Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Mäuse, die für antigenspezifische T-Zell-Rezeptoren transgenisiert sind, waren bei der Erforschung der Entwicklung und Funktion von T-Zellen unverzichtbar, um Mausmodelle mit vordefinierten T-Zell-Rezeptorspezifitäten mittels somatischem Zellkerntransfer oder SCNT zu generieren. Eine Maus ist mit einem Krankheitserreger von Interesse infiziert. T-Zellen werden aus der Maus isoliert und dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gereinigt.

Die gereinigten T-Zellen werden dann für den Kerntransfer der somatischen Zellen verwendet. Nachdem die Embryonen das Blastenstadium erreicht haben, werden embryonale Stammzellen isoliert. Diese Zellen werden dann in den Blast-Assist injiziert, der dann auf pseudoschwangere Mäuse übertragen wird.

Die resultierenden Welpen exprimieren einen ausgeprägten Anstieg der interessierenden T-Zellpopulation, was durch PAX-Analyse validiert werden kann. Hallo, mein Name ist Okta AK und ich bin Postoc hier am White Institute for Biomedical Research. Heute zeige ich Ihnen, wie Sie somatische CLE-Transfer-Blast-Assist-Injektionen sowie EMBR-Transfers durchführen.

Der Hauptvorteil des somatischen Transfers besteht darin, dass Mausmodelle generiert werden können, die ihren T-Zell-Rezeptor aus dem endogenen Locus exprimieren und somit unter Kontrolle des endogenen Promotors und dass Mausmodelle sehr schnell generiert werden können. Der somatische Send-Liquid-Transfer kann als Werkzeug zur Generierung von Mausmodellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor- oder B-Zell-Rezeptor-Spezifitäten verwendet werden. Dies ist von besonderem Interesse für Menschen, die in diesem Bereich arbeiten, wie z. B. Autoimmunität, Infektionskrankheiten und Krebs.

Um T-Zellen zu isolieren, die spezifisch für einen Krankheitserreger wie Toxoplasma Gandhi sind, der durch intraperitoneale Injektion auf dem Höhepunkt der Immunantwort infiziert ist, wird die Milz aus der euthanasierten Maus isoliert und homogenisierte Spenderzellen werden dann isoliert und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und dem entsprechenden Tetramer inkubiert. Schließlich wird eine Faktensortierung durchgeführt, um erregerspezifische T-Zellen zu erhalten. Am Abend vor der Enukleation der Eizelle.

Bereiten Sie vier-, fünf- und sieben-Mikrometer-Piso-Injektionsnadeln mit einer Spritze vor, um sie retrograd mit Quecksilber zu beladen. Am nächsten Tag beginnen Sie das Protokoll für den Kerntransfer somatischer Zellen, indem Sie Eizellen sammeln und sie dann mit einer Mundpipette in Tropfen K-S-O-M-A-A-Medium in einer Petrischale übertragen. Im Deckel der Petrischale.

Bereiten Sie das Aat für die Durchführung des somatischen Zellkerntransfers oder SCNT vor, indem Sie etwa 10 Tropfen PVP zugeben. Etwa 10 Tropfen HCZB mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Cyto B und etwa 10 Tropfen HCCB mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Cyto B. Diese Platte wird als S-C-N-T-A-Platte bezeichnet. Platzieren Sie die S-C-N-T-A-Platte auf dem Tisch eines inversen Verbundmikroskops.

Legen Sie dann eine sieben Mikrometer große Enukleationsnadel in den Mikromanipulator und waschen Sie sie, indem Sie sie fünf- bis zehnmal in die verworfene PVP-Lösung zurückziehen. Übertragen Sie dann 10 bis 30 metaphasengebundene zwei fixierte Zyten aus der Petrischale in einen der Tropfen HCCB mit fünf Mikrogramm pro Milliliter. Cyto B auf der S-C-N-T-A-Platte während der Inkubation fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, die Eizellen horizontal ausrichten.

Nachdem fünf Minuten vergangen sind. Verwenden Sie die Enukleationsnadel, um eine Eizelle vor die Haltenadel zu platzieren. Wenden Sie mit einem Mikroinjektor ein Vakuum an, um die Eizelle an der Haltenadel der Mikropipette zu fixieren.

Drehen Sie dann mit der Enukleationsnadel die Eizelle, bis sich der Chromosomenspindelkomplex, der im Vergleich zum Operationsplasma hypertransparent erscheint, in der Drei-Uhr-Position befindet, und initiieren Sie einen Pizo-Impuls, indem Sie das Pedal drücken, um in den Zno lucita einzudringen. Ein Pizo-Impuls ist ein mechanischer Impuls, der sich in Längsrichtung bewegt und die Spitze der Keimbildungsnadel in Schwingung versetzt. Die Vibrationen der Spitze helfen beim Bohren durch die Zop Lucita.

Sobald Sie die Zona Palita durchlaufen haben, platzieren Sie die Öffnung der Keimnadel neben der zweiten Spindel der Metaphase und legen Sie das Vakuum an. Der Chromosomenspindelkomplex bewegt sich langsam in die Nadel. Sobald die Nadel entfernt ist, sollte sich die Membran selbst verschließen.

Zum Schluss werden die enukleierten Zyten mit einer Mundpipette wieder in die K-S-O-M-A-A-Tropfen übertragen. Waschen Sie sie dann mit derselben Pipette, indem Sie sie von Tropfen zu Tropfen KSOM AA übertragen. Um den Kerntransfer durchzuführen, tauschen Sie die Sieben-Mikrometer-Enukleationsnadel auf dem Mikromanipulator gegen eine vier bis fünf Mikrometer große Kerntransfernadel aus. Waschen Sie die Nadel wie zuvor mit PVP.

Legen Sie die acht zuvor isolierten positiven T-Zellen in einen Tropfen PVP auf die S-C-N-D-A-Platte. Gut mischen und mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes überführen Sie 10 bis 30 ENUKLEIERTE Zyten in einen Tropfen HCZB mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter.

Cyto B auf dem S ct. Auf einer Platte fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Inkubation verwenden Sie die Kerntransfernadel, um die Zyten mit der Injektionsnadel horizontal auszurichten.

Nehmen Sie eine Spender-CD mit acht positiven Zellen aus dem PVP-Medium und aspirieren Sie sie ein und aus, bis die äußere Membran aufgebrochen ist. Bei Bedarf wird ein Pizo-Impuls aufgetragen, Fragmente der Membran und des Zytosols sollten sichtbar sein. Ziehe den Kern nach oben in die Nadel.

Nehmen Sie dann weiter Kerne auf, bis 10 bis 30 vorhanden sind. Gehen Sie als Nächstes zu dem Tropfen, der die ausgerichteten enukleierten Zyten enthält. Wenden Sie das Vakuum an, um eine Eizelle an der Haltenadel zu fixieren.

Platzieren Sie dann die NU-Kerntransfernadel neben dem Zop Lucita, wobei die Kerne von der Öffnung weg ausgerichtet sind. Pizo Pulse auftragen, bis die Nadel durch den Zop Lucita gegangen ist. Drücken Sie den Mikromanipulator, um einen Kern vorsichtig zur Spitze der Nadel zu bewegen.

Schiebe die Nadel in die Eizelle, bis die Spitze der Nadel zwei Drittel des Weges nach innen hat. Üben Sie einen kleinen Unterdruck aus, so dass sich ein wenig von der Eizellmembran in der Nadel befindet. Der nächste Schritt ist sehr kritisch.

Denn es ist die einzige Zeit, in der die Eizelle tatsächlich offen ist. Wenden Sie einen einzelnen ZO-Impuls an. Üben Sie dann einen positiven Druck aus, um den Kern aus der Nadel zu drücken.

Ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück, so dass sich die Spitze etwa ein Drittel des Weges in der Eizelle befindet, üben Sie dann Unterdruck aus und ziehen Sie die Nadel weiter zurück. Um die Eizelle zu versiegeln. Wiederholen Sie diesen Schritt mit jeder Eizelle.

Nachdem alle Eizellen einen Zellkern erhalten haben, überführen Sie sie in die Petrischale und waschen Sie sie, indem Sie sie von Tropfen zu Tropfen des KS OM AA-Mediums übertragen und mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation werden die SCN T-Embryonen in Tropfen mit kalziumfreiem Aktivierungsmedium überführt, das Strontiumchlorid enthält. Strontiumchlorid aktiviert die Eizelle, indem es die Kalziumschwingungen induziert, die in ähnlicher Weise während der Befruchtung auftreten würden.

Sechs Stunden lang inkubieren. Falls gewünscht, ADD TSA, das ein unspezifischer Inhibitor von Histon-Diacetyl-Assis ist, zum Aktivierungsmedium Um die Effizienz nach der Aktivierung zu verbessern, untersuchen Sie die Embryonen unter dem inversen Mikroskop, um die Anzahl der Pseudovorkerne oder PPN-positiven SCNT-Embryonen zu bestimmen. Die PPN können anhand ihres Aussehens identifiziert werden.

Sie sehen aus wie Eier. Sonnenseite nach oben Waschung und Kultur. Die Embryonen und K-S-O-M-A-A fallen dreieinhalb Tage lang auf 37 Grad Celsius, bis sie das Stadium der Blastenunterstützung erreicht haben.

Zu Beginn sollten Sie sich auf die korrekte Durchführung der Verfahren konzentrieren, die wir Ihnen gerade für die Keimbildung und den NU-Kerntransfer gezeigt haben. Sobald Sie diese Techniken beherrschen, sind die folgenden Verfahren einfacher zu handhaben: Die verwendeten embryonalen Stamm- oder ES-Zellen. Hier wurden unter Verwendung von Standardtechniken abgeleitet.

Diese sollten am Tag der blastengestützten Injektion, dreieinhalb Tage nach dem Kotus, zubereitet werden. Bereiten Sie den Deckel einer sterilen Bakterienschale vor, indem Sie PVP- und HCZP-haltige Tropfen anrichten. Bereiten Sie dann wie zuvor eine 15-Mikrometer-Injektionsnadel für den Piso-Puls vor.

Legen Sie dann die Injektionsnadel in den Mikromanipulator und waschen Sie sie mit PVP-Transfer. 10 bis 30 Stöße helfen in einen Tropfen HCZB. Geben Sie dann fünf bis 50 Mikroliter der ESL-Suspension in einen weiteren Tropfen HCZB.

Es sollten genügend ES-Zellen vorhanden sein, damit sie leicht aufgenommen werden können, aber nicht überfüllt sein sollten. Nehmen Sie anschließend 30 bis 100 ES-Zellen mit der Injektionsnadel auf. Bewege dich mit der Explosionshilfe zum Abgrund.

Richten Sie die Strahlhilfe horizontal aus und fixieren Sie eine mit der Haltenadel, indem Sie Vakuum anlegen. Verwenden Sie die Injektionsnadel, um die Strahlhilfe zu drehen, bis die innere Zellmasse neun Uhr anzeigt. Platzieren Sie die Injektionsnadel bei drei Uhr.

Stellen Sie sicher, dass sich keine ES-Zellen an der Spitze der Nadel befinden, und legen Sie einen Piso-Impuls an, bis die Injektionsnadel durch die Zop Lucita und die Trifecta in die Blastendichtung eindringt. Geben Sie fünf bis 15 ES-Zellen frei, damit sie an der inneren Zellmasse haften bleiben. Fahren Sie fort, bis alle Blast-Assists nach Beendigung der Injektionen injiziert wurden.

Zweimal in K-S-O-M-A-A gewaschen und mit dem chirurgischen Embryo fortfahren: Transfer in den Platz der pseudoschwangeren Weibchen und anästhesierte pseudoschwangere weibliche Empfängermaus im Operationsbereich. Entfernen Sie mit einem Elektrorasierer die Haare aus dem unteren rechten Quadranten. Desinfizieren Sie den Bereich mit einer Lösung auf Jodbasis und 70 % Ethanol unter einem Präpariermikroskop.

Verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu öffnen, und platzieren Sie dann eine geschlossene Schere zwischen Haut und Bauchfell und öffnen Sie sie, um das Bauchfell von der Haut zu trennen. Lokalisieren Sie den Eierstock durch das Bauchfell, das als roter Fleck erscheinen sollte. Öffne dann mit einer Schere das Bauchfell in dieser Region.

Greifen Sie mit einer Pinzette vorsichtig nach der UCT oder dem umgebenden Fett und ziehen Sie die Gebärmutter mit einer Kapillare heraus, die mit einer Mundpipette verbunden ist. Nehmen Sie eine Gruppe von etwa 10 Blast-Helfern auf, die den Eileiter und die Gebärmutter mit einer Pinzette halten. Stanzen Sie mit einer Nadel ein kleines Loch in die Gebärmutter.

Führen Sie dann die Kapillaren mit der Blast-Unterstützung in das Lumen der Gebärmutter ein und geben Sie sie frei. Schieben Sie die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle. Lokalisieren Sie die Ränder des Bauchfells und schließen Sie es mit ein paar Stichen.

Verschließen Sie die Haut der Maus mit ein paar Klammern. Verabreichen Sie Schmerzmittel subkutan. Setzen Sie die Maus dann wieder in ihren Käfig unter einer Heizlampe um.

Überwachen Sie die Atmung der Maus, bis sie aufwacht. Nach der Enukleation und dem Kerntransfer der somatischen Zellen. Etwa 70% der Embryonen waren positiv für Pseudovorkerne.

Wie in dieser Abbildung gezeigt. Die Behandlung mit TSA für sechs oder 10 Stunden hatte keine Wirkung. Nach dreieinhalb Tagen in Kultur entwickelten sich fünf bis 10 % der Embryonen zu Blast-Assists.

Auch hier hatte die Hinzufügung von TSA keinen Einfluss auf die Entwicklungsrate der Explosionsunterstützung. Die SCNT-Blast-Unterstützung wurde dann verwendet, um embryonale Stammzellen zu gewinnen. TSA verbesserte die Rate, mit der ESL von der Explosionsunterstützung abgeleitet wurden, erheblich.

Die S-C-N-T-E-S-Zellen werden zur Erzeugung chimärer Mäuse verwendet. Diesen Mäusen wird Blut entnommen und mit Hilfe der Faktenanalyse, wie hier gezeigt, auf das Vorhandensein spezifischer T-Zellen analysiert. Wenn Blut mit Anti-CDA-Antikörpern und spezifischem Tetramer gefärbt wird, kann eine doppelt positive Population identifiziert werden.

Dies deutet darauf hin, dass die für SCNT verwendete Spenderzelle die richtige Spezifität aufwies. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie somatische Zell-LU-Transfers, Blast-Assist-Injektionen und Embryotransfers durchführen. Der wichtigste Punkt, den Sie berücksichtigen sollten, ist die Reinheit Ihrer T-Zellen oder B-Zellen.

Sobald Sie gelernt haben, wie man einen somatischen Transfer durchführt und Ihre Embryonen entweder das Blast-Stadium erreichen, können Sie wählen, ob Sie sie direkt in pseudoschwangere Weibchen übertragen oder sie zur Gewinnung embryonaler Stammzellen und zur Erzeugung chimärer Mäuse verwenden möchten.