Geboren Normalisierung für Fluoreszenz-Optical Projection Tomographie für ganzem Herzen Imaging

Um eine normalisierte optische Projektionstomographie durchzuführen, wird die Probe zunächst fixiert und in einen Zylinder aus Agar eingebettet. Anschließend wird die Probe um eine vertikale Achse rotiert und gleichmäßig mit einer Anregungs-Wellenlänge beleuchtet, wobei die Transmission mit einer geeigneten Optik und einer Kamera (C, CD) gemessen wird. Das fluoreszierende Signal bei der Wellenlänge wird im Durchlichtmodus erfasst.

Die aufgenommenen Fluoreszenz- und Absorptionsbilder werden verwendet, um das normalisierte Born-Verhältnis zu bestimmen und die Verteilung der Fluorofore innerhalb der Probe zu rekonstruieren. Hallo, mein Name ist Claudia Naone und ich arbeite am Zentrum für Systembiologie am Mass General Hospital, der Harvard Medical School. Ich bin Danielle Raki vom Institut für Biologische und Medizinische Bildgebung an der Technischen Universität München und am Al Center Munich.

Ich bin Giselle Fido. Ich bin die Leiterin des Experimental su Co hier am C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Echtzeit-Ex-vivo-Ganzorganabbildung unter Verwendung des Born-normalisierten Ansatzes für die optische Projektionstomographie.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Verteilung fluoreszenter molekularer Sonden in hohlen Organen zu untersuchen. Beginnen wir also. In diesem Video wird das Verfahren zur Bildgebung vorbereiteter Gewebe oder Organe mittels optischer Projektionstomographie und ein begleitendes Video erläutert.

Wir erläutern, wie man dieses System für die Zeitrafferaufnahme an sich entwickelnden Drosophila verwendet. Die dreidimensionale Bildgebungstechnik der optischen Projektionstomographie erfordert eine einzigartige Kombination aus Optik und einem rotierenden Objektträger. In diesem Abschnitt des Videos wird das Bildgebungsverfahren erläutert.

Zunächst dient die primäre Lichtquelle sowohl als Quelle für Beleuchtung und Absorptionsmessungen als auch zur Bereitstellung der fluoreszenten Anregung für Fluoreszenzmessungen. Dazu wird das Licht der primären Lichtquelle zunächst mit einem schmalbandigen Interferenzfilter gefiltert. Anschließend durchläuft das Licht einen Satz fester und variabler Neutraldichtefilter. Diese werden zusammen mit einem automatischen Verschluss kombiniert, um die Lichtmenge auf der Probe zu steuern und ausreichend gering zu halten, um jegliches Photobleichen zu verhindern.

Eine gleichmäßige Probenausleuchtung wird durch einen Strahlaufweiter und eine kombinierte Glan-Teleskoplinse mit Diffusorlinse erreicht. Abschließend werden optische schmale Bandpass-Interferenzfilter verwendet, um das Anregungslicht optisch zu reinigen. Die Probe wird in eine Klärungslösung eingetaucht und zur Bildaufnahme in einem Glasrohr fixiert.

Die Probe wird über einen Hochgeschwindigkeits-Drehtisch mit einer absoluten Genauigkeit von 0,05 Grad um ihre vertikale Achse gedreht. Drei separate manuelle Steuerungen ermöglichen es, die vertikale Achse der Probe in ihrer orthogonalen Ebene zu kippen und auszurichten. Das absorbierende Signal wird bei Durchlichtbeleuchtung erfasst und direkt von einer CCD-Kamera detektiert.

Das fluoreszierende Signal wird durch einen schmalen Bandpass-Interferenzfilter geleitet, der mit einem Langpassfilter gekoppelt ist, und anschließend mit einer telezentrischen Linse gesammelt. Telezentrische Linsen bieten den Vorteil, einzigartige Eigenschaften bereitzustellen, die sie ideal für die optische Projektions-Tomographie machen.

Die Anwesenheit einer Blende, die sich innerhalb der Objektivbaugruppe im Brennpunkt des Objektivs befindet, ist entscheidend. Sie gewährleistet, dass das Bild parallel zur optischen Achse verläuft. Dies beseitigt perspektivische Verzerrungen und sorgt für eine gleichmäßige Vergrößerung über mehrere Fokusebenen innerhalb der telezentrischen Tiefe hinweg.

Das nächste Videosegment beschreibt eine Technik zur Probenvorbereitung. Anschließend folgt die Methodik zur Bildgebung. Die Vorbereitung des Gewebes oder Organs für die tomographische Bildgebung beruht auf einer ethanolbasierten Dehydrierung der Probe, die eine asymmetrische Schrumpfung vermeidet.

Dieser Prozess dauert mehrere Tage, bis er abgeschlossen ist. In diesem Video wird ein Mausherz präpariert, doch das Protokoll kann auf jedes Gewebe oder Organ angewendet werden. Wir werden unsere Fluoreszenzabbildungsmethode am Herzen eines Tieres demonstrieren, das einen kontrollierten Infarkt erlitten hat.

Das heißt, ein Verlust der Blutversorgung, der bereits im Voraus zu einer offensichtlichen Gewebenekrose führt. Die Maus wurde mit einem seit sechs Stunden inaktivierten, fluoreszierenden Sensor injiziert, der die Kathepsinaktivität während der Wundheilung anzeigt. Anästhesieren Sie das Myokard der Maus zur Perfusion und Entnahme des Herzens durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin. Injizieren Sie anschließend 50 Einheiten Heparin intraperitoneal, um eine Gerinnung zu verhindern.

Fünf Minuten später führen Sie am vollständig anästhesierten Tier eine longitudinale Laparotomie durch, um das Blut zu entfernen. Öffnen Sie zunächst die linke Nierenvene. Injizieren Sie nun langsam 20 Milliliter Kochsalzlösung in die untere Hohlvene.

Die Salzlösung verdrängt das Blut, nachdem unter einem Stereomikroskop das gesamte Blut ausgespült wurde. Fahren Sie mit den standardisierten Arbeitsmethoden fort, um den Thorax zu öffnen und das Herz zu entnehmen. Fixieren Sie das Herz anschließend acht Stunden lang in 4 % PFA bei vier Grad Celsius.

Von diesem Zeitpunkt an müssen die Schritte zur Gewebepräparation im Dunkeln durchgeführt werden, um eine Ausbleichung eventuell vorhandener fluoreszenter Kontrastmittel oder Proteine zu vermeiden, die am Gewebe angebracht wurden. Sobald die Fixierung abgeschlossen ist, spülen Sie die PFA mit einer 15-minütigen Spülung in PBS ab, anschließend wird das gereinigte Herz in einer Lösung aus 0,8 % Aros eingebettet. Nachdem das Aros getrocknet ist, wird das Agarose um das Gewebe herum entfernt, um eine blockförmige Struktur zu erhalten.

Als Nächstes entwässern Sie das aros-verschlüsselte Herz durch eine fünfstufige Serie, die mit einer Einweichung in 20% Ethanol beginnt, gefolgt von progressiv höheren Ethanolkonzentrationen und schließlich reinem Ethanol. Dieses Entwässerungsverfahren hilft dabei, eine asymmetrische Schrumpfung der Probe zu vermeiden. Die ersten vier Bäder in verdünntem Ethanol müssen jeweils eine Stunde lang durchgeführt werden, und das letzte Bad in 100% Ethanol muss mindestens 10 Stunden dauern.

Nach Abschluss der Ethanol-Behandlungen wird die Probe in Murray's Klärungslösung gegeben, bis die Probe klar wird; dies dauert je nach Probe von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Klärungslösung ahmt das zelluläre Wasser nach und weist einen Brechungsindex auf, der den Zellmembranen entspricht, wodurch das Gewebe transparent wird. Am Ende des Klärungsprozesses können geringste Spuren von Ethanol vorhanden sein, was aufgrund der thermischen Bewegung des Alkohols innerhalb der Klärungslösung selbst zu mehreren Artefakten bei den Rekonstruktionen führen kann.

Um dieses Problem zu vermeiden, wird ein zweiter Klärzyklus empfohlen. Dieser sollte nicht länger als vier Stunden dauern. Sobald er abgeschlossen ist, ist die Probe bereit für die optische Projektion.

Tomographie mithilfe eines Computers. Die Rekonstruktion der optischen Absorption bei Abwesenheit von Lichtstreuung kann mit einem üblichen gefilterten Radon-Rückprojektionsalgorithmus erhalten werden. Dieser Prozess ist analog zur zweidimensionalen Röntgen-Computertomographie.

Platzieren Sie den Aeros-Block in die transparente Abbildungskammer, die mit der Klärungslösung gefüllt ist. Befestigen Sie nun die Kammer auf dem Objekttisch und beleuchten Sie die Probe mit einem kollimierten Strahl für Anregungs- und Transmissionsmessungen. Die Wahl der Anregungsquelle hängt vom verwendeten fluoreszierenden Protein oder molekularen Kontrastmittel ab.

Es ist zweckmäßig, die vertikale Achse der Probe parallel zur Pixelspalte der CCD-Ausrichtung auszurichten. Drehen Sie die Probe über 360 Projektionen mit Winkelinkrementen von einem Grad und nehmen Sie bei jedem Winkel Bilder in Durchlicht bei den Wellenlängen zur Absorption und Fluoreszenz auf. Die Software, die die Aufnahme steuert, regelt automatisch den Verschluss der primären Lichtquelle, um eine kontinuierliche Beleuchtung zu vermeiden und die photochemische Bleiche der Probe zu reduzieren.

Der Verschluss ist besonders wichtig, wenn lange Integrationszeiten erforderlich sind, um aus den Absorptionsdaten eine 3D-Rekonstruktion zu erstellen. Verwenden Sie einfach einen gefilterten Rückprojektionsalgorithmus nach Radon für die 3D-Rekonstruktion aus den Fluoreszenzbildern. Andere Absorptionsbeiträge müssen berücksichtigt werden, die im nächsten Videosegment beschrieben sind.

Nach Abschluss der Schritte, die für eine Absorptionsrekonstruktion erforderlich sind, sind noch einige weitere Schritte zur Durchführung einer fluoreszenten Rekonstruktion notwendig. Die Rekonstruktion einer optischen Karte in Abwesenheit von Lichtstreuung kann mithilfe eines gängigen gefilterten Radon-Rückprojektionsalgorithmus erhalten werden. Der Prozess ist analog zur zweidimensionalen Röntgen-Computertomographie.

Bei der Rekonstruktion der Fluoreszenzverteilung führt die räumlich variierende Absorption dazu, dass die Anwendung der inversen Radon-Transformation zur Rückprojektion der Fluoreszenzbilder falsche Ergebnisse liefert, was die ermittelten Verteilungen des fluoreszierenden Proteins oder des fluoreszierenden molekularen Probes sowie deren Quantifizierung erheblich beeinträchtigt. Jeder Strahl bei der Anregungswellenlänge Lambda X, der von einer beliebigen Quellenposition Xs emittiert wird, wird exponentiell abgeschwächt, während er durch das abgebildete Objekt hindurchtritt.

Nach der Anregung des Fluorochroms an der Position X wird die Strahlung bei der Emissionswellenlänge gefiltert und vom CCD-Pixel an der Position XD mithilfe des telerzentrischen Abbildungsobjektivsystems gesammelt. Obwohl die emittierte Fluoreszenz nicht denselben Weg wie der Anregungsstrahl verfolgt, entspricht die an jedem Pixel gemessene Intensität näherungsweise einer Projektion aller entlang der gesamten Fokalzone angeregten Fluorochrome, die diesem speziellen Anregungsstrahl entsprechen. Aufgrund der hohen Telerzentrik des Systems wird das abgebildete Objekt anschließend um 360 Grad gedreht, und mehrere Messungen der Quell-Detektor-Signale, UX bei der Anregungs- und UFL bei der Emissionswellenlänge, werden mit der CCD-Kamera aufgezeichnet.

Diese werden dann unter dem normalisierten Born-Feld UB kombiniert, das als das Verhältnis der beiden definiert ist. Die Rekonstruktion der Fluorochromverteilung kann erleichtert werden, indem man das Vorwärtsmodell sowohl für die Anregungs- als auch für die Emissionslichtausbreitung formuliert, wobei die Greens-Funktion die Anregung beschreibt. Die Strahlenausbreitung folgt einem einfachen Lambert-Beer-Gesetz, wobei moo A die zuvor bestimmte optische Absorptionsverteilung darstellt.

Die Lichtintensität UX, die von der Quelle an der Position Xs emittiert und vom Detektor an der Position XD auf der C.C. D gemessen wird, kann als Produkt der grünen Funktion mit einer systemabhängigen Konstanten B geschrieben werden. Die genaue Verteilung der Anregungslichtintensität GX entlang jedes Strahlengangs kann dann berechnet werden. Die am Detektor XD gemessene Fluoreszenzintensität UFL, die durch das von der Quelle Xs emittierte Licht angeregt wird, berücksichtigt den Beitrag aller Fluorophore, die entlang des Strahlengangs von Xs bis XD angeregt wurden.

Das Vorwärtsmodell unseres Bildgebungsproblems kann dann als ub ub geschrieben werden, wobei alpha die unbekannten, systemabhängigen Konstanten berücksichtigt. Das Vorwärtsmodell wird anschließend auf dem angenommenen Netz diskretisiert, und eine Inversion wird durchgeführt, um die Verteilung des Fluorochroms zu extrahieren, sowohl das Transmissions- als auch das fluoreszierende Signal zu erfassen und den herkömmlichen Rückprojektionsalgorithmus zur Rekonstruktion der Probe zu verwenden. Hier werden Rekonstruktionen der Transmission sowie der konventionellen fluoreszierenden optischen Projektionstomographie gezeigt.

Es wird eine Rekonstruktion einer einzelnen Ebene des Herzens sowohl im Absorptions- als auch im Fluoreszenzmodus gezeigt. Die normalisierte Born-Rekonstruktion wird präsentiert und zeigt den Unterschied in der Farbstoffverteilung innerhalb des Herzens. Nach der Normalisierung haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie der Aufbau für die optische Projektionstomographie erfolgt und wie Artefakte aufgrund optischer Absorption in den Rekonstruktionen der Fluoreszenztomographie entfernt werden können.

Es ist tatsächlich sehr wichtig, daran zu denken, die Probe zu klären, um den Beitrag des gestreuten Lichts zu entfernen, aber gleichzeitig ist es auch wichtig, den Klärprozess so auszubalancieren, dass möglichst viel des Fluoreszenzbeitrags erhalten bleibt. Eine weitere sehr wichtige Überlegung bei der Anwendung dieses Ansatzes ist die Berechnung des normalisierten Knochenverhältnisses, das durch Division der Fluoreszenzbilder durch die Absorptionsbilder erhalten wird. Das war's also.

Vielen Dank, dass Sie an unserem visualisierten Experiment teilgenommen haben, und viel Erfolg bei Ihren eigenen Experimenten.