Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Hallo, ich bin Leah Kent von STEM Gent. Heute zeigen wir Ihnen Verfahren für die Fütterung, die Entfernung der Differenzierung und die Verpackung von humanen embryonalen Stammzellen. Wir verwenden diese Techniken in unserem Labor für die routinemäßige Kultivierung und Wartung von HES-Zellen.

Also lasst uns loslegen. Die Gesamtkulturqualität wird durch Beobachtung der Kolonien bei geringer Leistung mit zwei- oder fünffacher Vergrößerung bewertet. Wenn Sie die Zellen unter dem Mikroskop betrachten, beachten Sie die folgende normale mittlere Farbe, Abwesenheit von sichtbaren Verunreinigungen, die Größe und Dichte der Kolonie und die Gesamtqualität der Zellen.

Das frische humane ES-Zellkulturmedium hat nach der Inkubation über Nacht normalerweise eine orange oder strohgelbe Farbe. Das Nährmedium erscheint aufgrund der Änderung des pH-Werts und der Erschöpfung der Nährstoffe im Medium oft gelblicher. Wenn das Medium, wie in diesem Beispiel gezeigt, violett erscheint, ist eine grundlegende pH-Verschiebung aufgetreten.

Erscheint das Medium extrem gelb, ist das Medium angesäuert, was auf eine extrem überfüllte Kolonie oder Kontamination zurückzuführen sein kann. Das Medium sollte jederzeit klar erscheinen. Wenn die Kultur keine großen oder dichten Kolonien enthält, müssen die Zellen nicht verpackt, sondern täglich gefüttert werden.

Bringen Sie die Zellen in die biologische Sicherheitswerkbank. Nehmen Sie den Deckel der Kulturschale ab und saugen Sie das verbrauchte Medium ab. Lassen Sie die Spitze der Pipette keinen anderen Teil der Platte berühren als direkt in den Vertiefungen.

Unter Verwendung einer sterilen Glaspipette in der entsprechenden Menge warmer humaner ES-Zellkultur, Medium in jede Vertiefung für Kulturen in einer Sechs-Vertiefung-Platte mit 2,5 Millilitern Medium pro Vertiefung, nachdem die Zellen gefüttert wurden, wird die Platte wieder in den Inkubator zurückgeführt. Die Differenzierung findet häufig an den Rändern menschlicher embryonaler Stammzellkolonien statt. Mit Hilfe eines Mikroskops und eines sterilen Picking-Tools können die differenzierten Zellen schonend vom Rand der Kolonie entnommen werden, wobei die undifferenzierten Zellen zurückbleiben.

Für die fortgesetzte Kultivierung kann das gleiche Verfahren angewendet werden, wenn differenzierte Zellen aus dem Zentrum einer Kolonie entnommen werden, wobei ein Ring aus undifferenzierten menschlichen ES-Zellen um den Bereich der Zellen herum verbleibt, die entnommen wurden. Wenn die Kultur mehr als ca. 10 % differenzierende Kolonien enthält, sollten die Zellen gereinigt werden, indem die differenzierten Bereiche manuell entfernt werden. Um dies zuerst zu tun, verwandeln Sie neun Zoll großes Glas an Ihren Pipetten vorbei in Pickwerkzeuge.

Achten Sie beim Formen der Spitzen über der kontrollierten Flamme eines Alkoholbrenners darauf, dass die Spitze der Pipette versiegelt ist, um eine Kontamination zu verhindern, und abgerundet ist. Um zu vermeiden, dass der Kunststoff der Kulturschale vor der Verwendung der Pflückwerkzeuge zerkratzt wird, sterilisieren Sie diese mit der UV-Lichtquelle in der biologischen Sicherheitswerkbank für 15 bis 20 Minuten. Um differenzierte Zellen zu entfernen, trennen Sie sie zunächst vom Rest der Kolonie, indem Sie mit dem Ende des Picking-Werkzeugs eine Linie durch die Kolonie ziehen.

Sobald die Stücke der Kolonie getrennt sind, gleiten Sie mit dem Pickwerkzeug vorsichtig über die Platte, um die unerwünschten Zellen zu lösen. Achte darauf, dass du bei diesem Prozess nicht zu viel von der Meth-Feeder-Schicht zwischen den Kolonien abkratzst. Wenn alle differenzierten Zellen aus der Platte entnommen wurden und im Medium schwimmen, bringen Sie die Kultur in die biologische Sicherheitswerkbank.

Das Medium, das die differenzierten Zellen enthält, wird aspiriert und durch eine frische humane ESL-Kultur ersetzt. Medium bis Durchgang. Menschliche E es Zellen.

Die Kolonien werden mit einer serologischen Pipette vorsichtig von der Oberfläche der Kulturplatte abgeschabt, nachdem nach einer kurzen Enzyminkubation alle zu durchlaufenden Vertiefungen abgeschabt wurden. Die Koloniestücke werden in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt und zentrifugiert, um ein locker gepacktes Zellpellet zu erhalten. Anschließend wird der Überstand entfernt und das Zellpellet wieder auf eine entsprechend große Zelle aufgewirbelt.

Aggregate durch Pipettieren in frischem humanem ESL-Medium. Nach dem Spülen einer neuen Kulturplatte, die eine frisch bestrahlte Meth-Feeder-Schicht enthält, werden die menschlichen E-es-Zellen gleichmäßig auf die Vertiefungen der neuen Platte verteilt und über Nacht anheften gelassen. Wenn die Kultur große oder dichte Kolonien enthält oder die MEF-Feeder-Schicht älter als 12 Tage ist, sollten die Zellen in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank transportiert werden.

Entfernen Sie den Deckel der Kulturschale mit sechs Vertiefungen und saugen Sie das verbrauchte Medium aus den zu durchleitenden Vertiefungen ab. Geben Sie mit einer sterilen Glaspipette einen Milliliter erwärmte Kollagenase vier in jede Vertiefung, die durchgelassen werden soll. Stellen Sie die Platte für fünf Minuten in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Beobachten Sie nach den fünf Minuten die Bienenvölker unter dem Mikroskop. Das Enzym sollte eine subtile, aber beobachtbare Veränderung an den Rändern der Kolonie bewirken. Sie werden definierter und es kann ein heller Halo um sie herum erscheinen.

In der biologischen Sicherheitswerkbank das Enzym vorsichtig aus jeder Vertiefung aspirieren und durch zwei Milliliter humane ES-Zellkultur ersetzen. Mittel. Kippen Sie die Kulturplatte leicht in Ihre Richtung und nehmen Sie die zwei Milliliter Medium auf. Halten Sie die Pipette in der ersten Vertiefung mit einer Fünf-Milliliter-Glaspipette senkrecht zum Boden der Platte und gleiten Sie vorsichtig mit der Pipettenspitze über die Vertiefung.

Während das Medium langsam freigesetzt wird. Wiederholen Sie diese Schabe- und Pipettierbewegung drei- bis viermal, bis alle Völker aus der Vertiefung entnommen wurden. Wenn die Zellen aus der ersten Vertiefung entnommen wurden, lassen Sie den Inhalt der Vertiefung und beginnen Sie, die Zellen aus der nächsten Vertiefung abzukratzen.

Wenn alle zu durchleitenden Vertiefungen abgeschabt wurden, wird das Medium, das die Kolonieteile aus jeder Vertiefung enthält, vorsichtig in einer sterilen 15-Milliliter-Pipette mit konischem Röhrchen zusammengefasst, um zu vermeiden, dass die Kolonien in zu kleine Stücke zerbrochen werden. Spülen Sie die abgekratzten Vertiefungen klein, indem Sie einen Milliliter ESL-Kultur hinzufügen. Mittel zu jedem.

Sammeln Sie diese Spülung gut und geben Sie sie in das konische Rohrrohr an den Zellen vorsichtig in der Röhre, um die Koloniestücke auf die gewünschte Größe aufzubrechen. Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 200 G zentrifugiert, während die menschlichen Zellen zentrifugiert werden. Bereiten Sie eine neue Meth-Feeder-Platte mit sechs Vertiefungen vor.

Beschriften Sie die Platte mit den entsprechenden Informationen über die humanen ES-Zellen, der Zelllinie, der neuen Passagenummer und dem Passagedatum. Saugen Sie das Meth-Medium aus den Vertiefungen ab und fügen Sie jeweils einen Milliliter PVS hinzu. Schwenken Sie den Puffer vorsichtig um die Vertiefungen herum und saugen Sie die PBS-Wäsche an.

Fügen Sie 1,5 Milliliter ESL-Kultur hinzu. In jede Vertiefung hineinversetzen und die Platte beiseite stellen. Nachdem die humanen ES-Zellen zentrifugiert wurden, bringen Sie das Röhrchen zurück in die biologische Sicherheitswerkbank.

Aspirieren Sie den Überstand. Achten Sie darauf, das lose gepackte Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen im Pellet mit ausreichend Medium für einen Milliliter menschlicher ESL-Kultur, Medium pro neuer Vertiefung, die plattiert werden soll.

Wenn Sie beispielsweise in sechs neue Vertiefungen aufteilen, reanimation, suspendieren Sie das Pellet in sechs Millilitern Medium. Pipettieren Sie die Kolonien vorsichtig, um die Stücke auf die richtige Größe aufzubrechen und die Koloniestücke gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede vorbereitete Vertiefung der MEF-Feederplatte.

Legen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und schieben Sie die Platte vorsichtig von vorne nach hinten und zur Seite, um die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius anheften. Differenzierte humane ES-Zellen können eine Reihe von Morphologien aufweisen, bestehen aber in der Regel aus größeren und weiter verteilten Zellen.

Die Differenzierung kann innerhalb einer Kolonie oder zwischen Völkern erfolgen. Dies sind die unterschiedlichen Morphologien menschlicher ES-Kulturen, die bei geringer Vergrößerung unter dem Mikroskop zu sehen sind. Eine gute Zell- und Koloniemorphologie sieht so aus.

Die Zellen sind sehr klein, dicht gepackt und wachsen in einer Monoschicht. Die Kolonien sollten saubere und definierte Ränder mit wenig bis gar keiner Differenzierung haben. Um gesunde menschliche ESL-Kulturen zu erhalten, müssen die Zellen zum optimalen Zeitpunkt durchgelassen werden.

Völker, die bereit für die Verpackung sind, haben fast ihre maximale Koloniegröße erreicht, aber noch nicht begonnen, miteinander zu verschmelzen oder sich zu differenzieren. Warten Sie nicht, bis die Kolonien überwuchert sind, um sie zu passieren. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie gesunde HES-Zellkulturen erhalten, wenn Sie diese Verfahren befolgen.

Stellen Sie sicher, dass Sie eine gute sterile Technik aufbewahren und immer ein Backup haben. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.