Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Dieses Video wurde von Forschern der Warnell School of Forestry and Natural Resources der University of Georgia produziert. Der Zweck dieses Schulungsvideos besteht darin, detailliert zu beschreiben, wie unser LOB Lolly Pine pt, Gen Two CDNA, Microarray verarbeitet wird, wobei besonderes Augenmerk auf das Waschen und die Handhabung des Arrays gelegt wird, sowohl vor als auch nach der Hybridisierung. Im Allgemeinen folgen unsere Protokolle denen, die am Institute for Genomic Research Tiger und der Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, entwickelt wurden, wo unsere Arrays gedruckt werden.

Wir haben festgestellt, dass eine stringentere Verarbeitung von PT Gen 2 erforderlich ist, um ein Höchstmaß an Konsistenz in Bezug auf die Gleichmäßigkeit der Signalqualität und den geringen Hintergrund zu gewährleisten. Der erste Schritt ist eine Vorwäsche. Wir tun dies, weil unser Fleckenpuffer einen sehr hohen Salzgehalt enthält und diese Vorwäsche notwendig ist, um dieses Salz zu entfernen.

Die Objektträger werden in einen Objektträgerträger gelegt und 15 bis 20 Mal kräftig in eine auf 43 Grad vorgewärmte 0,2%ige SDS-Lösung getaucht. Nachdem die Objektträger in der SDS-Lösung gewaschen wurden, werden sie vorsichtig mit einer Pinzette in ein Copeland-Glas mit Prähybridisierungspuffer entnommen. Dieser Puffer enthält fünf XSSC 0,1 % SDS und 1 % BSA und wird ebenfalls auf 43 Grad erhitzt.

Das Copeland-Glas wird mit Parfum bedeckt und für eine Stunde in einen 43-Grad-Inkubator gestellt. Nach der Prähybridisierung werden die Objektträger auf einen Objektträgerträger des Mikroskops entnommen und nacheinander durch fünf Wechsel von deionisiertem Wasser verarbeitet, wobei bei jedem Wechsel 15 bis 20 Mal eingetaucht wird. Schließlich werden die Objektträger in Isopropanol eingelegt und fünf- bis sechsmal getaucht, bevor sie in einer Chip-M-Mate-Zentrifuge bis zum Trocknen zentrifugiert werden.

Nach der Zentrifugation werden die Objektträger mit Druckluft geblasen, die durch einen 0,2-Mikron-Filter geleitet wird. Die Rutschen werden dann mit Lifter-Slips überzogen, die ebenfalls mit Druckluft gereinigt wurden, und wir verwenden eine kleine Pipettenspitze, um den Lifter-Slip in die richtige Position zu bringen. Auf der Folie.

Nachdem die Lifter-Slips positioniert wurden, aber bevor der Hybridisierungspuffer hinzugefügt wird, fügen wir 20 Mikroliter 100 millimolare Dihi, drei Atol, in die Feuchtigkeitsvertiefungen an den Enden der Kammer hinzu. Jetzt sind wir bereit, die Ziel-CDNAs hinzuzufügen, die im Hybridisierungspuffer resuspendiert wurden. Die Pipettenspitze wird an den Rand des Lifterschiebers gelegt und der Objektträger und die Lösung werden langsam pipettiert.

Wir haben festgestellt, dass die Nutzung des Kapillareffekts zum Laden der Arrays die größte Konsistenz bietet und den Einbau unerwünschter Blasen stark reduziert. Nachdem das Zielmaterial zum Array hinzugefügt wurde, wird die Hybridisierungskammer zusammengebaut und mit Aluminiumfolie abgedeckt. Die Hybridisierungskammer wird dann in ein Schüttelwasserbad gestellt, wo sie über Nacht inkubiert wird, typischerweise 14 bis 16 Stunden.

Das Wasserbad ist auf 48 Grad und der Shaker auf 50 U/min eingestellt. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Verfahren ab dem Zeitpunkt der Zugabe der Hybridisierungslösung bei allen Waschvorgängen nach der Hybridisierung bei schwachem Licht durchgeführt werden, um eine Photooxidation zu verhindern. Am nächsten Tag werden die Objektträger aus der Hybridisierungskammer entnommen und in ein Copeland-Glas mit Waschlösung Nummer eins gegeben, das auf 53 Grad vorgewärmt wurde.

Die Objektträger werden etwa eine Minute lang im Copeland-Glas gelassen, bis die Lifter-Slips abfallen, woraufhin die Objektträger vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und in einen Objektträgerträger gelegt werden, um mit den Waschungen fortzufahren. Anschließend werden die Objektträger etwa 15 bis 20 Mal kräftig in einen zweiten Behälter getaucht, der ebenfalls Waschlösung Nummer eins bei 53 Grad enthält. Der Behälter wird dann mit Parfum bedeckt und in einen Inkubator-Luftschüttler gelegt, der auf 53 Grad und hundert U/min eingestellt ist.

Nach der 10-minütigen Inkubation und Waschlösung Nummer eins werden die Objektträger 15 bis 20 Mal kräftig in einen Behälter mit Waschlösung Nummer zwei getaucht, der sich bei Raumtemperatur im Behälter befindet. Diese wird mit Parafolie überzogen und für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur wieder auf einen Schüttler gelegt. Zum Schluss werden die Objektträger aus Waschlösung Nummer zwei entnommen und 15 bis 20 Mal kräftig in einen Behälter mit Waschlösung Nummer drei getaucht.

Die Objektträger werden dann in einen zweiten Behälter mit Waschlösung Nummer drei entnommen, der mit Perfil bedeckt ist, und erneut für 10 Minuten auf den Schüttler gelegt. Nach der letzten Wäsche zentrifugieren wir die Objektträger, bis sie vollständig getrocknet sind. Zu diesem Zweck setzen wir eine 15-mil-Falcon-Kappe in ein konisches 50-mil-Rohr ein und platzieren die Arrays mit der Barcode-Seite nach unten in das konische Rohr.

Anschließend werden die Rohre in einem schwingenden Schaufelkopf bei 1500 U/min bei Raumtemperatur gesponnen. Nach der Zentrifugation werden die Objektträger in einen zweiten Satz von 50 mil konischen Röhrchen entnommen, die mit Aluminiumfolie abgedeckt wurden. Die Röhrchen werden dann mit Stickstoffgas gespült, das für den Transport oder die Lagerung bis zum Scannen durch einen 0,22-Mikron-Filter und eine Kappe gefiltert wird.

Wir sammeln Scandaten auf einem PerkinElmer Scan-Array 5.000. Das Array-Bild wird gerastert und die Rohscandaten werden verarbeitet, und die erste Datenanalyse erfolgt mit der Bildgebungssoftware-Suite von Bio Discovery. Als nächstes werden die Intensitätsdaten des Spot-Signals normalisiert, indem die statistische Analyse mit BRB-Array-Tools durchgeführt wird, einem robusten und frei verfügbaren Microarray-Statistikpaket, das vom National Cancer Institute heruntergeladen werden kann.

Andere statistische Analysen und Suchen nach Genexpressionsmustern werden mit der Genexpressionsmuster- und Analysesuite Jeep PPAs durchgeführt. Ein weiteres frei verfügbares webbasiertes Analysepaket. Vielen Dank, dass Sie sich unser Video zur Verarbeitung des Lob Lolly Pine PT Gen Two Microarrays angesehen haben.

Verantwortlich für den Inhalt und die Produktion dieses Schulungsvideos waren folgende Personen.