Name: Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Lernen Sie die SCNT-Methode zur Erzeugung transgener Mäuse mit spezifischen T-Zell-Rezeptoren gegen Toxoplasma gondii. Diese Technik ermöglicht schnelle Modellgenerierung für Immunologie und Infektionsforschung.

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Die Autoren sind dankbar, H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao und G. Yap für fruchtbare Diskussionen und Reagenzien. Wir sind dankbar, J. Dausman, R. Flannery, und J. Jackson für die Unterstützung bei der Verwaltung der Maus Kolonie. Wir sind dankbar, P. Wisniewski für FACSorting. EMF wurde vom Human Frontier Science Program unterstützt. RJ wurde von National Institute of Health gewährt RO1-HD045022 und R37-CA084198 unterstützt. HLP wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health unterstützt.

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolation von Spenderzellen Bevor spezifischen T-oder B-Zellen als Spenderzellen verwendet werden kann, um transnuclear Mausmodellen zu erzeugen, brauchen Mäuse mit einem Pathogen infiziert von Interesse sein oder immunisiert mit einem Antigen von Interesse. Da wir CD8 +-Zellen spezifisch für Toxoplasma gondii verwendet haben, wird das folgende Protokoll beschreibt die Erzeugung und Isolierung dieser Zellen und muss je nach persönlichem Interesse angepasst werden. <ol><li> Zysten von einer Maus Hirnhomogenat (ca. 40) abgeleitet werden intraperitoneal in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) Mäusen, die Trennung der beiden H-2 b und H-2 d restringierte CD8 + T-Zellen ermöglicht injiziert. </li><li> Auf dem Höhepunkt der Immunantwort, wird die infizierte Maus eingeschläfert, der Milz isoliert und in eine Schale mit 6 ml roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer. </li><li> Mit dem mattierten Seiten von zwei Deckgläser, ist die Milz sorgfältig geschliffen und inkubiert in der RBC-Lyse-Puffer für 5 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 14 ml PBS, filtern die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in einen 50 ml Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300g. </li><li> Überstand entfernen, Zellpellet in 1 ml PBS und Überführung in eine 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 300g und Überstand danach. </li><li> Zellpellet in 50 ul PBS, fügen fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf den jeweiligen Zelltyp von Interesse (zB CD3, B220, CD8 und CD4) zu identifizieren, und fluoreszenzmarkierten MHC-I-Tetramer (MHC-II-Tetramer für CD4 T-Zellen) geladen mit dem Peptid von Interesse für die Zell-Suspension und Inkubation für 30 min bei 4 ° C. </li><li> 1 ml PBS, Zentrifuge für 5 min bei 300 g, Pellet in 3 ml PBS, und filtern Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in ein Rohr. </li><li> Führen FACSorting, indem Sie die Tore stringent (Abbildung 1B). </li></ol> 2. Somatic Cell Nuclear Transfer Es gibt ein paar Protokolle für Somatic Cell Nuclear Transfer. Die hier beschriebene nutzt Eizellen in der Metaphase-II festgenommen und die Hemmung der zweiten Reifeteilung mit Cytochalasin B. Deshalb Spenderzellen benötigt, die in G0/G1 Phase. <ol><li> Vorbereitung von Oozyten <ol><li> Weibliche Mäuse von BDF1 Hintergrund sind intraperitoneal mit 5IU PMS pro Maus von 17.00 bis 07.00 Uhr injiziert. </li><li> Etwa 47 Stunden später wird jeder Maus intraperitoneal mit 5IU HCG injiziert. </li><li> Bereiten Sie eine Kulturschale (KSOM-AA Tropfen unter Öl) für die Eizellen noch am selben Tag wie der hCG-Injektion und legen Sie sie in einen Inkubator 37 ° C, 5% CO 2. Auch bereiten sich die Nadeln, die für SCNT (7μm für Enukleation und 4 oder 5 um für Kerntransfer von Lymphozytenkerne), indem Sie sie mit Quecksilber. </li><li> Euthanize Mäusen und isolieren Eileiter über 13h nach HCG (ca. 8 Uhr). Sammeln Sie die Eileiter in 1-2 Tropfen HCZB. </li><li> One-by-one bewegen Sie den Eileiter in einen Tropfen mit M2 w / Hyaluronidase. Nick den Eileiter vorsichtig mit einem ForceP und bewegen Sie die Oozyten-Cumulus-Komplex in der Drop. Nachdem alle Oozyten-Cumulus-Komplexe isoliert worden sind, die Schale ist bei 37 ° C. </li><li> Nach 2-5 min (die genaue Zeit hängt von der Partie Hyaluronidase) sammeln die Oozyten, in HCZB und Platte sie in KSOM-AA Tropfen waschen. </li></ol></li><li> Enukleation der Oozyten <ol><li> Verwenden Sie den Deckel einer Petrischale, die SCNT Platte vorbereiten. Richten Sie das Mikroskop und der Mikromanipulator. </li><li> Waschen Sie die Enukleation Nadel (7 um) in PVP vor dem Start mit Enukleation. </li><li> Für Enukleation, statt eine Gruppe von Oozyten (10-30) in einen Tropfen HZCB mit Cytochalasin B (5 ug / mL). Während der Inkubation (min. 5 min) Line-Up der Eizellen horizontal. </li><li> Nehmen Sie eine Eizelle und stellen Sie ihn vor der Holding Nadel. Fix die Eizelle nicht die Haltung Nadel durch Anlegen eines Vakuums. Mit der Enukleation Nadel, drehen Sie die Eizelle bis zum Chromosom-Spindel-Komplex (CSC, die oft als "Kern") ist in der 3-Uhr Position. </li><li> Mit Piezo-Puls dringt der Zona pellucida sorgfältig ohne Beschädigung der Eizelle. Legen Sie die Öffnung der Nadel neben der Metaphase-II Spindel und Vakuum anlegen. Der "Kern" sollte langsam in die Nadel zu bewegen, und die Membran sollte sich Dichtung, wenn es vollständig entfernt wird. </li><li> Übertragen Sie die entkernte Eizellen zurück in die KSOM-AA Tropfen, und waschen Sie sie mehrere Male. Wiederholen Sie die eKeimbildung Schritte mit einer neuen Gruppe von Oozyten. Fort, bis alle Eier entkernt werden oder bis zu 11AM. </li></ol></li><li> Nuclear Transfer <ol><li> Für den Kerntransfer, Austausch der Enukleation Nadel (7 um) mit einem Kerntransfer Nadel (4 oder 5 um) und waschen Sie es mit PVP. </li><li> Legen Sie Ihre Zellen von Interesse (zB CD8 + T-Zellen) in einen Tropfen mit PVP, gut mischen und Inkubation für mindestens 10 min. </li><li> Legen Sie eine Gruppe von entkernte Eizellen (10-30) in einen Tropfen HCZB mit Cytochalasin B (2,5 pg / mL). Während der Inkubation (min. 5 min) Line-Up Eizellen horizontal mit dem Kerntransfer Nadel. </li><li> Pick-up ein Donor-Zelle aus dem PVP-Zell-Suspension und saugen es in-and-out, bis die äußere Membran hat sich (Fragmente der Membran und Cytosol sichtbar sein soll) gebrochen. Bei Bedarf kann ein Piezo-Puls angewendet werden können. Einmal im Zellkern isoliert worden ist, verschieben Sie sie ein wenig in die Nadel, und weiterhin abholen Kerne bis 10-30 haben. </li><li> Bewegen Sie die Tropfen mit den ausgerichteten entkernte Eizellen. Fix eine Eizelle mit dem Betrieb Nadel durch Anlegen von Vakuum. Setzen Sie den Kerntransfer Nadel (die Kerne sollten weg von der Öffnung) angrenzend an die Zona pellucida und gelten Piezo-Puls, bis die Nadel durch die Zona pellucida gegangen ist. Vorsichtig bewegen einen Kern an der Spitze der Nadel, die Nadel in die Eizelle, bis die Spitze der Nadel 2 / 3 im Inneren. Tragen Sie eine kleine Unterdruck, so dass ein wenig von der Eizelle Membran in die Nadel. </li><li> Der nächste Schritt ist sehr kritisch, da es das einzige Mal, wenn die Eizelle ist eigentlich "offen". Tragen Sie einen einzigen Impuls von Piezo, drücken Sie den Kern aus der Nadel durch die Anwendung von Überdruck, vorsichtig wieder die Nadel so, dass die Spitze ist ca. 1 / 3 in die Eizelle, und wenden Sie dann Unterdruck und weiter ziehen Sie die Nadel Siegel der Eizelle. Wiederholen Sie diesen Schritt mit jeder Eizelle. </li><li> Nachdem alle Eizellen von einer Gruppe einen Kern erhalten haben, werden sie gewaschen und in KSOM-AA Medien kultiviert. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Eizellen. </li><li> Nach der letzten Gruppe hat Kulturen in KSOM-AA wurde für mindestens 30 min, sind die SCNT-Embryonen in Tropfen Ca-freien Aktivierungs-haltigen Medien SrCl2 übertragen. </li><li> Nach 6 Stunden der Aktivierung wird die Menge von Pseudo-Vorkerne (PPN)-positive SCNT-Embryonen bestimmt. Die Embryonen werden dann gewaschen und kultiviert, in KSOM-AA Tropfen für weitere 3,5 Tage, bis sie das Blastozysten-Stadium erreicht haben. </li><li> Drogen oder Chemikalien der Wahl (wie Trichostatin A) kann die Aktivierung und Kulturmedien zugesetzt werden. </li></ol></li></ol> 3.Derivation von embryonalen Stammzellen Die SCNT-Blastozysten kann entweder übertragen sie in pseudo-schwangere Frauen (auch als direkte oder Ein-Schritt-Klonen genannt) oder zur Ableitung von embryonalen Stammzellen (auch als indirekte oder Zwei-Schritt-Klonen genannt) werden. Da es viel effizienter, ES-Zellen zu erzeugen, wählen wir die Zwei-Schritt-Verfahren. Im Falle der Wissenschaftler in direkter Klonen interessiert ist, kann der Blastozysten direkt in pseudo-schwangere Frauen übertragen werden, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Es gibt viele Protokolle beschreiben die Gewinnung von embryonalen Stammzellen. Die hier beschriebene ist eine Standard-Technik, die Feeder-Zellen und fetalem Kälberserum verwendet. <ol><li> Der zweite Tag nach dem Kerntransfer, bereiten Sie einen 96-U-Well-Platte für ES-Zell-Ableitung. </li><li> 100 l Gelatine in jedes Well einer 96-U-Well-Platte, für ein Minimum von 10 min inkubieren, und entfernen Sie sie danach. </li><li> Thaw Feeder-Zellen und Zellen in ein entsprechendes Volumen von ESD Medium, zB Feeder-Zellen entspricht einer Fläche von 25 cm 2 werden in 10 mL ESD mittel-und 200 ul der Zellsuspension resuspendiert wird in jede der Gelatine-behandelten hinzugefügt. </li><li> Legen Sie die Platte in einen Inkubator und Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Nach 3,5 Tagen sollte die Embryonen im Blastozysten-Stadium sein. </li><li> Bereiten Sie eine sterile bakterielle Gericht durch Plattieren ein paar Tropfen ES-Zell-Medium und sauren thyrode. </li><li> Die Blastozysten werden zunächst aus der KSOM-AA Tropfen zu Tropfen mit normalem ES-Zell-Medium überführt und zweimal gewaschen. </li><li> Sorgfältig Transfer einer Gruppe von Blastozysten (5-10 Blastozysten) in einem Tropfen sauren thyrode und halten dort, bis der Zona pellucida gelöst hat. </li><li> Die Blastozysten werden dann in einen Tropfen mit ES-Medium überführt, zweimal, und dann in den Feeder-beschichtete 96-U-Well-Platte (eine Blastozyste zu einer gut). </li><li> Die Embryonen werden dann für 5-7 Tage in einem Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 kultiviert, ohne sie zu stören. Dies verleiht dem Embryo Zeit, um einettach der Feeder-Schicht, und ein Auswuchs bilden. </li><li> Bereiten 24-Well-Platten, durch Plattieren Anleger in ESD-Medium in jede Vertiefung, zB resuspendieren ein Äquivalent von 50 cm 2 Feeder in 12 mL ESD Medium, und fügen Sie 500 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die ESD Medium aus dem 96-U-Well-Platte mit den Embryonen, die jeweils gut waschen zweimal mit je 250 ul Hepes (oder PBS), mit 50 ul Trypsin und Inkubation für ca. 5 min bei 37 ° C. </li><li> Pipette nach oben und unten mehrere Male, bis Auswuchs hat außer in einem einzigen-Zell-Suspension, Transfer in eine 24-Well-Platte und bei 37 ° C, 5% CO 2. Gesunken </li><li> Wenn ESC Ableitung erfolgreich war, sollte ESC Kolonien werden nach 7-10 Tagen sichtbar. </li></ol> 4.Blastocyst Injektion Die Injektion von Blastozysten ist eine Routine-Technik für jede Art von transgenen Mausmodell zu generieren. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Injektion von Blastozysten und die anschließende Überführung in pseudo-schwangere Weibchen gut getimten werden muss. <ol><li> Prime weiblichen Mäusen mit PMS und HCG, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Nach HCG-Injektion setzen weibliche Mäuse mit männlichen Mäusen (eine weibliche und eine männliche Maus pro Käfig). </li><li> Am nächsten Tag überprüfen Frauen für Stecker. Dies wird als 0.5dpc (Tage post coitus) gezählt. </li><li> Befruchteten Embryonen werden dann aus dem Eileiter, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben, und kultiviert in KSOM-AA für weitere 3 Tage isoliert. </li><li> Bereiten Sie ES-Zellen am Tag der Blastozyste Injektion (3.5dpc). </li><li> Entfernen Sie Medium aus ES-Zellen, zweimal waschen mit Hepes (oder PBS), fügen Trypsin und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Resuspendieren trypsiniert Zellen mit ES-Medium, Platte in eine Schüssel, und inkubieren für 45-60 min bei 37 ° C, 5% CO 2 in Höhe von Feeder-Zellen (Feeder-Zellen schneller als ES-Zellen haften) zu reduzieren. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in ein Röhrchen und zentrifugieren für 5 min bei 1000rpm. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren Zellpellet in 500 ul ES Medium und speichere sie auf Eis, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie den Deckel eines sterilen bakteriellen Gericht durch Ausplattieren Tropfen mit PVP und HCZB. </li><li> Bereiten Sie eine 15 mu m Nadel durch Belastung mit Quecksilber, indem sie in Position und Waschen mit PVP. </li><li> Legen Sie eine Gruppe von Blastozysten (10-30 Blastozysten) in einen Tropfen mit HCZB, und fügen 5-50 ul ES-Zell-Suspension (abhängig von der Konzentration) in einen anderen Tropfen HCZB. </li><li> Pick-up-ES-Zellen (50-100 Zellen) mit der Injektionsnadel. </li><li> Gehen Sie zum Drop mit der Blastozysten. Richten Sie die Blastozysten horizontal und fix man mit der Holding Nadel durch Anlegen von Vakuum. </li><li> Mit der Injektionsnadel wiederum die Blastozyste, bis der inneren Zellmasse (ICM) ist an der 9-Uhr-Position. </li><li> Zeigen Sie mit der Injektionsnadel bei 3 Uhr, stellen Sie sicher, dass es keine ES-Zellen an der Spitze der Nadel, und wenden Piezo-Puls, bis die Injektionsnadel dringt durch die Zona pellucida und die Trophektoderm in die blastocoel. </li><li> Veröffentlichung ein paar ES-Zellen (5-15 Zellen), so dass die ES-Zellen der ICM-Stick. Fort, bis alle Blastozysten einer Gruppe mit ES-Zellen injiziert worden. </li><li> Nach einer Gruppe von Blastozysten fertig ist, waschen Sie sie zweimal in KSOM-AA und bewahren Sie sie in einen Tropfen mit KSOM-AA, bis alle Blastozysten injiziert werden. </li></ol> 5. Embryotransfer Die Übertragung der Embryonen in pseudo-schwangere Frauen stellt einen chirurgischen Eingriff, die sehr sorgfältig und nach den Richtlinien des Forschers Institut durchgeführt werden muss. <ol><li> Betäuben weiblichen Empfängermäuse, rasieren unteren rechten Quadranten und zu desinfizieren. </li><li> Mit einer Schere öffnen Sie die Haut, und trennen Sie das Bauchfell von der Haut. </li><li> Suchen Sie den Eierstock durch das Bauchfell (roter Punkt), und öffnen Sie das Bauchfell in der Nähe des Eierstocks. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig greifen die Eileiter und ziehen Sie die Gebärmutter. </li><li> Pick-up eine Gruppe von etwa 10 Blastozysten mit einer Kapillare verbunden mit einem Mund pipettieren. </li><li> Fix die Gebärmutter mit einem Pinzette, Punsch eine kleine ganze hinein mit einer kleinen Nadel, und legen Sie die Kapillare mit der Blastozysten in das Lumen des Uterus. </li><li> Nach vorsichtiger Embryonen in die Gebärmutter, und entfernen Sie Ihre Kapillare. </li><li> Drücken Sie die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle. </li><li> Suchen Sie die Kanten des Bauchfells und schließen Sie es mit ein paar Stichen. </li><li> Schließen Sie die Haut der Maus mit ein paar Klammern. </li><li> Für post-operativen Schmerzen, verwalten 5 ug Carprofen pro mg Körpergewicht. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Somatic cell nuclearÜbertragung von vordefinierten T-Zellen in B6CF1 Hintergrund. Absolute und relative Anzahl von Embryonen aus CD8 + T-Zellen und embryonale Stammzellen aus Blastozysten gewonnen SCNT generiert. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative durchflusszytometrische Analyse von chimären Mäusen mit SCNT embryonale Stammzellen injiziert. Tor und Anzahl (Prozent insgesamt CD8 + T-Zellen) zeigt das Vorhandensein von spezifischen CD8 + T-Zellen in chimären Mäusen.

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

Wir haben hier, dass SCNT verwendet werden, um transnuclear Mäuse von T-Zellen mit vordefinierten Spezifität generiert werden gezeigt. Obwohl hier nicht gezeigt, sollte die Technik auch nutzbar sein, um transnuclear Mäuse von B-Zellen mit vordefinierten Spezifität zu generieren. Eine wichtige Sache zu prüfen, ist die Belastung und das Geschlecht der Maus, die infiziert oder geimpft und verwendet werden, um T-oder B-Zellen von Interesse zu isolieren. Da T-und B-Zellen eine sehr geringe Umprogrammierung Effizienz im Allgemeinen haben, empfehlen wir die Verwendung F1-Hybriden gewünschten Haplotyp. Da der Donor-Zelle bestimmt auch das Geschlecht, empfehlen wir die Verwendung T-oder B-Zellen aus männlichen Mäusen. Dies bedeutet, dass nur männliche chimäre Mäuse würden die TCR-oder BCR durch die Keimbahn übertragen, mit männlichen Mäusen wird einfacher und schneller zu züchten. Zusammen genommen denken wir, dass epigenetische Reprogrammierung via SCNT stellt ein leistungsfähiges Tool, um eine neue Art von Maus-Modellen, die von großem Vorteil für die immunologische Feld erzeugt.

<table><tbody><tr><td>Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Serum schwangerer Stuten (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Choriongonadotropin des Menschen (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Typ IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Spezialmedium</td></tr><tr><td>Ca-freies Medium zur Aktivierung</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Spezialmedium</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100 mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>10%ige Lösung in HCZB herstellen und 0,1% AlbuMAX I hinzufügen</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5 mM = 1000x</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Haltenadel</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Injektions- und Transfernadeln</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Mundpipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>oder vergleichbares Instrument</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>oder vergleichbares Instrument</td></tr><tr><td>Wundclip-Applikator</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Wundclips</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Nähfaden</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15%</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200 mM = 100x</td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;l in 500 ml</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>MEK-Inhibitor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>Nur zur ES-Ableitung, zum ES-Medium hinzufügen (endgültige Konzentration 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

transnuclear mäuse mit vordefinierten t-zell-rezeptor spezifitäten gegen toxoplasma gondii via scnt erhalten

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphozyten, wie T-Zellen, eine genetische V (D) J-Rekombination, die an einen Rezeptor mit einer bestimmten Spezifität 1 zu erzeugen. Mäuse transgene für eine neu Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) haben ein unverzichtbares Werkzeug, um T-Zell-Entwicklung und Funktion untersucht worden. Allerdings sind solche TCRs in der Regel aus dem jeweiligen T-Zellen nach einer Langzeit-Kultur oft nach wiederholter Antigen-Stimulation, die unvermeidlich wählt für T-Zellen mit hoher Affinität isoliert. Zufällige genomische Integration der TCR α-und β-Kette und Ausdruck von Nicht-endogenen Promotoren können auf Veränderungen in Expression und Kinetik führen. Epigenetische Reprogrammierung über Kerntransfer somatischer Zellen bietet ein Werkzeug, um embryonale Stammzellen und Mäuse aus jeder Zelle von Interesse zu erzeugen. Folglich wird, wenn SCNT um T-Zellen des bekannten Spezifität angewendet wird, werden diese genetischen V (D) J Umlagerungen der SCNT-embryonalen Stammzellen (ESZ) und die Mäuse aus ihnen abgeleiteten übertragen, während epigenetische Markierungen zurückgesetzt werden. Wir haben gezeigt, dass T-Zellen mit vordefinierten Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii verwendet werden, um Maus-Modelle, die die spezifischen TCR Ausdruck von ihren endogenen Loci, ohne experimentell genetische Veränderung zu erzeugen. Die relative Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der solche transnuclear Modelle gewonnen werden können verspricht für den Bau anderer Krankheitsmodelle.

Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphozyten, wie beispielsweise T-Zellen, durchlaufen eine genetische V(D)J-Rekombination, um einen Rezeptor mit einer bestimmten Spezifität zu generieren1. Mäuse, die transgen für eine rearrangierte ...

Transgene Mäuse für antigenspezifische T-Zell-Rezeptoren waren unverzichtbar bei der Untersuchung der T-Zell-Entwicklung und -Funktion, um Mausmodelle mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor-Spezifitäten unter Verwendung der somatischen Zellkerntransfer- oder SCNT-Technik zu erzeugen. Eine Maus wird mit einem interessierenden Pathogen infiziert. T-Zellen werden aus der Maus isoliert und anschließend durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gereinigt.Die gereinigten T-Zellen werden anschließend für die somatische Zellkernübertragung verwendet. Nachdem die Embryonen das Blastozystenstadium erreicht haben, werden embryonale Stammzellen isoliert. Diese Zellen werden dann in Blastozysten injiziert, die anschließend in pseudoschwangere Mäuse transferiert werden.Die resultierenden Welpen weisen eine deutliche Zunahme der Population der interessierenden T-Zellen auf, was durch eine PAX-Analyse validiert werden kann. Hallo, mein Name ist Okta AK und ich bin Postdoktorand am White Institute for Biomedical Research. Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man somatische CLE-Transfer-Blastocysten-Injektionen sowie Embryotransfers durchführt.Der Hauptvorteil der somatischen Übertragung besteht darin, dass Mausmodelle erzeugt werden können, die ihren T-Zell-Rezeptor vom endogenen Locus exprimieren und somit unter Kontrolle des endogenen Promotors stehen, und dass solche Mausmodelle sehr schnell generiert werden können. Die somatische Flüssigübertragung kann als Werkzeug zur Erzeugung von Mausmodellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor- oder B-Zell-Rezeptor-Spezifitäten verwendet werden. Dies ist besonders interessant für Personen, die in Bereichen wie Autoimmunität, Infektionskrankheiten und Krebs forschen.Um T-Zellen zu isolieren, die spezifisch für einen Erreger wie Toxoplasma gondii sind, wird eine infizierte Maus am Höhepunkt der Immunantwort durch intraperitoneale Injektion euthanasiert, die Milz wird aus der euthanasierten Maus gewonnen, die Zellen werden homogenisiert, und die Spenderzellen werden anschließend mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und dem entsprechenden Tetramer inkubiert. Abschließend erfolgt eine FACS-Analyse, um erregerspezifische T-Zellen zu erhalten. Am Abend vor dem Enukleationsverfahren der Oozyten.Stellen Sie vier, fünf und sieben Mikrometer lange Piso-Injektionsnadeln her und laden Sie diese rückwärts mit Quecksilber, indem Sie eine Spritze verwenden. Am nächsten Tag beginnen Sie das Verfahren der somatischen Zellkerntransfer, indem Sie Oozyten sammeln und sie anschließend mit einer Mundpipette in Tropfen des K-S-O-M-A-A-Mediums in einer Petrischale überführen. Im Deckel der Petrischale.Bereiten Sie eine Platte zur Durchführung der somatischen Zellkerntransfer- oder SCNT-Technik vor, indem Sie etwa 10 Tropfen PVP, etwa 10 Tropfen HCZB mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Cyto B und etwa 10 Tropfen HCCB mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Cyto B hinzufügen. Diese Platte wird als S-C-N-T-A-Platte bezeichnet. Stellen Sie die S-C-N-T-A-Platte auf den Objekttisch eines umgekehrten zusammengesetzten Mikroskops.Platzieren Sie anschließend eine sieben Mikrometer große Enukleationsnadel in den Mikromanipulator und spülen Sie sie, indem Sie fünf bis zehn Mal Polyvinylpyrrolidon-Lösung aufziehen und verwerfen. Überführen Sie dann 10 bis 30 in Metaphase zwei arretierte Zellen aus der Petrischale in einen der Tropfen mit HCCB mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Cyto B auf der S-C-N-T-A-Platte und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Während der Inkubation richten Sie die Oozyten horizontal aus.Nachdem fünf Minuten vergangen sind, verwenden Sie die Enukleationsnadel, um ein Oozyt vor die Haltendenadel zu bringen. Mit einem Mikroinjektor erzeugen Sie ein Vakuum, um das Oozyt an der Mikropipetten-Haltendenadel zu fixieren.Danach die Oozyte mithilfe der Enukleationsnadel drehen, bis der Chromosomen-Spindelkomplex, der im Vergleich zum opaken Plasma hypertransparent erscheint, in der Drei-Uhr-Position steht. Ein Piezo-Impuls wird durch Betätigen des Pedals ausgelöst, um die Zona pellucida zu durchdringen. Ein Piezo-Impuls ist ein mechanischer Impuls, der sich longitudinal ausbreitet und die Spitze der Enukleationsnadel in Schwingung versetzt. Die Vibrationen der Nadelspitze erleichtern das Bohren durch die Zona pellucida.Nachdem die Zona pellucida durchdrungen ist, platzieren Sie die Öffnung der Nukleationsnadel neben dem Spindelapparat der Metaphase II und legen Sie Vakuum an. Der Chromosomen-Spindel-Komplex bewegt sich langsam in die Nadel hinein. Sobald die Nadel entfernt ist, sollte sich die Membran von selbst verschließen.Überführen Sie schließlich mithilfe einer Mundpipette die enukleierten Zellen zurück in die K-S-O-M-A-A-Tropfen. Waschen Sie sie anschließend, indem Sie sie mit derselben Pipette von Tropfen zu Tropfen von KSOM AA transferieren, um den nuklearen Transfer durchzuführen. Ersetzen Sie die sieben Mikrometer durchmessende Enukleationsnadel am Mikromanipulator durch eine vier bis fünf Mikrometer durchmessende Nukleartransfernadel. Waschen Sie die Nadel wie zuvor mit PVP.Platzieren Sie die zuvor isolierten CD8-positiven T-Zellen in einen Tropfen PVP auf der S-C-N-D-A-Platte. Gut mischen und mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Überführen Sie anschließend 10 bis 30 entkernte Zellen in einen Tropfen HCZB mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter.Cyto B auf der S ct.-Platte fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Inkubation die Zytomeren mit der Nukleustransfer-Nadel mithilfe der Injektionsnadel horizontal ausrichten.Ein donorfähiges CD8-positives Zell aus dem PVP-Medium aufnehmen und mehrmals ein- und auspipettieren, bis die äußere Membran aufgebrochen ist. Gegebenenfalls einen Piezo-Impuls anwenden; Fragmente der Membran und des Cytosols sollten sichtbar sein. Den Zellkern in die Pipettenspitze aufsaugen.Danach weiterhin Zellkerne aufnehmen, bis 10 bis 30 vorhanden sind. Anschließend zur Tropfen wechseln, der die ausgerichteten entkernten Zellen enthält. Das Vakuum anlegen, um eine Oozyte an der Halbenadel zu fixieren.Danach platzieren Sie die NU-Nukleus-Transfernadel neben der Zop-Lucita, wobei die Kerne von der Öffnung weg orientiert sind. Geben Sie einen Piezo-Impuls ab, bis die Nadel durch die Zop-Lucita gedrungen ist. Bewegen Sie mithilfe des Mikromanipulators vorsichtig einen Kern an die Nadelspitze.Stechen Sie die Nadel in die Oozyte, bis sich die Nadelspitze zu zwei Dritteln im Inneren befindet. Erzeugen Sie einen geringen Unterdruck, sodass sich ein kleiner Teil der Oozytenmembran in der Nadel befindet. Der nächste Schritt ist sehr kritisch.Da dies der einzige Zeitpunkt ist, zu dem die Oozyte tatsächlich geöffnet ist. Geben Sie einen einzelnen ZO-Impuls ab. Anschließend wenden Sie positiven Druck an, um den Zellkern aus der Nadel herauszudrücken.Ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück, sodass sich die Spitze etwa ein Drittel in die Oozyte hineinbefindet, und erzeugen Sie anschließend Unterdruck, während Sie die Nadel weiter zurückziehen. Um die Oozyte abzudichten. Wiederholen Sie diesen Schritt mit jeder Oozyte.Nachdem alle Oozyten einen Zellkern erhalten haben, überführen Sie sie in die Petrischale und waschen Sie sie, indem Sie sie von Tropfen zu Tropfen des KS OM AA-Mediums transferieren. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten. Nach der Inkubation überführen Sie die SCN-T-Embryonen in Tropfen eines kalziumfreien Aktivierungsmediums, das Strontiumchlorid enthält. Strontiumchlorid aktiviert das Oozyt, indem es Kalziumoszillationen induziert, die ähnlich wie während der Befruchtung auftreten würden.Sechs Stunden inkubieren. Falls gewünscht, TSA, einen unspezifischen Inhibitor der histonenden Diacetylasen, dem Aktivierungsmedium hinzufügen, um die Effizienz nach der Aktivierung zu verbessern. Untersuchen Sie die Embryonen unter dem inversen Mikroskop, um die Anzahl der Pseudopronuklei oder PPN-positiven SCNT-Embryonen zu bestimmen. Die PPN können anhand ihres Erscheinungsbildes identifiziert werden.Sie sehen aus wie Eier. Spülen und kultivieren Sie sie mit der „Sunny-side-up“-Methode. Die Embryonen und K-S-O-M-A-A-Tropfen werden für dreieinhalb Tage bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis sie das Blastozystenstadium erreicht haben.Am Anfang sollten Sie darauf achten, die Verfahren, die wir Ihnen soeben zur Keimbildung und zum nuklearen Transfer in den NU-Zellen gezeigt haben, korrekt durchzuführen. Sobald Sie diese Techniken beherrschen, lassen sich die folgenden Verfahren leichter bewältigen. Die hier verwendeten embryonalen Stammzellen oder ES-Zellen wurden mit Standardmethoden gewonnen.Diese sollten am Tag der blastunterstützten Injektion, dreieinhalb Tage nach dem Koitus, vorbereitet werden. Bereiten Sie den Deckel einer sterilen Bakterienschale vor, indem Sie Tropfen, die PVP und HCZP enthalten, auftragen. Bereiten Sie anschließend eine 15-Mikrometer-Injektionsnadel für den Piso-Puls wie zuvor beschrieben vor.Als Nächstes platzieren Sie die Injektionsnadel im Mikromanipulator und spülen sie mit PVP-Transfer. Führen Sie 10 bis 30 Blast-Unterstützungen in einen Tropfen HCZB durch. Anschließend geben Sie fünf bis 50 Mikroliter der ESL-Suspension in einen weiteren Tropfen HCZB.Es sollten genügend ES-Zellen vorhanden sein, damit sie leicht aufgenommen werden können, sie dürfen jedoch nicht zu dicht beieinander liegen. Danach 30 bis 100 ES-Zellen mit der Injektionsnadel aufnehmen. Zur Tropfen mit dem Blast-Assist bewegen.Richten Sie die Blastozystenhilfe horizontal aus und befestigen Sie sie mit der Halbenadel, indem Sie Vakuum anlegen. Drehen Sie die Blastozystenhilfe mit der Injektionsnadel, bis die innere Zellmasse auf neun Uhr steht. Positionieren Sie die Injektionsnadel auf drei Uhr.Stellen Sie sicher, dass sich keine ES-Zellen an der Nadelspitze befinden, und geben Sie einen Piso-Puls ab, bis die Injektionsnadel durch die Zop-Lucita und die Trifecta in das Blastische Siegel eindringt. Setzen Sie fünf bis 15 ES-Zellen frei, damit sie an der innere Zellmasse haften. Setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Blast-Assists nach Abschluss der Injektionen injiziert wurden.Zweimal in K-S-O-M-A-A waschen und anschließend zum chirurgischen Embryotransfer in pseudo-gravide Weibchen fortfahren; das anästhesierte pseudo-gravide weibliche Empfängermäuschen im Operationsbereich platzieren. Mit einem elektrischen Rasierer die Haare aus dem rechten unteren Quadranten entfernen. Den Bereich unter einem Stereomikroskop mit einer jodhaltigen Lösung und 70 %igem Ethanol desinfizieren.Öffnen Sie die Haut mit einer Schere und legen Sie dann die geschlossene Schere zwischen Haut und Peritoneum. Öffnen Sie die Schere, um das Peritoneum von der Haut zu lösen. Lokalisieren Sie den Eierstock durch das Peritoneum, der als roter Fleck sichtbar sein sollte. Öffnen Sie anschließend mit der Schere das Peritoneum in diesem Bereich.Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig den UCT oder das umgebende Fettgewebe zu greifen, und ziehen Sie die Gebärmutter mit einer an eine Mundpipette angeschlossenen Kapillare heraus. Nehmen Sie eine Gruppe von etwa 10 Blastozysten auf, wobei Sie den Eileiter und die Gebärmutter mit der Pinzette festhalten. Verwenden Sie eine Nadel, um ein kleines Loch in die Gebärmutter zu stechen.Danach die Kapillare mit der Blastunterstützung in das Lumen der Gebärmutter einführen und die Embryonen freisetzen. Die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle schieben. Die Ränder des Peritoneums lokalisieren und mit einigen Stichen verschließen.Schließen Sie die Haut des Mäuses mit einigen Klammern. Verabreichen Sie Schmerzmittel subkutan. Anschließend bringen Sie die Maus unter einer Wärmelampe in ihren Käfig zurück.Überwachen Sie die Atmung der Maus, bis sie aufwacht. Nach Enukleation und somatischer Zellkerntransfer. Etwa 70 % der Embryonen waren positiv für Pseudopronuklei.Wie in dieser Abbildung gezeigt, hatte die Behandlung mit TSA entweder sechs oder zehn Stunden lang keinen Effekt. Nach dreieinhalb Tagen in Kultur entwickelten sich fünf bis zehn % der Embryonen zu Blastozysten.Auch hier hatte die Zugabe von TSA keinen Einfluss auf die Rate der Entwicklung von Blastozysten-assistierten Embryonen. Die SCNT-Blastozysten-assistierten Embryonen wurden anschließend zur Ableitung embryonaler Stammzellen verwendet. TSA verbesserte signifikant die Rate, mit der ESL-Zellen aus blastozysten-assistierten Embryonen abgeleitet wurden.Die S-C-N-T-E-S-Zellen werden zur Erzeugung chimärer Mäuse verwendet. Aus diesen Mäusen wird Blut entnommen und mittels FACS-Analyse auf das Vorhandensein spezifischer T-Zellen untersucht, wie hier gezeigt. Wenn das Blut mit einem Anti-CD4-Antikörper und einem spezifischen Tetramer gefärbt wird, kann eine doppelt positive Population identifiziert werden.Was darauf hinweist, dass die für die SCNT verwendete Donorzelle die korrekte Spezifität aufwies. Ich habe Ihnen soeben gezeigt, wie man eine somatische Zell-LU-Übertragung, Blastomere-Injektionen und eine Embryotransfer durchführt. Der wichtigste zu berücksichtigende Punkt ist die Reinheit Ihrer T-Zellen oder B-Zellen.Nachdem Sie gelernt haben, wie man eine somatische Zellkernübertragung durchführt und Ihre Embryonen entweder das Blastozystenstadium erreicht haben, können Sie wählen, ob Sie sie direkt in pseudoschwangere Weibchen transferieren oder ob Sie sie zur Ableitung embryonaler Stammzellen verwenden und daraus chimäre Mäuse erzeugen.

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