Name: Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Lernen Sie die Verarbeitung des PtGen2 cDNA-Microarrays für Loblolly-Kiefer. Dieses Protokoll zeigt Vor- und Nachhybridisierungs-Waschtechniken zur Verbesserung der Signalkonsistenz und Reduktion von Hintergrundgeräuschen.

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Die Kennzeichnung, Hybridisierung und Waschen Protokolle hierin enthalten einige Änderungen an, die zuvor von Dr. J. Quackenbush während der Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy an der Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR) entwickelt, und Dr. Rob Alba während der Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.

(Hinweis Abschnitte 1 bis 4 nicht in Video demonstriert) Vorbereitung Cy-markierten Target-cDNA Was folgt, ist das Protokoll, die wir für die cDNA-Synthese aus loblolly Kiefer Gesamt-RNA und indirekten cDNA Kennzeichnung vor Hybridisierungen Microarray. Obwohl ein paar nicht-triviale Änderungen vorgenommen wurden, ist das Protokoll unter ähnlich wie in der Bedienungsanleitung SuperScript Indirekte die Invitrogen cDNA Labeling Kit zur Verfügung gestellt. Teil 1: First-Strand cDNA Synthesis Reaction <ol><li> Mix und kurz Spin jedes Kit-Komponenten vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie Reaktionen wie folgt: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl Gesamt-RNA, 20 ug / Reaktion (vorbehandelt mit Turbo DNase Ambions) </li><li> 2μl Anchored Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1μl Zufällige Hexamer Primer </li><li style="list-style:none;"> Gesamtvolumen = 18μl </li></ul></li><li> Die Röhrchen bei 70 ° C für 5 Minuten, und dann auf Eis für 1-2 Minuten. </li><li> Fügen Sie die folgenden zu jedem Reaktionsgefäß auf Eis: <ul><li> 6μl 5X First-Strand-Puffer </li><li> 1.5μl 0,1 M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP-Mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Vorsichtig mischen und Spin kurz. Inkubieren Rohr über Nacht bei 45 ° C. </li><li> Add 15μl 1M NaOH zu jedem Reaktionsgefäß geben und gut mischen. </li><li> Inkubieren Rohr bei 70 ° C für 10 Minuten. </li><li> Fügen Sie 15μl von 1M HCl; vorsichtig mischen. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2); vorsichtig mischen. </li></ol> Teil 2: Reinigung von First-Strand cDNA. <ol><li> Fügen Sie 500μl der Ladepuffer der cDNA (aus Schritt 1,9) und gut mischen. </li><li> Legen Sie eine SNAP Purification Column (im Lieferumfang des Indirect Labeling Kit) auf einem Sammelrohr und laden Sie Ihre cDNA auf der Säule. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Spalte auf der gleichen Sammlung Rohr und fügen 500μl Waschpuffer. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4 und 2,5 dreimal für insgesamt drei 500μl wäscht. </li><li> Spin noch einmal bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute sec; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Column auf ein neues 1,5 ml Tube. </li><li> Add 50 ul warmen DEPC-Wasser (50 ° C) auf die SNAP Column und inkubieren Spalte bei Raumtemperatur für 1 Minute. Eluieren der cDNA über eine Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,9, mit 100 &amp;mgr; l warmes DEPC-Wasser und die gleiche 1.5ml tube für den Eluenten. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zum Eluenten aus den Schritten 2,9 und 2,10. </li><li> Add 3μl von Glykogen (20mg/ml), um das Rohr und mischen. </li><li> Fügen Sie 500μl eiskaltem 100% EtOH, gut mischen und inkubieren das Rohr 1 Stunde bei -80 ° C. </li><li> Drehen Sie das Rohr bei 14.000 g bei 4 ° C für 20 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Fügen Sie 500μl eiskaltem 70% EtOH und drehen Sie das Rohr bei 14.000 g bei 4 ° C für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Der Luft trocknen die Proben für 5 Minuten; sicherzustellen, dass alle EtOH entfernt wird. </li><li> Warm 2X Coupling Buffer bei 37 ° C für 5 Minuten und Resuspension der cDNA-Probe in 5μl der warmen 2X Coupling Buffer. </li><li> Erhitzen Sie die cDNA / Coupling-Puffer bei 50 ° C für 10 Minuten und Vortex gut. Stellen Sie sicher, dass Ihr cDNA Pellet vollständig in den 2X Coupling Buffer resuspendiert. </li></ol> Teil 3: Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff Bei der Vorbereitung der Reaktion vorsichtig sein, um die Exposition der Farbstofflösung, um Licht zu minimieren. Außerdem ist DMSO hygroskopisch und zieht Feuchtigkeit aus der Luft, die mit dem NHS-Ester des Farbstoffes reagieren und reduzieren die Kupplungsreaktion Effizienz absorbieren. Halten Sie das DMSO im Kit in einer bernsteinfarbenen Schraubverschluss Fläschchen bei -20 ° C geliefert, und lassen Sie das Fläschchen auf Raumtemperatur erwärmt, bevor um Kondensation zu vermeiden. Verwenden Sie nur das DMSO mit diesem Kit zur Verfügung gestellt. <ol><li> Öffnen Sie ein Paket von Cy-3-oder Cy-5 Dye und fügen 75μl DMSO direkt an den Farbstoff Durchstechflasche. </li><li> Add 5μl der DMSO / Farblösung in die Röhre aus Schritt 2.18. </li><li> Gut mischen und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Stunde. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2), um den Farbstoff gekoppelten cDNA-Lösung. </li><li> Fügen Sie 500μl der Ladepuffer der cDNA-Lösung. Gut mischen durch Vortexen. </li><li> Legen Sie eine SNAP Spalte auf eine klare Sammelröhrchen und laden Sie die cDNA / Puffer-Lösung. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Spalte auf der gleichen KollektionRohr, fügen Sie 500μl Waschpuffer in Spalte. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3. 8-3,9 dreimal für insgesamt drei 500μl wäscht. </li><li> Spin noch einmal bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Spalte auf eine neue Bernstein-Collection-Tube. </li><li> Fügen Sie 65μl der warmen DEPC-Wasser (50 ° C) auf die SNAP-Säule und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Minute. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute und sammeln Sie die Flow-Through. Die Flow-Through sollte 60μl des gereinigten Farbstoff-gekoppelten cDNA. </li></ol> Teil 4: Beurteilung der Labeling Verfahren. <ol><li> Conduct einem Spektralphotometer Test zu jeder Cy-cDNA Kennzeichnung zu bewerten. Berechnen Sie die Gesamtzahl der pmol der synthetisierten cDNA: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Berechnen Sie die gesamte pmol eingebaut Cy-Farbstoff für jede Kennzeichnung Reaktion: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Als nächstes berechnen die pmol Nukleotid / pmol Farbstoff-Verhältnis für jede Reaktion. Optimal Reaktionen erzeugen&gt; 6000pmol der cDNA (pro 60ul),&gt; 200pmol von Cy-Dye (pro 60ul) und ein Nukleotid / Farbstoff-Verhältnis, das &lt;30 ist. </li></ol> Teil 5: Schieben Sie Pre-Wash <ol><li> Die PtGen2 Array basiert auf Corning UltraGaps Dias (Amino-Silan beschichtet) gedruckt und cDNAs sind UV-vernetzt. Print Flecken sind deutlich sichtbar durch den hohen Salzgehalt des Puffers. </li><li> Verwenden Sie ein Diamant-Spitze Feder, um die Folie für den oberen und unteren Bereich der Print-Bereich (optional) zu markieren. </li><li> Legen Sie etwa 250 ml bis 43 vorgewärmten ° C 0,2% SDS-Lösung in Objektträger waschen Teller (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Die Objektträger in der Bildschirmpräsentation Rack und tauchen Sie ein in die SDS-Lösung 15-20 Mal sehr heftig, um die Salze auf den Folien zu entfernen vorhybridisiert werden. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen die Dias aus dem Rack und legen Sie sie in einem Coplin Gefäß mit Pre-Hybridisierungspuffer (5x SSC, 0,1% SDS, 1% BSA), die wurde auf 43 ° C vorgewärmten Inkubation bei 43 ° C für mindestens eine Stunde. </li></ol> Teil 6: Pre-Hybridisierung <ol><li> Set fünf schieben Abwasch mit jeweils millipure dH 2 O gefüllt, und ein Coplin Glas mit molekularen grade Isopropanol gefüllt. Legen Sie die Folien in einer Bildschirmpräsentation Rack-und Prozess nacheinander durch fünf Gerichte, die von dunking 20-mal jeweils. </li><li> Die Objektträger zwei auf einmal aus dem fünften Wasser waschen und Dip 5-6 mal in der Isopropanol und sofort in Folien in die Folie Mikrofuge (Chipmate Tischgerät, 2 Positionen) und Spin 1 Minute, um zu trocknen. </li><li> Saubere Objektträger mit Druckluft durch ein 0,22 um Filterpatrone gefiltert und legen Sie sie mit dem Strichcode nach oben in einem Genomic Solutions Hybridisierung Kammer. </li><li> Saubere LifterSlips ™ mit gefilterter Luft und positionieren sie auf dem Objektträger mit den weißen Streifen nach unten. Verwenden Sie eine gelbe Pipettenspitze vorsichtig ausrichten Heber slip on the slide (Washing LifterSlips ™ zunächst in 70% Ethanol ist optional. Wir haben es nicht für erforderlich.) </li></ol> Teil 7: Hybridisierung Sollte sich in der Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden. <ol><li> Für jede Folie hybridisiert werden, berechnen die Höhe der Cy-5 und Cy-3 markierten cDNA-bis 50-75pmol der einzelnen Zielgruppen zu geben. Kombinieren Sie diese Beträge in einem einzigen Rohr und trocken in einem Vakuum-Exsikkator mit der Hitze Einstellung bei 37-45 ° C. Vermeiden Trocknung vollständig aus! </li><li> Resuspendieren der getrockneten Proben in 60 ml Hybridisierungspuffer (frisch zubereitet an diesem Tag) und kurz vortexen. </li><li> Inkubieren Sie die resuspendiert cDNAs für 5 Minuten in ein 95 ° C-Bad und dann schnell Mikrozentrifuge für 30 Sekunden. </li><li> Laden Sie das gesamte resuspendiert Sonde Volumen langsam Pipettieren bei der Dia-LifterSlip ™ Kreuzung an der Unterseite (Strichcode) Ende der Rutsche. Die Folie wird mittels Kapillarwirkung zu laden. (Einige ziehen es vor Pipette auf den Objektträger und dann vorsichtig überlagern die LifterSlip ™ ist dies ein one shot-Verfahren, da, wenn Sie Blasen bekommt man nicht bewegen kann der LifterSlip ™ nach der Platzierung, die zu verschmieren Artefakte Spot kann) </li><li> Legen Sie 20ul von 100 mM DTT in jedes gut Feuchtigkeit an den Enden der Kammer befindet. </li><li> Legen Sie die oben an der Kammer und ziehen Sie die cam Schrauben. Decken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie und tauchen Sie ein in eine 48 ° C Wasserbad für 12-18 Stunden unter leichtem Rühren bei 50-60 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> Teil 8: Post-Hybridisierung Wäscht Alle Wäschen sollte in der Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden. Folien sollte nie erlaubt, bis zum letzten Schritt zu trocknen. <ol><li> Richten Sie einen Coplin Glas mit Wash Solution # 1 @ 53 ° C und vier Schlitten Abwasch mit 250 ml jeder der folgenden gefüllt: 1) WAsche Lösung # 1 @ 53 ° C, 2) Waschlösung # 2 @ Raumtemperatur, 3 &amp; 4) zwei Schalen mit Waschlösung # 3 @ Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Folien aus der Hybridisierung Kammern und legen Sie sie zwei auf einmal in die Coplin Glas. Lassen Sie für 30 Sekunden, dann heben Sie die Folie langsam und der Heber Schlupf wird in das Glas zu bleiben. Objektträger in die Dia-Rack und sofort tauchen Sie ein in Waschlösung # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, Vorwärmung auf 43 ° C). Wiederholen, bis alle LifterSlips entfernt werden und alle Folien, gewaschen werden in der Waschlösung Nr. 1 Schüssel. Tauchen Sie ein Rack nach oben und unten 10 mal kräftig. </li><li> Legen Gericht in 53 ° C in Luft Schüttler Schütteln bei 50-100 rpm für 10 Minuten. </li><li> Transfer-Rack-Lösung # 2 (0,1 × SSC, 0,2% SDS), stürzen 10 Mal, und bei Raumtemperatur inkubieren Wash, langsamen Schütteln für 10 Minuten. </li><li> Dip-Rack 15-mal in der ersten Waschlösung # 3 (0,1 X SSC) zu entfernen, restliche SDS Übertrag aus der Waschlösung # 2. Legen Zahnstange in der zweiten Waschlösung Nr. 3 Schüssel stürzen 10 Mal, und dann langsam Schütteln für 10 Minuten. </li><li> Die Objektträger in 50 mL Falcon Röhrchen mit und Spin @ 1.500 Umdrehungen pro Minute in der Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet. Entfernen Sie Folien geprüft Container Licht, verwenden wir einen anderen Falcon-Röhrchen mit Alufolie abgedeckt, und die Luft aus der Röhre mit Stickstoffgas, fest verschließen (geht auf die Oxidation des Cy-Farbstoffe, insbesondere Cy-5 im Sommer, wenn die Ozonwerte am höchsten sind ). Dias können für ein paar Stunden vor dem Scannen in den Stickstoff gespült Rohre gelagert werden, aber das beste Signal Ergebnisse werden erzielt, wenn Scan unmittelbar nach dem Waschen fertig ist. </li></ol> Teil 9: Datenerhebung und statistische Analyse <ol><li> Scan Bilddaten auf einem PerkinElmer ScanArray gesammelt. Wir verwenden eine 10-Mikron-Scan-Einstellung und Balance Cy3 und Cy5-Signale über die Line-Methode zur Anpassung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> TIF-Dateien sind gerasterten und Rohsignal Daten gesammelt und mit ImaGene Version 7,5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA) filtriert </li><li> Daten Normalisierung und Auswertung, um statistisch gültige differentiell exprimierten Arten zu bestimmen, ist mit BRB Array-Tools Ver getan. 3.7. </li><li> Pattern-Analyse zur Bestimmung der koordinativ exprimierten Genen zu erleichtern ist mit Genexpressionsmuster Analysis Software (GEPAS) Ver getan. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Beispiel PtGen2 Array verarbeitet Verwendung dieses Protokolls in l. <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel PtGen2 Array verarbeitet unter Verwendung von Standard-Hybridisierung und Waschen Protokolle.

<ol><li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+%28Pinus+taeda%29+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li>
<li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.</li>
<li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li>
<li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESTs%2C+cDNA+microarrays%2C+and+gene+expression+profiling%3A+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li>
<li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).</li>
<li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).</li>
</ol>

PtGen2 ist eine neu entwickelte, individuelle cDNA-Microarray, die entworfen, um in erster Linie durch die loblolly Kiefer Forschung verwendet werden sollte. Vorläufige Ergebnisse generiert bislang haben das Array gezeigt, dass ein wertvolles Hilfsmittel bei der Bewertung der Transkriptions-Ereignisse, die in Reaktion auf Trockenstress auftreten, sowie bei der Überwachung der Veränderungen, die während der Embryonalentwicklung entstehen in Pinien, Pinus pinaster 5,6 Wir haben auch kürzlich gezeigt, d...

<table><tbody><tr><td>Prae-Hybridisierungspuffer</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>5X SSC, 0,1 % SDS, 1 % BSA</td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>30 % Formamid, 5X SSC, 5X Denhardt&amp;rsquo;s, 1 % PolyA-RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0,1 % SDS</td></tr><tr><td>Waschlösung #1</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>1X SSC, 0,2 % SDS, auf 43 °C vorheizen&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Waschlösung #2</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC, 0,2 % SDS</td></tr><tr><td>Waschlösung #3</td><td>Pufferlösung</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34959-2,5 L</td><td></td></tr><tr><td>50-mL-Konischgefäße</td><td>Sonstiges</td><td>Falcon BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Kegelförmige 15-mL-Röhrchen</td><td>Sonstiges</td><td>Falcon BD</td><td>352196</td><td>Verwenden Sie diese oder eine ähnliche Kappe, die während der Zentrifugation an der Unterseite jedes 50-mL-Konischgefäßes angebracht wird.</td></tr><tr><td>Coplin-Becher</td><td></td><td>Wheaton</td><td>900520</td><td></td></tr><tr><td>Färbeschale &amp;und Rack </td><td>Sonstiges</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus bovinem Serum (BSA)</td><td>Sonstiges</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418</td><td></td></tr><tr><td>PolyA-RNA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptTM indirekte cDNA-Markierung </td><td>Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L1014-02</td><td></td></tr><tr><td>Turbo-DNase</td><td>Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>System</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy-5-Farbstoff</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Cy-3-Farbstoff</td><td>Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips&amp;#8482;</td><td>Sonstiges</td><td>Erie Scientific</td><td>25X601</td><td></td></tr><tr><td>HybChambers</td><td>Ausrüstung</td><td>GeneMachines</td><td>JHYB200003</td><td></td></tr></tbody></table>

die verarbeitung der loblolly pine ptgen2 cdna microarray

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 ist ein 26.496-Funktion cDNA-Microarray mit verstärkten loblolly Kiefer ESTs. Das Array wird in unserem Labor für die Nutzung durch Forscher studieren die Genexpression in Kiefern und andere Nadelhölzer hergestellt. PtGen2 wurde als Ergebnis unserer Bemühungen zur Entdeckung von Genen in loblolly Kiefer entwickelt und wird von Sequenzen in erster Linie aus Wurzelgewebe identifiziert umfasst, sondern auch aus Nadel-und Stammzellen. 1,2 PtGen2 durch Kreuzungen verschiedener Cy-Farbstoff markiert Nadelbaum Ziel cDNAs wurde getestet , wobei sowohl verstärkt und nicht verstärkt indirekte Markierung Methoden und auch mit einer Reihe von Hybridisierung und Waschen Bedingungen getestet. Dieses Video konzentriert sich auf die Handhabung und Verarbeitung von Folien vor und nach dem Pre-Hybridisierung, sowie nach der Hybridisierung mit einigen Modifikationen der Verfahren entwickelt zuvor. 3,4 Ebenfalls enthalten in Textform nur, sind die Protokolle für die Erzeugung, Kennzeichnung und Reinigung von Ziel-cDNA s, sowie Informationen über Software für Downstream-Verarbeitung verwendet. PtGen2 ist mit einem proprietären Druckpuffer, dass hohe Konzentrationen von Salz, die nur schwer vollständig zu entfernen Dose enthält gedruckt. Die Folien werden zunächst in einem warmen SDS-Lösung vor pre-Hybridisierung gewaschen. Nach einer Vorauswahl Hybridisierung werden die Objektträger kräftig in mehrere Änderungen des Wasser gewaschen, um das Entfernen der restlichen Salze abzuschließen. LifterSlips ™ werden dann gereinigt und positioniert auf den Folien und markierte cDNA wird vorsichtig auf dem Mikroarray durch Kapillarwirkung, die für eine gleichmäßige Verteilung der Probe auf den Objektträger bietet geladen, und verringert die Chance von bubble Statuten. Hybridisierung von Zielen auf das Array wird bei 48 ° C bei hoher Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Nach der Hybridisierung wird eine Reihe von Standard-Wäschen bei 53 ° C durchgeführt und Raumtemperatur für längere Zeit. Verarbeitung PtGen2 Dias mit dieser Technik reduziert Salz und SDS-derived Artefakte oft gesehen, wenn das Array weniger streng verarbeitet wird. Hybridisierende Ziele aus verschiedenen Koniferen RNA Quellen stammen, ergab diese Verarbeitung Protokoll weniger Artefakte, reduziert Hintergrund, und sofern eine bessere Konsistenz zwischen den verschiedenen experimentellen Gruppen von Arrays.

Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt,<em&gt; P. taeda</em&gt; Und andere Nadelbaumarten. Hier zeigen wir Pre-und Post-Hybridisierung Bearbeitung und Reinigung Techniken, die mit diesem Array verwendet werden, um eine bessere Konsistenz, verringert Artefakte und unteren Hintergründe liefern kann.

Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 ist ein cDNA-Microarray mit 26.496 Merkmalen, der amplifizierte ESTs der Virginia-Kiefer (loblolly pine) enthält. Das Array wird in unserem Labor für die Nutzung durch Forscher hergestellt ...

Dieses Video wurde von Forschern der Warnell School of Forestry and Natural Resources der University of Georgia erstellt. Der Zweck dieses Schulungsvideos besteht darin, detailliert darzulegen, wie unser LOB Lolly Pine Pt, Gen zwei cDNA-Microarray bearbeitet wird, wobei insbesondere auf das Waschen und die Handhabung des Arrays vor und nach der Hybridisierung geachtet wird. Im Allgemeinen folgen unsere Protokolle den am Institute for Genomic Research TIGR und der Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, entwickelten Verfahren, wo unsere Arrays gedruckt werden.Wir haben festgestellt, dass eine strengere Aufarbeitung von PT Gen zwei erforderlich ist, um die größtmögliche Konsistenz hinsichtlich der Signalqualitätsuniformität und niedriger Hintergründe zu erreichen. Der erste Schritt ist eine Vorwäsche. Dies führen wir durch, da unser Spottingpuffer einen sehr hohen Salzgehalt aufweist, und diese Vorwäsche ist notwendig, um das Salz zu entfernen.Die Objektträger werden in einen Objektträgerhalter gegeben und kräftig 15 bis 20 Mal in eine auf 43 Grad vorgewärmte 0,2 %ige SDS-Lösung eingetaucht. Nach dem Waschen der Objektträger in der SDS-Lösung werden sie vorsichtig mit einer Pinzette in ein Copeland-Gefäß mit Prähybridisierungspuffer überführt. Dieser Puffer enthält fünffach konzentrierte XSSC, 0,1 % SDS und 1 % BSA und ist ebenfalls auf 43 Grad erhitzt.Das Copeland-Gefäß wird mit Parfum abgedeckt und für eine Stunde in einen 43-Grad-Inkubator gestellt. Nach der Prähybridisierung werden die Objektträger in einen Objektträgerbehälter überführt und nacheinander durch fünf Wechsel von entionisiertem Wasser verarbeitet, wobei jeweils 15 bis 20 Mal in jedem Wechsel eingetaucht wird. Abschließend werden die Objektträger in Isopropanol gegeben und fünf- bis sechsmal eingetaucht, bevor sie in einer Chip M Mate-Zentrifuge zur Trocknung zentrifugiert werden.Nach der Zentrifugation werden die Objektträger mit Druckluft, die durch einen 0,2-Mikron-Filter geleitet wurde, abgeblasen. Anschließend werden sie mit Lifter-Slips überzogen, die ebenfalls mit Druckluft gereinigt wurden, und wir verwenden eine kleine Pipettenspitze, um den Lifter-Slip in die korrekte Position auf dem Objektträger zu bringen.Nachdem die Heber-Slips positioniert wurden, aber bevor der Hybridisierungspuffer hinzugefügt wird, geben wir 20 Mikroliter einer 100 Millimolar dihi, drei atol enthaltenden Lösung in die Feuchtigkeitsmulden an den Enden der Kammer. Nun sind wir bereit, die Ziel-cDNAs hinzuzufügen, die in Hybridisierungspuffer resuspendiert wurden. Die Pipettenspitze wird an den Rand des Heber-Slips und des Objektträgers gehalten, und die Lösung wird langsam aufpipettiert.Wir stellten fest, dass die Nutzung des Kapillareffekts zum Beladen der Arrays die größte Konsistenz bietet und die Bildung unerwünschter Blasen erheblich reduziert. Nachdem das Zielmaterial dem Array hinzugefügt wurde, wird die Hybridisierungskammer zusammengesetzt und mit Aluminiumfolie abgedeckt. Anschließend wird die Hybridisierungskammer über Nacht – typischerweise 14 bis 16 Stunden – in ein schüttelndes Wasserbad gestellt.Das Wasserbad wird auf 48 Grad eingestellt und der Schüttler auf 50 U/min. Es ist außerdem wichtig zu beachten, dass ab dem Zeitpunkt der Zugabe der Hybridisierungslösung bis hin zu allen nachfolgenden Hybridisierungswaschungen die Verfahren unter schwachem Licht durchgeführt werden, um eine Photooxidation zu verhindern. Am folgenden Tag werden die Objektträger aus der Hybridisierungskammer entfernt und in ein Copeland-Gefäß mit Waschlösung Nummer eins gegeben, die zuvor auf 53 Grad vorgewärmt wurde.Die Objektträger verbleiben etwa eine Minute lang im Copeland-Gefäß, bis die Halterungen abfallen; anschließend werden die Objektträger vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und in einen Objektträgerbehälter gegeben, um mit den Waschschritten fortzufahren. Danach werden die Objektträger kräftig etwa 15 bis 20 Mal in einem zweiten Behälter, der ebenfalls Waschlösung Nummer eins bei 53 Grad enthält, eingetaucht. Der Behälter wird dann mit Parafilm abgedeckt und in einen Inkubator mit Luftschüttler bei 53 Grad und 100 U/min gestellt.Nach der 10-minütigen Inkubation und der Waschlösung Nummer eins werden die Objektträger kräftig 15 bis 20 Mal in einen Behälter mit Waschlösung Nummer zwei getaucht, die sich bei Raumtemperatur im Behälter befindet. Dieser wurde mit Parafilm abgedeckt und erneut 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Schließlich werden die Objektträger aus der Waschlösung Nummer zwei entnommen und kräftig 15 bis 20 Mal in einen Behälter mit Waschlösung Nummer drei getaucht.Anschließend werden die Objektträger in einen zweiten Behälter mit Waschlösung Nummer drei überführt, der mit Perfil abgedeckt ist, und erneut 10 Minuten lang auf den Schüttler gestellt. Nach der letzten Wäsche zentrifugieren wir die Objektträger bis zur vollständigen Trocknung. Dazu setzen wir eine 15-ml-Falcon-Kappe in ein 50-ml-Konizglas und platzieren die Arrays mit der Barcode-Seite nach unten in das Konizglas.Die Röhrchen werden anschließend bei Raumtemperatur in einem Schwenkkopfzentrifugenrotor mit 1500 U/min centrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die Objektträger in einen zweiten Satz von 50 ml konischen Röhrchen überführt, die mit Aluminiumfolie abgedeckt wurden. Die Röhrchen werden dann mit Stickstoffgas gespült, das durch einen 0,22-Mikron-Filter geleitet wird, und verschlossen, um sie für den Transport oder die Lagerung bis zur Analyse aufzubewahren.Wir sammeln die Scan-Daten mit einem PerkinElmer Scan Array 5.000. Das Array-Bild wird gerastert und die rohen Scan-Daten werden verarbeitet, wobei die anfängliche Datenanalyse mit der Imaging-Software-Suite von Bio Discovery durchgeführt wird. Anschließend werden die Spot-Signalintensitätsdaten normalisiert, während statistische Analysen mit den BRB Array Tools durchgeführt werden, einem leistungsfähigen und kostenlos verfügbaren statistischen Paket für Microarrays, das vom National Cancer Institute heruntergeladen werden kann.Weitere statistische Analysen und Suchvorgänge nach Genexpressionsmustern werden mit der Software-Suite Jeep PPAs für Genexpressionsmuster und -analysen durchgeführt. Ein weiteres frei verfügbares webbasiertes Analysepaket. Vielen Dank für das Anschauen unseres Videos zur Verarbeitung des Lob Lolly Pine PT Gen Two Microarrays.Die folgenden Personen waren für den Inhalt und die Produktion dieses Schulungsvideos verantwortlich.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Viele pflanzliche Gewebe, einschließlich Phloem und Xylem von loblolly Kiefer...

Ein verbessertes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Loblolly Pine ( P. taeda L.) und andere Nadelbaumarten

Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung modernster Technologie durch DNA-Microarrays. Microarrays geben einen Überblick über die transkriptomischen Veränderungen in Bakterien, die unter einer bestimmten Bedingung auftreten. Darüber hinaus heben wir hervor, wie einfach es ist, große Datenmengen mit Hilfe von komfortablen, eigens entwickelten Softwarepaketen zu analysieren.

Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Die Microarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung und Erstellung von Genexpressionsprofilen von Transkripten auf genomweiter Basis. Aus diesem Grund bietet dieses Protokoll ein optimiertes technisches Verfahren in einem zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarray unter Verwendung von Rinderembryonen am Tag 7, um die Machbarkeit der Verwendung einer geringen Menge an Gesamt-RNA zu demonstrieren.

Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Dieser Artikel beschreibt die Anwendung von ungezielte Metabolomik, Transcriptomics und multivariate statistische Analysen Traubenbeere Transkripte und Metaboliten , um einen Einblick in das Terroir - Konzept zu gewinnen, das heißt, die Auswirkungen der Umwelt auf die Beere Qualitätsmerkmale.

Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Identifizierung und Charakterisierung einer Genfamilie in Grapevine, die zur Familie der Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 Ubiquitin Ligases angewendet.

Umfassenden Workflow zur genomweiten Identifizierung und Ausdruck Meta-Analyse von der ATL E3 Ubiquitin Ligase Genfamilie in Grapevine

Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Prozesse und Qualitätskontrollen für die Zubereitung von gesunder Erwachsenen einziger Säugerzellen Droplet-basierte, hohen Durchsatz Einzelzelle RNA-Seq Vorbereitungen notwendig. Sequenzierung Parameter, lesen Sie Ausrichtung und nachgelagerten einzellige bioinformatische Analyse sind ebenfalls vorhanden.

Droplet Barcode-basierte Einzelzelle Transkriptom des adulten Säugetier-Geweben

Diese Studie präsentiert ein räumliches Trekker–CUT&amp;Tag-Multiom-Protokoll, das direkte räumliche Barcodierung eines Gewebeschnitts mit einer Einzelzell-Multiomanalyse kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht räumlich aufgelöste Einzelzellprofilierung der Genexpression und der Histon-H3K27ac-Modifikation gleichzeitig und bietet mechanistische Einblicke in die Genregulation im Kontext der Gewebemikroanatomie.

räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Zur Untersuchung der Entwicklungsprozesse von Ascosporen in Gibberella zeae, ein Verfahren für die Sammlung unter sterilen Bedingungen gefilmt wird, um ein Höchstmaß an Informationen für die Protokoll-Beschreibung zu generieren. Dies sollte die Reproduzierbarkeit der Experimente, ein entscheidender Aspekt, wenn sie voll Genom Expressionsprofil Tests durchgeführt werden.

Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Lernen Sie die Verarbeitung des PtGen2 cDNA-Microarrays für Loblolly-Kiefer. Dieses Protokoll zeigt Vor- und Nachhybridisierungs-Waschtechniken zur Verbesserung der Signalkonsistenz und Reduktion von Hintergrundgeräuschen.

Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

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