Geboren Normalisierung für Fluoreszenz-Optical Projection Tomographie für ganzem Herzen Imaging

Um eine normalisierte optische Projektionstomographie durchzuführen, wird die Probe zunächst fixiert und in einen Zylinder aus Schnecke eingebettet. Die Probe wird dann entlang einer vertikalen Achse gedreht und dann gleichmäßig mit einer Anregungswellenlänge beleuchtet, und die Transmission wird mit einer C, CD geeigneten Optik gemessen. Das Fluoreszenzsignal bei Wellenlänge wird im Transilluminationsmodus gemessen.

Die aufgenommenen Fluoreszenz- und Absorptionsbilder werden verwendet, um das normalisierte born-Verhältnis zu bestimmen und die Verteilung der Fluor-Vierer innerhalb der Probe zu rekonstruieren. Hallo, mein Name ist Claudia Naone und ich arbeite an den Zentren für Systembiologie am Mass General Hospital der Harvard Medical School. Ich bin Danielle Raki vom Institut für Biologische und Medizinische Bildgebung an der Technischen Universität München und dem Al Center München.

Ich bin Giselle Fido. Ich bin der Direktor von Experimental su Co hier am C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Echtzeit-Ex-vivo-Bildgebung ganzer Organe unter Verwendung des normalisierten Born-Ansatzes für die optische Projektionstomographie.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Verteilung von Fluoreszenzsonden in Hohlorganen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. In diesem Video wird das Verfahren zur Verwendung der optischen Projektionstomographie zur Abbildung von präparierten Geweben oder Organen und ein begleitendes Video erläutert.

Wir erklären, wie Sie dieses System verwenden können, um Zeitraffer-Bildgebung bei sich entwickelnden Drosophila durchzuführen. Das dreidimensionale bildgebende Verfahren der optischen Projektionstomographie erfordert eine einzigartige Kombination aus Optik und einem rotierenden Tisch. In diesem Abschnitt des Videos soll das bildgebende Verfahren erläutert werden.

Zu Beginn dient die primäre Lichtquelle als Quelle sowohl für Beleuchtungs- als auch für Absorptionsmessungen, und um eine Fluoreszenzanregung für Fluoreszenzmessungen bereitzustellen, wird die primäre Lichtquelle zunächst mit einem Schmalbandpass-Interferenzfilter gefiltert. Anschließend durchläuft das Licht einen Satz fester und variabler Neutraldichtefilter. Diese werden mit einem automatischen Verschluss kombiniert, um die Lichtmenge auf der Probe zu kontrollieren und sie niedrig genug zu halten, um ein Ausbleichen der Fotografie zu verhindern.

Eine gleichmäßige Probenausleuchtung wird durch die Verwendung eines Strahlaufweiters und einer kombinierten Eichel-Teleskoplinse mit einer Diffusorlinse erreicht. Schließlich werden optische Schmalbandpass-Interferenzfilter verwendet, um das Licht der Anregungsquelle optisch zu reinigen. Die Probe wird in eine Reinigungslösung getaucht und für die Bildgebung in einem Glasröhrchen an Ort und Stelle gehalten.

Die Probe wird mit Hilfe eines Hochgeschwindigkeits-Rotationstisches mit einer absoluten Genauigkeit von 0,05 Grad um ihre vertikale Achse gedreht. Drei verschiedene manuelle Steuerungen ermöglichen es, die vertikale Achse der Probe zu neigen und in ihrer orthogonalen Ebene zu verstellen. Das absorbierende Signal wird bei der Durchleuchtung erfasst und direkt von einer CCD-Kamera erfasst.

Das Fluoreszenzsignal wird durch einen Schmalbandpass-Interferenzfilter gefiltert, mit einem Langpassfilter gekoppelt und dann mit einem telezentrischen Objektiv gesammelt. Teleobjektive bieten den Vorteil, dass sie einzigartige Eigenschaften bieten, die sie ideal machen. Für die optische Projektionstomographie.

Das Vorhandensein einer Blendenblende, die sich innerhalb der Linsenbaugruppe im Brennpunkt des Objektivs befindet, ist entscheidend. Es stellt sicher, dass sich das Bild parallel zur optischen Achse bewegt. Dadurch werden perspektivische Verzerrungen vermieden und eine gleichmäßige Vergrößerung über viele Fokusebenen innerhalb der telezentrischen Tiefe gewährleistet.

Im nächsten Videoabschnitt wird eine Technik zur Vorbereitung von Proben beschrieben. Daran schließt sich die Methodik an, die für die Bildgebung verwendet wird. Die Gewebe- oder Organvorbereitung der Probe für die tomographische Bildgebung beruht auf einer Dehydrierung der Probe auf Ethanolbasis, die eine asymmetrische Schrumpfung vermeidet.

Dieser Vorgang dauert mehrere Tage. In diesem Video wird ein Mausherz präpariert, aber das Protokoll kann auf jedes Gewebe oder Organ angewendet werden. Wir werden unser Fluoreszenzbildgebungsverfahren am Herzen eines Tieres demonstrieren, das einen kontrollierten Infarkt erlitten hat.

Mit anderen Worten, ein Verlust der Blutversorgung, der zu einer im Voraus offensichtlichen Gewebenekrose führt. Die Maus wurde mit Pro injiziert, da sechs 80 inact Fluoreszenzsensoren über die Cathepsin-Aktivität bei der Heilung berichten. Myokard: Anästhesieren Sie die Maus für die Perfusion und Herzextrusion mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin. Injizieren Sie dann 50 Einheiten Heparin intraperitoneal, um die Gerinnung zu verhindern.

Fünf Minuten später führen Sie die Längslaparotomie an dem vollständig anästhesierten Tier durch, um das Blut zu entfernen. Öffnen Sie zunächst die linke Nierenvene. Injizieren Sie nun langsam 20 Milliliter Kochsalzlösung in die untere Hohlvene.

Die Kochsalzlösung verdrängt das Blut, nachdem sie das gesamte Blut unter einem Präpariermikroskop ausgespült hat. Verwenden Sie weiterhin die Standardmethoden, um den Thorax zu öffnen und das Herz zu entfernen. Fixieren Sie nun das Herz acht Stunden lang in 4%PFA bei vier Grad Celsius.

Ab diesem Zeitpunkt müssen die Schritte der Gewebevorbereitung im Dunkeln durchgeführt werden, um ein Ausbleichen von fluoreszierenden Kontrastmitteln oder Proteinen, die auf das Gewebe aufgetragen werden, zu vermeiden. Wenn die Fixierung abgeschlossen ist, waschen Sie das PFA mit einer 15-minütigen Spülung in PBS ab, das gereinigte Herz wird dann in einen Pool von 0,8 % Aros eingebettet. Sobald der Aros getrocknet ist, wird die Agarose um das Gewebe herum weggeschnitten, um eine Blockform zu erhalten.

Als nächstes dehydrieren Sie das aros-verschlüsselte Herz durch eine fünfstufige Reihe, bei der Sie zuerst in 20 % Ethanol, dann schrittweise höhere Ethanolkonzentrationen und schließlich reines Ethanol einweichen. Dieses Dehydratisierungsverfahren trägt dazu bei, eine asymmetrische Schrumpfung der Probe zu vermeiden. Die ersten vier Bäder in verdünntem Ethanol müssen eine Stunde lang durchgeführt werden, und das letzte Bad in 100%Ethanol muss mindestens 10 Stunden lang durchgeführt werden.

Sobald die Ethanolbehandlungen abgeschlossen sind, geben Sie die Probe in Murrays klare Lösung, bis die Probe klar ist, was von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen variiert. Diese Reinigungslösung ahmt das zelluläre Wasser nach und passt sich den Zellmembranen an, wodurch das Gewebe transparent wird. Ethanol kann am Ende des Reinigungsprozesses in minimalen Spuren vorhanden sein, was aufgrund der thermischen Bewegung des Alkohols in der Reinigungslösung selbst zu mehreren Artefakten in den Rekonstruktionen führt.

Um dieses Problem zu vermeiden, empfiehlt sich ein zweiter Clearing-Zyklus. Dies sollte nicht länger als vier Stunden dauern. Sobald die Probe fertiggestellt ist, ist sie bereit für die optische Projektion.

Tomographie mit Hilfe eines Computers. Die Rekonstruktion der optischen Absorption in Abwesenheit von Lichtstreuung kann mit Hilfe eines gängigen gefilterten Radon-Rückprojektionsalgorithmus erreicht werden. Dieses Verfahren ist analog zur zweidimensionalen Röntgen-Computertomographie.

Legen Sie den Aerosblock in die transparente Bildgebungskammer, die mit der Reinigungslösung gefüllt ist. Montieren Sie nun die Kammer auf dem Tisch und beleuchten Sie die Probe mit einem magazinierten Strahl sowohl für Anregungs- als auch für Transmissionsmessungen. Die Wahl der Anregungsquelle basiert auf dem gewählten fluoreszierenden Protein oder dem molekularen Kontrastmittel für die Bildgebung.

Es ist zweckmäßig, die vertikale Achse der Probe parallel zur Pixelspalte des CCD auszurichten. Drehen Sie die Probe über 360 Projektionen in Winkelschritten von einem Grad, nehmen Sie Bilder in jedem Winkel bei Transbeleuchtung sowohl bei der Absorptions- als auch bei der Fluoreszenzwellenlänge auf. Die Software, die die Erfassung ausführt, steuert automatisch den Verschluss an der primären Lichtquelle, um eine kontinuierliche Beleuchtung zu vermeiden und das Ausbleichen der Probenfotos zu reduzieren.

Der Shutter ist besonders wichtig, wenn lange Integrationszeiten erforderlich sind, um aus den Absorptionsdaten eine 3D-Rekonstruktion zu erstellen. Verwenden Sie einfach einen gefilterten Radon-Rückprojektionsalgorithmus für die 3D-Rekonstruktion aus den Fluoreszenzbildern. Zu berücksichtigen sind weitere Absorptionsbeiträge, die im nächsten Videosegment beschrieben werden.

Nachdem Sie die für eine Absorptionsrekonstruktion erforderlichen Schritte abgeschlossen haben, gibt es noch einige weitere Schritte, um eine Fluoreszenzrekonstruktion abzuschließen. Die Rekonstruktion einer optischen Karte in Abwesenheit von Lichtstreuung kann mit Hilfe eines gängigen Algorithmus für gefilterte Radon-Rückprojektion erfolgen. Das Verfahren ist analog zur zweidimensionalen Röntgen-Computertomographie.

Bei der Rekonstruktion der Fluoreszenzverteilung. Die variierende räumlich abhängige Absorption macht die Verwendung des inversen Radons für die Rückseite falsch, wodurch die Projektion der Fluoreszenzbilder die erhaltenen Verteilungen des fluoreszierenden Proteins oder der fluoreszierenden molekularen Sonden und deren Quantifizierungsfähigkeit stark beeinträchtigt. Jeder Strahl bei der Anregungswellenlänge Lambda X, der von einer beliebigen Quellposition Xs emittiert wird, wird beim Durchgang durch das abgebildete Objekt exponentiell abgeschwächt.

Nach dem Anregen des Fluorochroms, das sich an der Position X befindet, wird die Strahlung bei der Emissionswellenlänge gefiltert und von den CCD-Pixeln, die sich an der Position XD befinden, unter Verwendung des Teleric Imaging Lensing Systems gesammelt. Obwohl die emittierte Fluoreszenz nicht dem gleichen Weg wie der Anregungsstrahl folgt, entspricht die an jedem Pixel aufgezeichnete Intensität einer Projektion aller Fluorochrome, die entlang der gesamten Fokuszone angeregt werden, die diesem speziellen Anregungsstrahl entspricht. Aufgrund der hohen Telezentrizität des Systems wird das abgebildete Objekt dann um 360 Grad gedreht und mit der CCD-Kamera werden Messungen mehrerer Quellendetektoren, UX bei der Anregungswellenlänge und UFL bei der Emissionswellenlänge, erfasst.

Diese werden dann unter dem normierten geborenen Feld UB kombiniert, das als Verhältnis der beiden definiert ist. Die Rekonstruktion der Fluorchromverteilung kann erleichtert werden, indem das Vorwärtsmodell sowohl für die Anregung als auch für die Emissionslichtausbreitung geschrieben wird, die Grünfunktion, die die Anregung beschreibt. Die Strahlausbreitung folgt einem einfachen Lambert-Gesetz, wobei muh A die zuvor bestimmte optische Absorptionsverteilung ist.

Die Lichtintensität UX, die von der Quelle bei Positionsüberschreitung emittiert und vom Detektor an Position XD auf dem C.C., D gemessen wird, kann als Produkt der grünen Funktion mit einer Konstante B geschrieben werden, die systemabhängig ist. Die genaue Verteilung der Anregungslichtintensität GX entlang jedes Strahlengangs kann dann berechnet werden. Die am Detektor XD detektierte Fluoreszenzintensität UFL, die durch das von der Quelle Xs emittierte Licht stimuliert wird, berücksichtigt den Beitrag aller Theros, die entlang des Strahlengangs von X nach xd angeregt wurden.

Das Vorwärtsmodell unseres Bildgebungsproblems kann dann als ub ub geschrieben werden, wobei alpha die unbekannten Konstanten enthält, die systemabhängig sind. Das Vorwärtsmodell wird dann auf dem angenommenen Netz diskretisiert und eine Inversion durchgeführt, um die Fluorochromverteilung zu extrahieren, sowohl das Transmissions- als auch das Fluoreszenzsignal zu erfassen und den herkömmlichen Rückprojektionsalgorithmus zur Rekonstruktion der Probe zu verwenden. Hier werden Rekonstruktionen der Transmission und der konventionellen fluoreszenzoptischen Projektionstomographie gezeigt.

Eine Rekonstruktion einer einzelnen Ebene des Herzens wird sowohl in der Absorption als auch in der Fluoreszenz gezeigt. Die normalisierte Rekonstruktion des geborenen Zustands wird vorgestellt und zeigt den Unterschied in der Farbstoffverteilung im Herzen. Nach der Normalisierung haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie den Aufbau für die optische Projektionstomographie erstellen und wie Sie Artefakte aufgrund optischer Absorption in den Rekonstruktionen für die Fluoreszenztomographie entfernen können.

Es ist in der Tat sehr wichtig, die Probe zu reinigen, um den Beitrag des Streulichts zu entfernen, aber gleichzeitig ist es auch wichtig, den Reinigungsprozess auszugleichen, um so viel wie möglich vom Fluoreszenzbeitrag zu erhalten. Eine weitere Sache, die bei der Verwendung dieses Ansatzes sehr wichtig ist, ist die Berechnung des knochennormalisierten Verhältnisses, das durch Division der Fluoreszenzbilder durch die Absorptionsbilder erhalten wird. Das war's also.

Vielen Dank, dass Sie an unserem visualisierten Experiment teilgenommen haben, und viel Glück bei Ihren eigenen Experimenten.