Name: Large Volume (20L +) Filtration von Coastal Meerwasser Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Filtration großer Küstenmeerwasserproben zur Sammlung mikrobieller Biomasse. Diese Methode isoliert Partikel von 0,22μm bis 2,7μm für Studien zur mikrobiellen Diversität in marinen Ökosystemen.

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Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. DAW wurde durch Stipendien von NSERC, Killam und die TULA Stiftung finanziert Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.

<ol><li> Set up des Filtrationsapparatur <ol><li> Zum Einrichten der Filtrationsvorrichtung, mit Hilfe einer Pinzette zu einem Grad GF / D-Filter in den Vorfilter Wohneinheit Platz. Locker ziehen Sie die Gehäuse von Hand. Als Faustregel gilt, nicht zu fest anziehen, oder das Gerät, sobald die Pumpen beginnt undicht. </li><li> Ersetzen Sie den Glasballon Kappe mit dem autoklaviert Kappe und befestigt Schlauch durch vorsichtiges Einsetzen der inneren Schlauch in den Kanister ohne es zu berühren. Wenn nötig, mit Hilfe einer Pinzette, um den Schlauch in den Kanister zu führen. </li><li> Führen Sie das externe Schlauch durch die Schlauchpumpe. </li><li> Bringen Vorfilter Wohneinheiten bis zum Ende der beiden äußeren Rohre (dh 2 Einheiten pro Kanister). Ziehen Sie die Verbindung mit einer Zange. </li></ol></li><li> Filtration von Meerwasser <ol><li> Um die Filterung des Meerwassers, auf die Pumpe einschalten und die Strömungsgeschwindigkeit zu 1. Sehen Sie, um sicherzustellen, dass das Wasser wird in die richtige Richtung gepumpt. </li><li> Lassen Sie 500 ml Wasser frei fließen durch den Vorfilter-Einheit und in einem 1 L Becherglas. </li><li> Schalten Sie die Pumpe und befestigen Sie eine Sterivex Filter auf den männlichen Luer-Anschluss an das freie Ende des Vorfilter-Setup. Ziehen Sie die Vorfiltergehäuse eng mit der Hand. </li><li> Achten Sie bei der Vorfilter Gehäuse und an der Verbindung zwischen dem Vorfilter Gehäuse und die Schläuche, die den Ballon führt. Wenn Undichtigkeiten auftreten, schalten Sie die Pumpe aus und lösen Sie und ziehen Sie die Vorfiltergehäuse entsprechend. Schalten Sie die Pumpe wieder ein. </li><li> Das Filtrat in 4 L Flaschen. Sobald sie voll sind, leeren Sie den Kolben in ein sauberes Glasballon. Achten Sie darauf, die Lautstärke durch jeden Filter geleitet beachten. Gesammelte Filtrat weiter verarbeitet werden kann, wie Filtration auf Viren. </li><li> Weiter Filterung, bis kein Wasser in die Ballons übrig bleibt. Usual Filtrationszeiten Bereich zwischen 4-5 h / 20 L Kanister, allerdings hängt dies stark von der Menge der Biomasse im Wasser. </li><li> Nach Filtration beendet ist, schalten Sie die Pumpe aus und trennen Sie das Sterivex Filter. </li></ol></li><li> Lagerung von Filtern <ol><li> So speichern Sie die Filter, zuerst zu vertreiben restliche Wasser mit einem 30-60 ml Spritze. </li><li> Mit einer Pipette 1,8 ml Lysepuffer, um den Filter, halten ~ 200 ul des Raumes in den Filter für die spätere Zugabe von Reagenzien. </li><li> Verschließen Sie die untere und obere der Sterivex Filter mit einem kleinen Stück Parafilm, und beschriften Sie die Filter mit dem Datum und Identifizierung der Proben. </li><li> Bewahren Sie die Filter in einer pre-markierten 50 ml Falcon-Röhrchen bei -80 ° C </li><li> Entfernen Sie die Filter aus dem Gehäuse, und setzen Sie sie in beschriftete 50 ml Falcon-Röhrchen mit 2 ml Lysepuffer. Bewahren Sie diese bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Cleanup <ol><li> Für die endgültige Bereinigung, platzieren Sie den Schlauch im Inneren des Ballons wurde in einen Kolben mit 0,1 M HCl </li><li> Richten Sie die Schläuche, die zum 4L Kolben in die ursprüngliche Glasballon führen. </li><li> Schalten Sie die Pumpe und laufen bei 3, das Sammeln der Durchfluss durch laufen in der ursprünglichen Glasballon. </li><li> Schließlich spülen Sie den Schlauch mit Wasser autoklaviert. </li></ol></li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Das Ergebnis besteht aus zwei Sterivix Filter jeweils mikrobiellen Biomasse von etwa 10 L Meerwasser in der Größenordnung von 0,22 &amp;mgr; m und 2.7μm. Dies ist in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Darüber hinaus sammelt dieses Verfahren und konzentriert Biomasse größer als 2,7 um, auf der GF / D Vorfilter. Dies ist auch in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Wenn zusätzliche Verarbeitungsschritte übernommen werden, kann der 0,22 &amp;mgr; M Flow-Through nach unten konzentriert werden, um das virale Fraktion sowie zu sammeln.

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Es ist zwingend notwendig, um abwischen Bänke und Pumpen mit einem feuchten Tuch nach dem Gebrauch an alle verbliebenen Spuren von Salzwasser, die sonst korrodieren würden Geräte zu entfernen. Obwohl das Verfahren ist einfach, kann der Zeitbedarf werden umfangreiche abhängig von der Konzentration der Biomasse oder Verunreinigungen in der Probe herausgefiltert.

<table><tbody><tr><td>Peristaltikpumpe</td><td></td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>77913-20, 77200-62, 77200-04</td><td></td></tr><tr><td>Tygon LFL-Schlauch</td><td></td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>06429-24</td><td>Für Filtrationsapparatur</td></tr><tr><td>Schlauchschellen</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>0683204</td><td>Für Filtrationsapparatur</td></tr><tr><td>1/4&amp;#8221; x 3/16&amp;#8221; Rohradapter</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>31702-20</td><td>Für Filtrationsapparatur</td></tr><tr><td>Polypropylen-Vorfiltergehäuse</td><td></td><td>ADVANTEC</td><td>501200</td><td>Für Filtrationsapparatur</td></tr><tr><td>Metall-Luer-Verbinder (Schlauchende auf männlichen Luer-Lock)</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>31507-27</td><td>Für Filtrationsapparatur</td></tr><tr><td>2&amp;#8220; Magnete</td><td></td><td></td><td>Für Filtrationsapparatur</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwege-Flaschenverschlüsse</td><td></td><td></td><td></td><td>Für Filtrationsapparatur</td></tr><tr><td>GV 0,22 &amp;mu;m STERIVIX-Filter</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV01R5</td><td></td></tr><tr><td>47 mm Durchmesser, 2,7 &amp;mu;m GF/D-Filter</td><td></td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1823047</td><td></td></tr><tr><td>Lysispuffer</td><td> Reagenz</td><td></td><td></td><td>0,75 M Saccharose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3)</td></tr><tr><td>0,1 % HCl</td><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td>Zum Nachspülen nach der Filtration</td></tr><tr><td>autoklaviertes Wasser</td><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td>Zum Nachspülen nach der Filtration</td></tr></tbody></table>

large volume (20l +) filtration von coastal meerwasser proben

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

Der Workflow beginnt mit der Sammlung von der Küste Meeresgewässer für nachgeschaltete mikrobielle Gemeinschaft, Nährstoff-und Spurengasen analysiert. Für dieses Verfahren wurden Proben aus dem Deck der HMS John Strickland, die in Saanich Inlet gesammelt. Das Video dokumentiert großes Volumen (≥ 20 L) Filtration von mikrobieller Biomasse, die zwischen 0,22 &amp;mgr; m und 2.7μm im Durchmesser, aus der Wassersäule. Zwei 20L Proben können gleichzeitig gefiltert werden über ein einziges Aggregat mit vier rotierenden Köpfen ausgestattet. Die Filtration wird in das Feld, auf ausgedehnte Reisen gemacht, oder unmittelbar nach der Rückkehr für Tagesausflüge. Es ist wichtig, die Menge des Wassers, die durch jede Sterivex Filtereinheit aufnehmen. Um zu verhindern, Biofilmbildung zwischen Probenahme Reisen müssen alle Filteranlagen mit verdünnter HCl und VE-Wasser gespült werden und autoklaviert sofort nach Gebrauch. Dieser Vorgang dauert ca. 5 Stunden plus eine zusätzliche Stunde für aufzuräumen.

Das Video dokumentiert großes Volumen (≥ 20 L) Filtration von mikrobieller Biomasse, die zwischen 0,22 &amp;mgr; m und 2.7μm im Durchmesser, aus der Wassersäule.

Large Volume (20L +) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

Der Arbeitsablauf beginnt mit der Entnahme von küstennahem Meerwasser für nachfolgende Analysen der mikrobiellen Gemeinschaft, der Nährstoffe und der Spurengase. Für diese Methode ...

Hallo, ich bin David Walsh im Labor von Steven Hallam an der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der University of Bridge Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Filtration großer Mengen von Meerwasser zur Gewinnung mikrobieller Biomasse. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die mikrobielle Vielfalt im marinen Umfeld zu untersuchen.Beginnen wir. Um die Filtrationsvorrichtung aufzubauen, platzieren Sie mit einer Pinzette einen Filter der Güteklasse GFD in die Vorfiltreinheit. Ziehen Sie die Einheit per Hand locker an.Als Faustregel gilt: Nicht überdrehen, da sonst Leckagen auftreten können. Sobald das Pumpen beginnt, ersetzen Sie die Karaffenkappe durch die Autoklavenkappe und verbinden Sie den Schlauch, indem Sie den Innenschlauch vorsichtig in das Fahrzeug einführen, ohne es zu berühren. Falls nötig, verwenden Sie eine Pinzette, um den Schlauch in das Fahrzeug zu führen.Dann verschließen Sie die Kappe und führen Sie den externen Schlauch durch die peristaltische Pumpe. Befestigen Sie die Vorfiltergehäuse an beiden Enden der externen Schläuche. Ziehen Sie die Verbindungen mit einer Zange fest, um mit der Filtration des Meerwassers zu beginnen.Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Fließgeschwindigkeit auf eine Uhr ein, um sicherzustellen, dass Wasser in die richtige Richtung gepumpt wird. Lassen Sie 500 Milliliter Wasser frei durch die Vorfiltereinheit und in einen Ein-Liter-Becher fließen. Schalten Sie die Pumpe aus und befestigen Sie ein Stax-Filter am männlichen Luer-Anschluss am freien Ende der Vorfiltereinrichtung.Ziehen Sie das Vorfiltergehäuse mit der Hand fest. Achten Sie auf Leckagen am Vorfiltergehäuse und an der Verbindung zwischen dem Vorfiltergehäuse und dem Schlauch, der zum Fahrzeug führt. Falls Leckagen auftreten, schalten Sie die Pumpe aus, lockern Sie das Vorfiltergehäuse und ziehen es erneut entsprechend fest, und schalten Sie die Pumpe wieder ein.Sammeln Sie das Filtrat in Vier-Liter-Flaschen. Wenn diese voll sind, leeren Sie die Flaschen in einen sauberen Kanister. Achten Sie darauf, das Volumen zu notieren, das durch jeden gesammelten Filter hindurchgetreten ist.Das Filtrat kann weiterverarbeitet werden, beispielsweise durch Filtration zur Entfernung von Viren. Setzen Sie die Filtration fort, bis kein Wasser mehr in den Kolben verbleibt. Übliche Filtrationszeiten liegen zwischen vier und fünf Stunden pro 20-Liter-Kolben.Dies hängt jedoch stark von der Menge der Biomasse im Wasser ab. Sobald die Filtration abgeschlossen ist, schalten Sie die Pumpe aus und trennen Sie die Stax-Filter. Zum Aufbewahren der Filter.Drücken Sie zunächst mit einer 30 bis 60 Milliliter-Spritze das restliche Wasser aus. Geben Sie mithilfe einer Pipette 1,8 Milliliter Lysepuffer auf den Filter, wobei etwa 200 Mikroliter Platz im Filter verbleiben sollen. Versiegeln Sie zur späteren Zugabe von Reagenzien das untere und obere Ende des Stex-Filters mit einem kleinen Stück Parafilm und beschriften Sie die Filter mit Datum und Probenidentifikation.Bewahren Sie die Filter in einem vorbeschrifteten 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius auf. Entfernen Sie die Filter aus der Hülse und geben Sie sie in beschriftete 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, die zwei Milliliter Lysepuffer enthalten. Lagern Sie diese bei minus 80 Grad Celsius.Zur endgültigen Reinigung wird das Schlauchstück, das sich im Inneren des Autos befand, in einen Kolben mit 0,1-molarer Salzsäure gegeben. Das Schlauchende, das zum Vier-Liter-Kolben führt, wird in das ursprüngliche Auto geleitet. Die Pumpe wird eingeschaltet und drei Minuten lang laufen gelassen, wobei der Durchfluss im ursprünglichen Auto aufgefangen wird.Spülen Sie das Tubing abschließend mit Autoklavenwasser. Jeder 20-Liter-Wagen liefert zwei Stax-Filter, von denen jeder mikrobielle Biomasse im Größenbereich zwischen 0,22 und 2,7 Mikrometer aus etwa 10 Litern Meerwasser enthält. Zusätzlich wird Biomasse größer als 2,7 Mikrometer auf den GFD-Vorfiltern gesammelt und angereichert.Diese Filter und Vorfiltter werden in Puffer zur Zelllyse aufbewahrt und sind bereit für die DNA-Extraktion. Falls zusätzliche Verarbeitungsschritte durchgeführt werden, kann der Durchfluss durch den 0,2-Mikrometer-Filter konzentriert werden, um die virale Fraktion ebenso zu gewinnen. Soeben haben wir ein Verfahren mit peristaltischem Pumpen beschrieben, das die Filtration großer Volumina planktischer Biomasse ermöglicht, deren Größe zwischen 0,22 und 2,7 Mikrometern im Durchmesser liegt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Arbeitsflächen und Pumpen nach Gebrauch mit einem feuchten Tuch abzuwischen, um verbliebene Salzwasserreste zu entfernen. Andernfalls könnten sie die Ausrüstung korrodieren. Obwohl das Verfahren einfach ist, kann der zeitliche Aufwand je nach Konzentration der Biomasse oder Verunreinigungen in der zu filtrierenden Probe erheblich sein.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Video dokumentiert Methoden zur Erhebung Coastal Marine Wasserproben und deren Verarbeitung für verschiedene Downstream-Anwendungen einschließlich Biomasse-Konzentration, Aufreinigung von Nukleinsäuren, Zell-Hülle und Fülle, Nährstoff-und Spurengasen analysiert.

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Large Volume (20L +) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

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