Name: Nuclear Transfer in Maus-Oozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Kerntransfer-Technik zur Reprogrammierung differenzierter Zellkerne in Maus-Oozyten. Diese Methode ermöglicht wichtige Einblicke in die Entwicklungsbiologie und Stammzellforschung.

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DE möchte Dr. ausblenden Akutsu für die gemeinsame Nutzung seiner NT Tricks und Dr. Stephen Sullivan und Garrett Birkhoff für die kritische Durchsicht des Protokolls zu danken.

Vorbereitungen: <ol><li class="jove_step"> Eine detaillierte Beschreibung der Superovulation und microdrop Embryokultur kann an anderer Stelle 2 zu entnehmen. </li><li class="jove_step"> Bereiten Sie eine Petrischale mit Mikrotropfen der Embryo Kulturmedium (zB KSOM, Chemicon). Deckel mit Mineralöl (Erdöl Chargen sollten für die Kompatibilität mit Embryokultur getestet werden). Äquilibrieren bei 37 ° C in Luft plus 5% CO 2. (In Thermo-Electron 3110 Wassermantel Inkubator oder gleichwertig) </li><li class="jove_step"> Bereiten Sie eine Schüssel für die Isolierung von Oozyten: Place Tropfen Hepes gepuffert CZB &amp; Hyaluronidase (0,1% w / v, Sigma) in einer Hälfte des Tellers und HCZB in der anderen Hälfte. Deckel mit Mineralöl. Halten Sie die Schale warm auf einem beheizten Bühne eines Dissektionsmikroskop. </li><li class="jove_step"> Bereiten Sie das Mikroskop: Legen Sie eine Haltepipette aus einem äußeren Durchmesser von etwa 50 μ m (etwas kleiner als der Durchmesser der Eizelle) und eine Öffnung von ca. 20 μ m in einem Pipettenhalter. Halten Pipetten sind einfach, mit der erforderlichen Ausstattung, eine Nadel Puller (Sutter Instruments) und einem microforge (Narishige) machen, aber sie können auch aus Humagen erworben werden. Legen Sie 3-5 μ l Quecksilber in den Schwanz einer Mikropipette (Innendurchmesser 8 μ m). Vermeiden Sie Quecksilberleckagen. Bereiten Sie einen Teller mit mehreren kleinen Tropfen je 11% w / v PVP (Polyvinylpyrrolidon) in HCZB und 5 μ g / ml Cytochalasin B in HCZB. Verwenden Sie den Deckel einer Petrischale, anstatt das Gericht selbst als Deckel hat einen kurzen Felge, die nicht mit der Bewegung des Betriebes und der Enukleation Pipetten wird beeinträchtigt. Richten Sie die Haltepipette und die Enukleation Pipette in einem HCZB fallen. Saugen Sie ein wenig HZCB in die Spitze des Haltepipette. </li><li class="jove_step"> Vorbereitung von Spender-Zellen hängt weitgehend von der Zellart und dem Experiment der Forscher will durchführen. Im Allgemeinen sollten Spenderzellen mit einem proteolytischen Enzym wie Trypsin behandelt und auf Eis gehalten, um Klebrigkeit bis zum Transfer zu reduzieren. </li><li class="jove_step"> Human einschläfern Mäuse 14-15 Stunden nach der Verabreichung von hCG. Ernte Eileiter und sezieren sie in den warmen HCZB-Hyaluronidase Tropfen. Nach ca.. 5 min, wird Eizellen werden vor allem frei von Cumulus-Zellen. Sie sollten dann mehrere Male in HCZB gewaschen werden, dann weiter in die voräquilibriert KSOM Tropfen gewaschen, und hielt in den Inkubator bis Enukleation. </li></ol> Enukleation Manipulationen sind mit hydraulischen Mikromanipulatoren, (Narishige) auf einem inversen Mikroskop, wie die Nikon TE200 getan. Ein Piezo-Mikromanipulator (Primetech) ist für das Bohren der Zona pellucida verwendet. Flat-Spitze Enukleation und Transferpipetten aus Humagen erworben werden. Reinigen und schmieren Sie die Enukleation Pipette in die PVP Tropfen durch die Vertreibung mikroskopischen Quecksilbertröpfchen und durch Absaugen und Vertreibung PVP. Um zu verhindern, Klebrigkeit der Nadel, sollte das gleiche Verfahren zwischen den einzelnen Gruppen von Eizellen, die entweder entkernt werden oder übertragen getan werden. Legen Sie eine kleine Gruppe von Eizellen in den HCZB-Cytochalasin B fallen. Die Größe der Gruppe sollte auf der Ebene der Erfahrung des Untersuchers angepasst werden. Eizellen sollten nicht auf der Bühne nicht länger als 20-30 min gehalten werden. Bewegen Sie die Instrumente, um die HCZB-Cytochalasin B fällt. Die Holding Pipette und der Enukleation Pipette sollte in Einklang mit der Äquatorebene der Eizelle gebracht werden. Dies wird möglich, wenn die Haltepipette hat einen Außendurchmesser, der geringfügig kleiner als die Eizelle selbst ist. Drehen Sie eine Eizelle bis zum unterschiedlich refraktiven Metaphase Spindel zu sehen. Wenn ein Anfänger nicht sehen können, die Spindel, die Metaphaseplatte identifiziert mit dem DNA-Farbstoff Hoechst und UV-Beleuchtung jedoch, dass nicht kompatibel ist mit effizienten Embryonalentwicklung werden. Position der Metaphase Spindel bei 3 Uhr und halten Sie sie gut mit dem Haltepipette. Bewerben Piezo-Impulse an die Zona pellucida zu durchdringen. Berühren Sie die Metaphase-Platte mit der Enukleation Pipette. Sobald der Widerstand der Metaphase Spindel &quot;gefühlt&quot; werden können, absaugen die Spindel und ziehen Sie die Nadel. Die Eizelle Zytoplasma ist fließend, der Metaphase Spindel jedoch bewegt sich wie ein Klumpen, wenn sie mit der Pipette berührt. Versuchen Sie, den Betrag von Zytoplasma, die mit der Spindel entfernt zu reduzieren. Nachdem eine Gruppe von Oozyten wurden entkernt wurde, waschen Sie sie durch Embryo Kulturmedium und legen Sie sie in den Brutschrank bis zum Transfer. Einige entkernte Eizellen dürfen nicht übertragen werden, sollten aber aktiviert werden und dienen als Kontrolle für Enukleation. Diese Eizellen werden Fragment innerhalb von mehreren Stunden, was eine erfolgreiche Enukleation. Nuclear Transfer Legen Sie Zellen in PVP-Lösung (11% PVP in HCZB). Wenn viele Klone Verhaftung an der 1-Zell-Stadium, sollte der PVP-Konzentration auf 5% oder weniger gesenkt werden. Mix-Zellen auch with PVP. Pick-up-Zellen mit einer Pipette mit einem inneren Durchmesser, der geringfügig kleiner als der Durchmesser der Zelle. Die Membran der Zelle soll auf Bestreben zu brechen. In einigen Fällen können wiederholte Vertreibung und Aspiration sowie die Anwendung der sanften Piezo-Impulse verwendet, um die Donor-Zelle zu brechen. Ein neuer Tropfen Spenderzellen sollte mit jeder Gruppe von Eizellen übertragen werden, wie Spenderzellen nach einiger Zeit klebrig. Spritzen Sie die gebrochenen Donorzelle kurz nach dem Bruch der Membran. Für die Übertragung auf die Äquatorialebene der Eizelle selbst und nicht die Äquatorialebene der Zona pellucida zu konzentrieren, und positionieren Sie den Transfer und die Haltepipette in der gleichen Ebene. Halten Sie die Eizelle auch einen Teil seiner Zytoplasma fest. Dringen in die Zona pellucida mit Piezo-Impulse. Bringen Sie den Spender Kern an der Spitze der Pipette, dann drücken Sie die Pipettenspitze fast auf der gegenüberliegenden Seite der entkernten Eizelle, in der Nähe des Haltepipette, was eine tiefe Furche in die Eizelle. Saugen Sie eine sehr kleine Menge von Eizelle Zytoplasma in die Pipette, tragen eine einzelne schwache Piezo-Impuls an die Eizelle Membran zu brechen, werfen Sie die Spender Kern, ziehen Sie die Nadel schnell, während Absaugen an der Cytoplasmamembran am rechten Ende der Furche. Durch die gleichzeitige Zurückziehen der Nadel und das Absaugen, sollte es möglich sein, um das Loch hinten von links NT zu schließen. Dieses &quot;Loch Entfernung Technik wird die Anzahl der Eizellen, die während der NT lysieren. Waschen Sie die rekonstruierten Eizellen in KSOM und bringt sie in den Inkubator für 1-3 Stunden. Oocyte Aktivierung Bereiten Sie die eine Hälfte eines Tellers mit Tröpfchen von Kalzium frei MCZB und die andere Hälfte mit Tröpfchen von Kalzium frei MCZB zuzüglich 10 mM Sr 2 + und 5 μ g / ml Cytochalasin B zu Polkörper Extrusion zu hemmen. Äquilibrieren für 30 min. unter 5% CO 2 in Luft. Wash NT Embryonen auch in Calcium-freier MCZB und sie dann in kleinen Gruppen in verschiedene Tropfen Calcium-freier MCZB. Bringen Sie die Schüssel in den Inkubator und Kultur für 5-6 Stunden. Zur Kontrolle für die künstliche Aktivierung Protokoll und für Embryokultur Bedingungen sollte nicht entkernte Eizellen eingesetzt werden. Sie werden als parthenogenetischen Embryonen entwickeln. Nach der Aktivierung, waschen Sie die Embryonen durch KSOM Ort und Embryonen im Inkubator für die langfristige Kultur. Vorkerne sichtbar sein soll zu diesem Zeitpunkt, was eine erfolgreiche Übertragung. Embryo Culture Medien Cookbook Master-Salze Beginnen Sie mit 980 mL Reinstwasser H 2 O in sterile 1 L Flasche Add trockenen Komponenten: NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886 KCl 360 mg (5mm) Sigma P-5405 MgSO 4 • 7 H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773 KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655 EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635 Glucose (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152 Add flüssigen Komponenten Na-Laktat (Milchsäure) 5,3 mL &amp; nbsp; Sigma 44263 Pen&#39;Strep 10 mL Gibco 15140-122 Für MCZB Lager Salze: Filter sterilisieren 500 mL Master-Salze (gut für 3-4 Monate; lagern bei 4 ° C) Für HCZB Lager Salze: Beginnen Sie mit 500 mL Master-Salze Dann werden 50 mg PVA (kalt löslich; Sigma P-8136) Stir für 30-60 min und Sterilfilter (gut für 3 Monate; lagern bei 4 ° C) Ca + + Kostenloses MCZB (für Eizellen Aktivierung in 5% CO 2) Beginnen Sie mit 99 mL MCZB Lager Salze Add trockenen Komponenten: NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761 Na-Pyruvat (Brenztraubensäure) 3 mg Sigma P-4562 L-Glutamin 15mg Sigma G-8540 Rinderserumalbumin (BSA) 500 mg Sigma A-3311 Swirl, bis alle Komponenten gelöst sind; Sterilfilter. HCZB (für Mikromanipulation in Umgebungsatmosphäre) Beginnen Sie mit 99 mL HCZB Lager Salze Add trockenen Komponenten: Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784 NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761 Add flüssigen Komponenten: 128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 mL Sigma C-7902 Der pH-Wert auf 7,5 mit 1 N HCl Swirl, bis sie gelöst; Sterilfilter.

<ol><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Mammalian+and+Avian+Transgenesis-+New+Approaches%22">Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches</a>. Pease, S., Lois, C. , Springer. (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. Press, C. S. H. L. , (2003).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Bitte überprüfen Sie die zusätzliche Puffer Kompositionen in das Protokoll teil.

nuclear transfer in maus-oozyten

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear Transfer in eine unbefruchtete Eizelle kann Entwicklungspotenzial zu einer differenzierten Zelle wiederherzustellen. Dies zeigt, dass die zugrunde liegenden Prozesse Entwicklung, Differenzierung und Alterung epigenetische anstatt genetische Prozesse sind. Die Reversibilität dieser Prozesse eröffnet spannende Perspektiven in Grundlagenforschung und in der ferneren Zukunft, in der regenerativen Medizin. In der Maus können embryonale Stammzellen aus geklonten Embryonen Präimplantationsstadium abgeleitet werden. Solche embryonalen Stammzellen haben die Fähigkeit, sich zu allen Zelltypen des erwachsenen Organismus zu geben. Wichtig ist, dass diese Zellen genetisch identisch mit dem Spender. Wenn für Menschen, würde dies ermöglichen die Gewinnung von Stammzellen aus einem Patienten. Diese Zellen könnten dann in das betroffene Zelltyp des Patienten differenziert werden und studiert in vitro oder verwendet werden, um die beschädigte oder fehlende Zellen zu ersetzen. Das Studium der Kerntransfer bei der Maus bleibt wichtig, da sie uns über die Prinzipien der nuklearen Umprogrammierung informieren können. Dieser Film und die begleitenden Protokoll sollen helfen Lernen Kerntransfer bei der Maus, eine Methode, zunächst in der Arbeitsgruppe von Prof. Yanagimachi (Wakayama et al. 1998) entwickelt.

Dieser Film und das Protokoll sollen helfen, das Lernen Kerntransfer.

Nuclear Transfer in Maus-Oozyten

Der Kerntransfer in eine unbefruchtete Eizelle kann das Entwicklungspotenzial einer differenzierten Zelle wiederherstellen. Dies belegt, dass die zugrunde liegenden Prozesse ...

Wir führen also die nukleare Übertragung durch, da unsere Gruppe an der Reprogrammierung interessiert ist. Dies ist ein faszinierender Prozess, bei dem der differenzierte Zellkern in einen embryonalen Zustand zurückprogrammiert werden kann. Dies sind die Reagenzien Fall SUM und HCCV sowie Hyaluronidase.Und zuerst bereite ich eine Schale mit, und diese kommt in die Inkubatoren, um mit einem CO2 auszugleichen. Dies sind Tropfen, mehrere Tropfen für Turing, die mit Mineralöl bedeckt sind. So kalibrieren sie die CO2-Atmosphäre.Geben Sie nun einen Tropfen HCZB hinzu. Dieser dient zum Waschen. Dieser ist an Tagen hoch und erneut mit diesem Mineralöl bedeckt.Dieser hohe Wert sinkt mit Hyaluronidase. Diese hier sind nur HCCP-Tropfen. Diese dienen zum Waschen.Dies dient zum Entfernen von ulu-Zellen von der O-Seite. Dieses Stadium wird beheizt, sodass es sich erwärmt, bis ich zurückkehre, um die Ölabscheidungen von den Mäusen zu entnehmen und alles mit Mineralöl zu bedecken. Hier handelt es sich um PVP-Tropfen zur Reinigung der Nadel und zum Einfüllen der Zellen, und dies ist HCCB plus Cyla B. Und hier werde ich die Manipulationen durchführen.Okay, das hier ist eine Nadel-Farbe. Was ich jetzt mache, ist, eine Nadel zu ziehen. Gut, jetzt habe ich eine sehr feine, sehr dünne Nadel.Und nun ist dies eine Mikroschmiede. Ich muss die Nadel an einer bestimmten Stelle abschneiden, um eine Haltepipette der richtigen Größe zu erhalten. Ich erhitze die Glasperle, senke die Nadel ab, sodass sie anschmilzt, und nun ist sie abgebrochen.Ich schiebe das zur Seite. Sie sehen, die abgebrochene Nadel ist perfekt. Jetzt fahre ich hier hinunter und erhöhe die Hitze.Jetzt wird die Glasrolle rot, sie wird schmelzen, schieben Sie die Glasrolle, und sie beschreibt eine Kurve. Das ist genug. Ich nehme sie heraus.Sie sehen, dann führe ich die Nadel ein. Wir haben die Haltepipette gerade in diesen Kopf eingesetzt. Nun setzen Sie sie wieder zurück ins Mikroskop ein.Mikropipette, Kapillare und I mit Quecksilber gefüllt. Ich habe es in diese Spitze geladen. Quecksilber füllt diese Kapillare hier mit Quecksilber.Es wird nach innen gesteckt. Setzen Sie die Nadel hier in diesen Kopf ein. Festdrehen, dann zurückziehen.Wenn Sie hier im Uhrzeigersinn drehen, wird das Quecksilber nach vorne geschoben, sodass Sie es sehen können. Und jetzt die Spitze in das Öl eintauchen. Sehen Sie? Nun bewege ich die Nadel nach unten, um die Sicht zu erhalten.Drücken Sie einige Quecksilbertropfen aus und saugen Sie etwas QVP auf. Das ist in Ordnung. Bewegen Sie es dann erneut nach oben.Ich gehe zur HCCB und bewege mich durch das Loch nach unten. Mein Kopf, ich gehe zu P, das ist die Maus-Pipette. Ich muss eine Kapillare vorbereiten, um sie hier einzuführen. Danke. Bereits. Gut.Stellen Sie also eine Kapillare her. In Ordnung. Und in dem Rohr. Ich bin ley.Ich komme aus der Schweiz und habe diese Arbeit vor einem Jahr begonnen, als ich in K'S Labor kam und mit dem Erlernen der Kerntransfer-Technik begann. Es ist wirklich ein großartiger Ort hier und es ist eine Freude, hier zu arbeiten. Natürlich handelt es sich bei diesem Experiment um eine sehr komplexe Aufgabe, bei der zahlreiche Probleme auftreten können.Wenn Sie beginnen, können daher Probleme auftreten, wie beispielsweise das Lyse vieler Zellen während der Keimbildung oder während des Transfers. Oder Sie stellen fest, dass die Zellen trotz erfolgreichem Transfer nicht weiterentwickeln. Es kann immer zahlreiche Gründe dafür geben.Ich meine, man kann mit dem Kultursystem aller Stellen beginnen. Man benötigt also immer einige Kontrollen wie Teile der genetischen Kontrolle oder befruchtete Eizellen, um das Kultursystem und die Inkubatoren zu testen. Außerdem muss man auch die Fähigkeiten im Umgang mit dem Mikroskop verbessern.Es erfordert also viel Übung, bis Sie die Seite zuverlässig aufblasen und anschließend zurückübertragen können. Dies ist lediglich eine Frage der Übung, und es wird einige Wochen oder Monate dauern, bis Sie darin geübt sind. Ansonsten ist das Verfahren bereit für umfangreiche Experimente.Daher ist es ratsam, dafür einen ganzen Tag einzuplanen. Etwas schwierig am Anfang ist außerdem das Pipettieren an der Maus. Es gilt, keine Blasen zu erzeugen, die Handhabung gut unter Kontrolle zu haben und den Überblick nicht zu verlieren, da man insbesondere einen Klon beschädigen kann, besonders weil die äußere Schicht, die sogenannte Lucita, offen ist. Tatsächlich kann es passieren, dass man beim Mundpipettieren den Klon beschädigt und dieser dann aus der Sonar-Lucita austritt.Daher muss man auch darauf achten, kein Öl in dem Mundrohr zu haben. Nicht zu stark saugen und nicht zu stark blasen, doch diese Fähigkeit wird relativ leicht erworben.

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