsen endast 3 min 1,10,11,12,20, medan den för Medicago sativa är 5 min 19. För att underlätta smidig plockning av RSA för analys är det viktigt att begränsa antalet frön per nät eller magenta låda, för att förhindra intrassling av rotsystemet i sig 1,10,11,12. Detta kan uppnås genom att använda ett mindre antal frön per nät. Till exempel kan användning av fyra frön per nät bidra till att minska risken för intrassling samtidigt som man möjliggör robust tillväxt och utveckling av rotsystemen. Det är viktigt att notera att det optimala antalet frön per nät beror på de specifika växtarterna och målen för RSA-analysen. Till exempel, om ett experiment kräver vävnad för ytterligare nedströms bearbetningskrav som RNA-isolering, rekommenderas i detta fall bulksådd (100 frön per nät vid Arabidopsis)1,10,11,12. Att plocka plantor från nätet är en känslig process som kräver största omsorg och uppmärksamhet 1,10,11. Det är viktigt att närma sig denna uppgift långsamt, försiktigt och noggrant för att undvika att skada de känsliga plantorna. För att plocka plantor från nätet rekommenderas att du använder fin pincett eller pincett för att ta tag i plantorna försiktigt men fast. Plantorna ska försiktigt lyftas ut ur nätet för att undvika att störa rotsystemen eller orsaka skador på plantorna. Det är viktigt att ha tålamod och ta sig tid att försiktigt ta bort varje plantlet från nätet för att säkerställa att de inte skadas under processen. Det är en gradvis process som bör genomföras långsamt, försiktigt och noggrant för att säkerställa experimentets framgång. För att noggrant mäta RSA för plantor är det viktigt att markera en skala på Petri-plattan för att möjliggöra exakt mätning 1,10,11. Detta kan göras genom att använda en permanent markör för att rita en linje på Petri-plattan på ett känt avstånd, till exempel 1 cm eller 2 cm. Skalan ska placeras längs kanten på Petri-plattan på en synlig plats. Med hjälp av en borste är det också viktigt att vara ytterst försiktig när du sprider RSA. Den primära roten ska placeras noggrant i mitten av Petri-plattan, och sidorötterna ska spridas ut på båda sidor av primärroten. Rotsystemet bör delvis nedsänkas i vatten för att underlätta spridningen. För att mäta varje ny Petri-platta måste man ställa in skalan i ImageJ-programvaran varje gång.
Få modifieringar kan användas för att förbättra effektiviteten, icke-invasiviteten och effektiviteten av RSA-analys1. En sådan förbättring är att ändra porstorleken på polypropennätet som används för att hålla plantorna. Nätets porstorlek kan justeras för att passa de specifika behoven hos de växtarter som studeras och för att optimera tillväxten och utvecklingen av rotsystemen 1,10,11,12. Till exempel underlättar en större maskporstorlek (500 μm) en smidig plockning av hela plantor utan att skära hypokotylen, som tidigare praktiserades10,11,12. Vidare kan en större porstorlek vara mer lämplig för större växtarter RSA, medan en mindre porstorlek kan vara mer lämplig för mindre växtarter. En annan modifiering som kan göras är att linda in polypropennätet i aluminiumfolie för att förhindra att det böjs. Detta kan hjälpa till att bibehålla nätets form och integritet, vilket gör det lämpligt att fungera som en platt golvmatris. Utöver dessa ändringar kan andra felsökningstekniker användas för att åtgärda eventuella problem som kan uppstå under RSA-analys. Till exempel, om plantorna inte växer eller utvecklas som förväntat, kan det vara nödvändigt att justera miljöförhållandena, såsom temperatur, fuktighet och ljusnivåer. Om rotsystemen är intrasslade kan det vara nödvändigt att minska antalet frön per nät, som nämnts ovan.
En av de främsta fördelarna med RSA-analys är att den gör det möjligt att studera växtrotsystem utan behov av agar. Agar används ofta som ett stelningsmedel i växtvävnadsodling och frögroningsexperiment. Användning av agar kan dock introducera elementär förorening som potentiellt kan generera artefakter och påverka resultatens noggrannhet10. Genom att utesluta kravet på agar eliminerar RSA-analys risken för agar-härledd elementär kontaminering och potentialen för artefakter. Detta gör RSA-analys till en mer tillförlitlig och exakt metod för att studera växtrotsystem 1,3,10,11,12. Till exempel har effekterna av Pi-deprivation på lateral rotdensitet varit föremål för ett antal motsägelsefulla rapporter. Det har rapporterats att LR-densiteten ökar när Pi är låg 6,8. Däremot har en minskning av lateral rotdensitet också hittats i Pi-bristfälliga förhållanden 3,13,16. Dessa skillnader kan hänföras till det agarbaserade tillväxtmediesystemet, där arbetare använder olika märken av agar för att jellifiera media med varierande grader av Pi-kontaminering10. Återigen kan experiment som försöker illustrera effekten av Zn-brist på RSA inte utföras tillräckligt med den agarbaserade Petri-plattmetoden, eftersom det agarbaserade gelningsmediet också innehåller Zn-förorening11. Därför kan det vara olämpligt att utföra RSA-analys för att undersöka näringsbrist med hjälp av det agarbaserade geleringsmediet. För det andra utvecklas plantor som odlas på agarbaserade gelningsmedier inte lika snabbt som de som odlas hydroponiskt. För det tredje, eftersom RSA vanligtvis är inbäddad i ett agarmedium, visas inte många rotfunktioner korrekt. För det fjärde orsakar borttagning av RSA från mediet ofta betydande skador på RSA och gör det till en destruktiv provtagningsteknik.
Den tidigare hydroponiska tekniken, som publicerades av Jain et al.10, använde en polypropenmaskstorlek på 250 μm, som hade smalare porer som inte gjorde det möjligt att dra ut den intakta RSA. Som ett resultat, i det specifika fallet, var vi tvungna att skära plantorna från hypokotylregionen för att separera RSA och förvandla den till en destruktiv provtagningsmetod10,11,12. Den befintliga metoden är improviserad för att göra den icke-destruktiv genom att använda ett polypropennät med en större porstorlek (500 μm) som gör det möjligt att dra ut hela Arabidopsis-plantor intakta utan att skada RSA1. Det är värt att notera att vi alltid kan justera porstorleken på polypropennätet, beroende på plantans typ. Figur 4 illustrerar till exempel hur ett liknande tillvägagångssätt kan användas för att kartlägga RSA för olika växter, såsom Medicago sativa (Alfalfa). Vi har valt polypropenporstorleken på 1 mm för att rymma Medicagos rotsystem.
En nackdel med detta system kan vara utvecklingen av rothår, som ofta inte blomstrar under hydroponiska system jämfört med agarplattsystem. Den främsta orsaken är den enkla tillgängligheten av näringsämnen i flytande medier snarare än i fasta medier. Även om vi observerade utvecklingen av rothår (inte robust) med samma system och fick resultaten (kompletterande figur 1). Tillgängligheten av Pi påverkar starkt rothårutvecklingen10,11. Häri ökade rothårets längd initialt till 2,5 mM och minskade sedan.
Sammantaget är de viktigaste fördelarna med systemet: (1) det är en enkel och exakt metod som inte kräver någon sofistikerad avancerad utrustning; (2) Metoden möjliggör snabb tillväxt av plantorna på grund av dess hydroponiska natur. (3) det är en icke-destruktiv metod; (4) manuell spridning av RSA möjliggör korrekt visning av varje egenskap, avslöjar den dolda RSA, vilket ger full kontroll till användaren; och (5) metoden använder en fritt tillgänglig bildprogramvara (dvs. ImageJ), som också är enkel att använda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi erkänner US Department of Agriculture (Grant 58-6406-1-017) för att stödja denna forskning. Vi erkänner också WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, och direktören, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Indien, för att ha tillhandahållit instrumentfaciliteter och support (CSIR CIMAP manuskriptmeddelande nr. CIMAP/PUB/2022/103). SS erkänner det ekonomiska stödet från Saint Joseph's University, Philadelphia, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
