Large Volume (20L +) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

Hallo, ich bin David Walsh im Labor von Steven Hallam in der Abteilung für Mikrobiologie Immunologie an der University of Bridge Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem Sie große Mengen Meerwasser nach mikrobieller Biomasse filtern können. Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um die mikrobielle Vielfalt in der marinen Umwelt zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um das Filtergerät einzurichten, setzen Sie mit einer Pinzette einen GFD-Filter in das Vorfiltergehäuse ein. Ziehen Sie das Gehäuse mit der Hand locker fest.

Als Faustregel gilt, dass Sie das Gerät nicht zu fest anziehen sollten, da sonst das Gerät undicht wird. Sobald das Pumpen beginnt, setzen Sie die Ballonkappe wieder durch die Autoklavenkappe auf und befestigen Sie die Schläuche, indem Sie die internen Schläuche vorsichtig in das Auto einführen, ohne sie zu berühren. Führen Sie den Schlauch bei Bedarf mit einer Pinzette in das Auto.

Ziehen Sie dann die Kappe fest und führen Sie den externen Schlauch durch die Schlauchpumpe. Befestigen Sie die Vorfiltergehäuse an den Enden der beiden externen Rohre. Ziehen Sie die Verbindung mit einer Zange fest, um das Meerwasser zu filtern.

Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf eine Uhr ein, um sicherzustellen, dass das Wasser in die richtige Richtung gepumpt wird. Lassen Sie 500 Milliliter Wasser frei durch die Vorfiltereinheit in ein Ein-Liter-Becherglas fließen. Schalten Sie die Pumpe aus und befestigen Sie einen Stax-Filter an der männlichen Köderhalterung am freien Ende des Vorfilter-Setups.

Ziehen Sie das Vorfiltergehäuse mit der Hand fest an. Achten Sie auf Undichtigkeiten am Vorfiltergehäuse und an der Verbindung zwischen dem Vorfiltergehäuse und den Schläuchen, die zum Auto führen. Junge, wenn Undichtigkeiten auftreten, schalten Sie die Pumpe aus und lösen Sie das Vorfiltergehäuse entsprechend und ziehen Sie es wieder fest, schalten Sie die Pumpe wieder ein.

Sammeln Sie das Filtrat in Vier-Liter-Kolben. Sobald sie voll sind, leeren Sie die Flaschen in eine saubere Ballonflasche. Notieren Sie sich das Volumen, das durch jeden gesammelten Filter geleitet wird.

Filtrat kann weiterverarbeitet werden, wie z.B. die Filtration für Viren. Fahren Sie mit dem Filtern fort, bis kein Wasser mehr in den Ballons ist. Die üblichen Filtrationszeiten liegen zwischen vier und fünf Stunden pro 20-Liter-Auto.

Dies hängt jedoch stark von der Menge an Biomasse im Wasser ab. Sobald die Filtration abgeschlossen ist, schalten Sie die Pumpe aus und trennen Sie die Stax-Filter. Zum Speichern der Filter.

Scheiden Sie zunächst das restliche Wasser mit einer 30 bis 60 Milliliter Spritze aus. Geben Sie mit einer Pipette 1,8 Milliliter Lysepuffer in den Filter, wobei Sie etwa 200 Mikroliter Platz im Filter lassen. Für eine spätere Ausgabe der Reagenzien versiegeln Sie die Unter- und Oberseite des stex-Filters mit einem kleinen Stück Para-Folie und beschriften Sie die Filter mit einem Datum und einer Probenidentifikation.

Lagern Sie die Filter in einer vorbeschrifteten 50-Milliliter-Falcon-Tube bei minus 80 Grad Celsius. Nehmen Sie die Filter aus dem Gehäuse und legen Sie sie in beschriftete 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen mit zwei Millilitern Lysepuffer. Lagern Sie diese bei minus 80 Grad Celsius.

Für die abschließende Reinigung legen Sie den Schlauch, der sich im Auto befand, in einen Kolben mit 0,1 molare Salzsäure. Richten Sie den Schlauch, der zum Vierliterkolben führt, in das Originalauto. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie sie dreimal laufen, wobei der Durchfluss im Originalauto gesammelt wird.

Spülen Sie abschließend den Schlauch mit Autoklavenwasser ab. Jedes 20-Liter-Auto ergibt zwei Stax-Filter, die jeweils mikrobielle Biomasse im Größenbereich zwischen 0,22 und 2,7 Mikrometern aus etwa 10 Litern Meerwasser enthalten. Darüber hinaus wird Biomasse mit einer Größe von mehr als 2,7 Mikrometern gesammelt und auf die GFD-Vorfilter konzentriert.

Diese Filter und Vorfilter werden in Lysepuffer gelagert und sind bereit für die DNA-Extraktion. Wenn zusätzliche Verarbeitungsschritte unternommen werden, kann der Durchfluss von 0,2 Mikrometern nach unten konzentriert werden, um auch die Virusfraktion zu sammeln. Wir haben gerade eine peristaltische Pumpmethode für die großvolumige Filtration von planktonischer Biomasse mit einem Durchmesser von 0,22 Mikrometern bis 2,7 Mikrometern beschrieben.

Bei diesem Vorgang ist es wichtig, die Bänke und Pumpen nach Gebrauch mit einem feuchten Handtuch abzuwischen, um das verbleibende Salzwasser zu entfernen. Andernfalls können sie das Gerät korrodieren. Obwohl das Verfahren einfach ist, kann der Zeitaufwand je nach Konzentration von Biomasse oder Ablagerungen in der zu filtrierenden Probe erheblich sein.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.