Name: Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-22T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie die Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen für die Stammzellbiologie. Dieses Protokoll zeigt Fütterung, Entfernung differenzierter Zellen und Passagierung zur Aufrechterhaltung undifferenzierter Zellen.

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1. Wartung: Observing Kulturen unter dem Mikroskop <ol><li> Entfernen einer Platte von hES-Zellen aus dem 37 ° C Inkubator und bringen dem Mikroskop. </li><li> Beachten Sie die Kolonien bei niedriger Leistung, mit 2X oder 5fache Vergrößerung, um die gesamte Kultur Qualität zu beurteilen. Beachten Sie die folgenden: normal mittel Farbe, das Fehlen von sichtbaren Verunreinigungen insgesamt Kolonie Größe, Qualität und Dichte, und andere Beobachtungen. </li><li> Beachten Medium Farbe ändert. Durch die Veränderung des pH und die Erschöpfung der Nährstoffe in das Medium nach einer Inkubation über Nacht mit der hES-Zellen wird das Medium von einem roten Farbton zu einem &quot;Stroh&quot; Farbe zu ändern. Wenn das Medium erscheint lila, hat einen basischen pH-Verschiebung stattgefunden. Wenn das Medium erscheint extrem gelb, hat das Medium angesäuert. Sehr gelb Medium kann das Ergebnis der extrem überfüllten Kolonien in den Brunnen oder Verunreinigungen sein. Das Medium erscheinen soll zu jeder Zeit klar. Obwohl ein gewisses Maß an Zelltrümmer in das Medium ist normal, sollte es nie erscheinen trübe. Wenn ein hohes Maß an Zelltrümmer beobachtet wird, ist die Kultur nicht gesund und können kontaminiert sein. </li><li> Wenn die Kulturen nicht gewartet werden müssen oder die Passage, können sie um die biologische Sicherheit Schrank eingespeist (siehe Abschnitt 2) werden entnommen werden. </li><li> Wenn die Kulturen mehr als etwa 10% Differenzierung Kolonien enthalten, sollten die Zellen &quot;aufgeräumt&quot; werden durch manuelles Entfernen der differenzierten Bereiche (siehe Abschnitt 3). </li><li> Wenn die Kulturen groß oder dichten Kolonien enthalten, oder die MEF Feeder-Schicht ist mehr als 12 Tage alt sind, sollten die Zellen passagiert (siehe Abschnitt 4). </li></ol> 2. Feeding hES-Zellen <ol><li> In einer sterilen Sicherheitswerkbank, entfernen Sie den Deckel der Kulturschale und saugen die verbrauchte Medium. Nicht in die Spitze der Pipette auf einen Teil der Platte außer direkt in die Vertiefungen berühren. Wenn es irgendeine Sorge der Kontamination, um eine neue, sterile Pipette ändern. </li><li> Mit einem sterilen Glaspipette, fügen Sie die entsprechende Menge erwärmt hES-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung. Für Kulturen in einer 6-Well-Platte, fügen Sie 2,5 ml Medium pro Vertiefung. </li><li> Bringen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 bleiben. </li></ol> 3. Entfernen Differenzierung von hES-Zell-Kulturen <ol><li> Transform 9-Zoll-Glas Pasteur Pipetten in Kommissionierung Werkzeuge durch Formen der Spitzen über die kontrollierte Flamme eines Spiritusbrenner. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Pipette verschlossen ist, um eine Kontamination zu verhindern und abgerundeten um Kratzer zu vermeiden Kunststoff der Kulturschale. Sterilisieren die Kommissionierung Werkzeuge vor dem Einsatz mit den UV-Lichtquelle in der biologischen Sicherheitswerkbank oder Kommissionierung Gehäuse. </li><li> Entfernen Sie die differenzierte Bereiche. Differenzierung tritt oft nur in einem Teil eines hES-Zell-Kolonie, in der Regel an den Rändern oder als isolierte Flecken in der Mitte. Wenn nur ein Abschnitt einer Kolonie ist differenziert, muss nur die differenzierte Bereich entfernt werden. Differenzierung kann oft abheben der Platte in eine &quot;klebrige&quot; Blatt, und es ist hilfreich, zunächst getrennt die differenzierten Zellen aus dem Rest der Kolonie durch Ziehen einer Linie durch die Kolonie mit dem Ende der Kommissionierung-Tool. </li><li> Sobald die Teile der Kolonie getrennt sind, sanft gleiten die Kommissionierung-Tool auf der Platte, um die unerwünschten Zellen zu lösen. Achten Sie darauf, nicht zu kratzen weg zu viel von der MEF Feeder-Schicht zwischen den Kolonien in diesem Prozess. </li><li> Wenn alle differenzierten Zellen von der Platte (und variabel im Medium) entfernt werden, wieder die Kultur die biologische Sicherheitswerkbank. Saugen Sie das Medium mit den differenzierten Zellen und ersetzen mit frischen hES-Zell-Kulturmedium. </li></ol> 4. Passagierung hES-Zellen Enzyminkubation <ol><li> In einer sterilen Sicherheitswerkbank, entfernen Sie den Deckel des 6-well Kulturschale und saugen die verbrauchte Medium aus den Vertiefungen zu passagiert werden. Nicht in die Spitze der Pipette auf einen Teil der Platte außer direkt in die Vertiefungen berühren. </li><li> Mit einem sterilen Glaspipette, 1 mL erwärmt Kollagenase IV für jeden gut zu passagiert werden. </li><li> Bringen Sie die Platte um die 37 ° C Inkubator für 5 Minuten. </li></ol> Kratzen und Pooling der HES-Zellen <ol start="4"><li> Nach Inkubation der Zellen mit Kollagenase, beobachten die Kolonien unter dem Mikroskop. Das Enzym sollte zu einem feinen, aber beobachtbare Veränderung in der Kolonie Kanten. </li><li> In der biologischen Sicherheitswerkbank, sanft saugen das Enzym aus jedem Well und ersetzen mit 2,0 mL hES-Zell-Kulturmedium. </li><li> Tipp der Kulturplatte leicht in Ihre Richtung und nehmen die 2,0 ml Medium in die erste Bohrung mit einer 5 ml Glaspipette. Halten Sie die Pipette senkrecht zur Unterseite der Platte, sanft gleiten die Pipettenspitze über die gut, während langsam die Freigabe der Mittel. </li><li> Wiederholen Sie die Schaben und pipetting Bewegung 3-4 mal, bis alle Kolonien aus dem Brunnen entfernt. Pipettieren vorsichtig, um zu vermeiden Aufbrechen der Kolonien in zu kleine Stücke. Wenn die Zellen aus der ersten Bohrung entfernt worden sind, lassen Sie den Inhalt in den Brunnen und beginnen Abschaben der Zellen aus der nächsten gut. </li><li> Wenn alle Brunnen passagiert werden wurden abgekratzt, Pool das Medium mit der Kolonie Stücke aus jeder Vertiefung in ein steriles 15 ml konischen Rohr. </li><li> Spülen Sie den abgeschabt Brunnen durch Zugabe von 1 ml hES-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung. Sammeln Sie diese gründlich und Transfer zum konischen Rohr. </li><li> Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig in das Rohr zum Aufbrechen der Kolonie Stück bis die gewünschte Größe. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 200 x g. </li></ol> Plating der hES-Zell-Cells <ol start="12"><li> Während die hES-Zellen in der Zentrifuge sind, bereiten eine neue 6-well MEF Feeder Platte. Beschriften Sie die Platte mit den entsprechenden hES-Zell-Informationen: Zell-Linie, neue Passage-Nummer und Datum Durchgang. Saugen Sie das MEF Medium aus dem Brunnen und 1,0 ml PBS in jede Vertiefung. Vorsichtig schwenken die Puffer um den Brunnen und saugen Sie den PBS waschen. Fügen Sie 1,5 ml hES-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung und stellte den Teller beiseite. </li><li> Wenn der hES-Zellen fertig sind Zentrifugieren, bringen die Röhre zurück, um die biologische Sicherheitswerkbank. Den Überstand aspirieren, darauf achten, daß die lose verpackt Zellpellet stören. </li><li> Resuspendieren der Zellen in das Pellet mit genügend Medium für 1 mL hES-Zell-Kulturmedium pro Vertiefung zu plattiert werden. Bei der Aufteilung in 6 neue Brunnen, das Pellet in 6 ml Medium. </li><li> Sanft und gleichmäßig 1 mL der Zellsuspension auf jeweils gut vorbereitet der MEF Feeder Platte. </li><li> Legen Sie die Platte in die 37 ° C Inkubator und vorsichtig die Platte nach vorne nach hinten und seitlich zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen im ganzen gut. </li><li> Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C über Nacht befestigen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Undifferenzierte hES-Zellen sind klein, dicht aneinander, und in der Regel von größeren, ausbreiten Zellen bestehen. Differenzierung kann innerhalb einer Kolonie (Abbildung 1A) oder zwischen Kolonien (Abbildung 3B) auftreten. Verschiedene morhopologies unter geringer Vergrößerung unter dem Mikroskop gesehen werden. Eine gute Zellmorphologie, wie in Abbildung 2A zu sehen, enthält kleine, dicht gepackte Zellen, die in einer Monoschicht wachsen. Zellen sollten sauber, definierte Kanten, mit wenig bis gar keine Differenzierung. Die Zellen in Abbildung 2B dargestellt sind bereit für die Passage, und die Zellen in der Abbildung 2C dargestellt sind überfüllt. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Differenzierung in hES Kulturen. (A) Differenzierung von einer Kolonie (B) Unterscheidung zwischen Kolonien. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Morphologien in hES Kulturen gesehen. (A) gute Zellmorphologie (B) hES-Zellen, die bereit sind für die Passage (C) überfüllten Zellen sind.

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique</a>. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).</li>
</ol>

Sterilität muss jederzeit gewährleistet sein, wenn die Arbeit mit hES-Zellen. Reinigung und Sterilisation der biologischen Sicherheitswerkbank und alle Geräte vor dem Einsatz. Alle Reagenzien müssen gefiltert durch ein 0,22 um Filter mit einer Porengröße vor dem Gebrauch werden. Die Verwendung von antiboiotics in hES-Zell-Kultur ist nicht notwendig und sollte vermieden werden. Eine separate Umwelt sollte als Designated Kommissionierplatz eingestellt werden. Die sterile Umhüllung für die Station kann eine statische Gehäuse (z. B. PCR-Workstation) mit einer UV-Lichtquelle, einer Sterilbank oder einer biologischen Sicherheitswerkbank werden. Ein Binokular in der Kommissionierung Station wird benötigt, um die Kolonien zu beobachten, wie die differenzierte Bereiche entfernt werden. Die Frontscheibe eines statischen Gehäuse oder einer biologischen Sicherheitswerkbank muss geändert werden, um für die Okulare des Mikroskops ermöglichen, um durch die Fenster, ohne eine ausreichende Belüftung und Sterilität zu verlängern. Um gesund zu erhalten hES-Zell-Kulturen, müssen die Zellen zum optimalen Zeitpunkt passagiert werden, in der Regel alle 4-7 Tage. In dieser Zeit der Kolonien haben ihre maximale Größe erreicht und kann beginnen zu verschmelzen. Zusammengeführt Kolonien kann die Geschwindigkeit der Differenzierung in der Kultur zu erhöhen. Split-Verhältnisse in der Regel fallen 1.03 bis 01.05 Uhr, abhängig von der Anzahl der Kolonien plattiert, Expansionsrate und Kulturbedingungen. Overplated Kolonien (Split-Verhältnis zu niedrig) wird wahrscheinlich vorzeitig fusionieren und müssen passagiert werden, bevor sie ihre maximale Größe erreicht. Kulturen auf einer MEF Feeder-Schicht, die mehr als 2 Wochen alt ist, muss auf neue MEFs dass undifferenzierte Wachstum und die Vermehrung Unterstützung passagiert werden. Da die Differenzierung von Natur aus in hES-Zell-Kulturen, wird eine kleine Menge erwartet. Häufige oder starke Differenzierung kann auftreten, wenn die Kulturen nicht erhalten eine angemessene Pflege. Die Zellen zugeführt werden muß jeden Tag sein sollte Überwucherung zwischen Passagen vermieden werden. Verwenden Sie stets frischen Reagenzien. Alle Medien, MEFs und Reagenzien sollten innerhalb von 14 Tagen genutzt werden, um undifferenzierte hES-Zell-Wachstum zu vermeiden. New viele Reagenzien, wie Knockout Serum Replacement, FBS und MEFs, sollte vor gescreent werden, um zu verwenden. Denken Sie daran, dass alle differenzierten Zellen nicht vor Passagierung entfernt, um den neuen Kulturen übertragen werden. Versuchen Sie auch, die Zellen bei 37 ° C, wann immer möglich zu halten. Minimieren Sie die Zeit der Zellen verbringen außerhalb des Inkubators (zB am Mikroskop der Bühne oder im biologischen Sicherheitsschrank.) Ein beheizter Mikroskoptisch kann sehr vorteilhaft, wenn die Zellen des Inkubators für längere Zeit sein. Bei der Betrachtung der hES-Zell-Kulturen unter dem Mikroskop, zunächst zu prüfen, die Qualität und Größe der Kolonien Blick mit einem Low-Power-(2x oder 5x) Ziel. Wenn potentiell differenzierten Zellen bei geringer Leistung beobachtet werden, bestätigen die differenzierte Morphologie mit einer höheren Vergrößerung Objektiv (10-fach). Sofort nach dem Entfernen Differenzierung, können die Ränder der Kolonien gezackt oder beschädigt. Inkubieren Sie die Kolonien über Nacht in frisches Medium, damit die verbleibenden undifferenzierte Zellen sich zu erholen. Ohne den Einfluss der Differenzierung in der Kultur, werden diese verbleibenden Kolonien weiterhin normal vermehren. Wenn möglich, beginnen Experimente mit low-Passage hES-Zellen. Karyotyp der Zellen vor und nach alle wichtigen Experimente.

<table><tbody><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Für MEF-Medium</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS), zertifiziert</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>Hitzeinaktiviert&lt;br/&gt;Für MEF-Medium</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knockout&amp;#8482;-Serumersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Vorab testen, um Unterstützung von hES-Zellen sicherzustellen</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>Endkonzentration [4 ng/mL] verwenden</td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100X)&lt;br/&gt;Endkonzentration [1X] verwenden</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Ohne Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; oder Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Frische Lösung mit 1 mg/mL in D-MEM/F-12 herstellen</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Typ A, porcin</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS), definiert</td><td>Hyclone</td><td>SH300.70.01</td><td>Für Einfriermedium</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140675</td><td>Für allgemeine Kultur</td></tr><tr><td>4-Well-Platten</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td>Für Auftauen</td></tr><tr><td>5-mL-Glaspipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27E</td><td>Individuell verpackt</td></tr><tr><td>Kegelröhrchen, 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>Polypropylen</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>9&amp;#8221; Glas</td></tr></tbody></table>

kultur und wartung von humanen embryonalen stammzellen

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) müssen überwacht und gepflegt werden, um gesunde, undifferenzierten Kulturen zu erhalten. Zumindest müssen die Kulturen täglich gefüttert, indem er umfassende Medium ändern, um verlorenen Nährstoffe wieder aufzufüllen und die Kulturen frei von unerwünschten Differenzierungsfaktoren zu halten. Obwohl eine kleine Menge der Differenzierung ist normal und erwartet in Stammzell-Kulturen, sollte die Kultur regelmäßig gereinigt werden, um manuell entfernen oder &quot;picking&quot; differenzierte Bereiche. Erkennen und Entfernen von überschüssigem Differenzierung von hES-Zell-Kulturen sind wesentliche Techniken in der Erhaltung einer gesunden Population von Zellen.

Dieses Protokoll zeigt, wie man gesunde, undifferenzierte humane embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu halten.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) müssen überwacht und gepflegt werden, um gesunde, undifferenzierte Kulturen aufrechtzuerhalten. Mindestens müssen die Kulturen ...

Hallo, ich bin Leah Kent von STEM Gent. Heute zeigen wir Ihnen die Verfahren zum Füttern, Entdifferenzieren und Verpacken menschlicher embryonaler Stammzellen. In unserem Labor verwenden wir diese Techniken zur routinemäßigen Kultur und Pflege von HES-Zellen.Beginnen wir also. Die allgemeine Kulturqualität wird durch die Beobachtung der Kolonien bei niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung mit zwei- oder f&uuml;nfmaliger Vergr&ouml;&szlig;erung beurteilt. Wenn Sie die Zellen unter dem Mikroskop betrachten, achten Sie auf die folgenden Merkmale: normale Farbe des Mediums, Abwesenheit sichtbarer Kontaminationen, Koloniengr&ouml;&szlig;e und -dichte sowie die Gesamtqualit&auml;t der Zellen.Das frische Kulturmedium für humane ES-Zellen hat normalerweise nach einer Übernacht-Inkubation eine orange- oder strohfarbene Färbung. Das Kulturmedium erscheint oft gelber aufgrund einer pH-Änderung und der Erschöpfung der Nährstoffe im Medium. Wenn das Medium, wie in diesem Beispiel gezeigt, violett erscheint, ist eine basische pH-Verschiebung aufgetreten.Wenn das Medium extrem gelb erscheint, hat es sich angesäuert, was auf stark überwucherte Kolonien oder eine Kontamination zurückzuführen sein kann. Das Medium sollte stets klar aussehen. Wenn die Kultur keine großen oder dichten Kolonien enthält, müssen die Zellen nicht passagiert, aber täglich versorgt werden.Bringen Sie die Zellen in den biologischen Sicherheitswerkbank. Entfernen Sie den Deckel der Kulturschale und aspirieren Sie das verbrauchte Medium. Lassen Sie die Pipettenspitze nicht mit einem anderen Teil der Platte in Berührung kommen, außer direkt innerhalb der Vertiefungen.Unter Verwendung einer sterilen Glaspipette die geeignete Menge warmes menschliches ES-Zellkulturmedium zugeben, und zwar 2,5 ml Medium pro Brunnen für Kulturen in einer 6-Brunnen-Platte; nachdem die Zellen versorgt wurden, die Platte in den Inkubator zurückstellen. Differenzierung tritt üblicherweise an den Rändern von Kolonien menschlicher embryonaler Stammzellen auf. Mithilfe eines Mikroskops und eines sterilen Picking-Tools können die differenzierten Zellen vorsichtig vom Rand der Kolonie entfernt werden, wobei die undifferenzierten Zellen zurückbleiben.Für die fortgesetzte Kultur kann das gleiche Verfahren angewendet werden, wenn differenzierte Zellen aus der Mitte einer Kolonie entfernt werden, wobei ein Ring undifferenzierter humaner ES-Zellen um den Bereich der entfernten Zellen herum belassen wird. Wenn die Kultur mehr als etwa 10 % differenzierende Kolonien enthält, sollten die Zellen durch manuelle Entfernung der differenzierten Bereiche gereinigt werden. Um dies zu tun, verwandeln Sie zunächst neun Zoll lange Glas-Pipetten in Picking-Tools.Formen Sie die Spitzen über der kontrollierten Flamme eines Alkoholbrenners so, dass die Pipettenspitze versiegelt ist, um Kontaminationen zu verhindern, und runden Sie sie ab. Um Kratzer auf dem Kunststoff der Kulturschale zu vermeiden, sterilisieren Sie die Picking-Tools vor der Verwendung 15 bis 20 Minuten lang mit der UV-Lichtquelle im biologischen Sicherheitswerkbank. Um differenzierte Zellen zu entfernen, trennen Sie sie zuerst vom Rest der Kolonie, indem Sie mit dem Ende des Picking-Tools eine Linie durch die Kolonie ziehen.Nachdem die Koloniestücke getrennt wurden, gleiten Sie vorsichtig mit dem Picking-Instrument über die Platte, um die unerwünschten Zellen zu lösen. Achten Sie darauf, bei diesem Vorgang nicht zu viel der Meth-Unterlage zwischen den Kolonien abzukratzen. Sobald alle differenzierten Zellen von der Platte entfernt und in dem Medium schwimmen, bringen Sie die Kultur in den biologischen Sicherheitswerkbank.Entfernen Sie das Medium, das die differenzierten Zellen enthält, und ersetzen Sie es durch frisches menschliches ESL-Kulturmedium zum Passagieren. Menschliche EES-Zellen.Die Kolonien werden nach einer kurzen Enzyminkubation, bei der alle Vertiefungen passagiert werden sollen, vorsichtig mit einer serologischen Pipette von der Oberfläche der Kulturschale abgeschabt. Die Koloniestücke werden in einem 15-Milliliter-Konischgefäß gesammelt und zentrifugiert, um einen locker gepackten Zellpellet zu erhalten. Der Überstand wird anschließend entfernt und der Zellpellet in passend große Zellen resuspendiert.Aggregieren Sie durch Pipettieren in frischem menschlichem ESL-Medium. Nach dem Spülen einer neuen Kulturplatte, die eine frisch bestrahlte MEF-Trägerschicht enthält, werden die menschlichen ES-Zellen gleichmäßig auf die Vertiefungen der neuen Platte verteilt und über Nacht anheften lassen. Wenn die Kultur große oder dichte Kolonien enthält oder die MEF-Trägerschicht älter als 12 Tage ist, sollten die Zellen in einem sterilen biologischen Sicherheitswerkbank passagiert werden.Entfernen Sie den Deckel der 6-Loch-Kulturplatte und aspirations das verbrauchte Medium aus den zu passierenden Vertiefungen. Geben Sie mit einer sterilen Glaspipette je einen Milliliter vorgewärmtes Kollagenase 4 in jede zu passierende Vertiefung. Stellen Sie die Platte für fünf Minuten in den 37 °C-Inkubator zurück.Nach den fünf Minuten die Kolonien unter dem Mikroskop beobachten. Das Enzym sollte eine subtile, aber beobachtbare Veränderung der Kolonieränder hervorrufen. Diese werden deutlicher abgegrenzt, und ein heller Hof kann sich um sie herum bilden.Aspirieren Sie im biologischen Sicherheitswerkbank vorsichtig das Enzym aus jedem Brunnen und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter humanen ES-Zellkulturmedium. Kippen Sie die Kulturplatte leicht zu sich hin und nehmen Sie die zwei Milliliter Medium auf. Geben Sie im ersten Brunnen mit einer fünf-Milliliter-Glaspipette, wobei Sie die Pipette senkrecht zum Boden der Platte halten, die Pipettenspitze vorsichtig über den Brunnen.Währenddessen das Medium langsam abgegeben wird. Wiederholen Sie diese Schab- und Pipettierbewegung drei bis vier Mal, bis alle Kolonien aus der Vertiefung entfernt wurden. Sobald die Zellen aus der ersten Vertiefung entfernt wurden, lassen Sie den Inhalt in der Vertiefung und beginnen Sie mit dem Abkratzen der Zellen aus der nächsten Vertiefung.Wenn alle zu passierenden Vertiefungen abgeschabt wurden, sammeln Sie das Medium mit den Koloniestücken aus jeder Vertiefung in einem sterilen 15-Milliliter-Konischkolben und pipettieren Sie vorsichtig, um zu verhindern, dass die Kolonien in zu kleine Stücke zerfallen. Spülen Sie die abgeschabten Vertiefungen, indem Sie je ein Milliliter menschliches ESL-Kulturmedium hinzufügen.Sammlen Sie diese Spülung und überführen Sie sie in das kegelförmige Reagenzglas. Pipettieren Sie vorsichtig in das Reagenzglas, um die Koloniestücke auf die gewünschte Größe zu zerkleinern. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 ×g, während die humanen ES-Zellen zentrifugiert werden. Bereiten Sie eine neue sechs-well-Meth-Feeder-Platte vor.Beschriften Sie die Platte mit den entsprechenden Angaben zur humanen ES-Zelllinie, der neuen Passage-Nummer und dem Passagierungsdatum. Aspirieren Sie das Meth-Medium aus den Vertiefungen und geben Sie je einen Milliliter PVS hinzu. Schwirbeln Sie den Puffer vorsichtig in den Vertiefungen um und aspirieren Sie die PBS-Waschung.Geben Sie 1,5 Milliliter menschliche ESL-Kulturmedium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte beiseite. Nachdem die menschlichen ES-Zellen zentrifugiert wurden, bringen Sie das Röhrchen zurück in den biologischen Sicherheitswerkbank.Aspirieren Sie den Überstand. Achten Sie darauf, das locker gepackte Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen im Pellet in ausreichend Medium für ein Milliliter humane ESL-Kulturmedium pro neue Vertiefung, die beimpft werden soll.Beispielsweise bei Aufteilung auf sechs neue Wells resuspendieren Sie das Pellet in sechs Milliliter Medium. Pipettieren Sie die Kolonien vorsichtig, um die Stücke auf die geeignete Größe zu zerkleinern und gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie ein Milliliter der Zellsuspension in jedes vorbereitete Well der MEF-Futtererplatte.Stellen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator und schieben Sie die Platte vorsichtig von vorne nach hinten und von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius anheften. Differenzierte humane ES-Zellen können eine Vielzahl von Morphologien aufweisen, bestehen jedoch gewöhnlich aus größeren und stärker ausgebreiteten Zellen.Die Differenzierung kann innerhalb einer Kolonie oder zwischen Kolonien auftreten. Dies sind die verschiedenen Morphologien von menschlichen ES-Kulturen, die bei geringer Vergrößerung unter dem Mikroskop sichtbar sind. Eine gute Zell- und Kolonienmorphologie sieht folgendermaßen aus.Die Zellen sind sehr klein, dicht gepackt und wachsen in einer Monoschicht. Die Kolonien sollten saubere und gut definierte Ränder aufweisen und kaum bis keine Differenzierung zeigen. Um gesunde humane ESL-Kulturen aufrechtzuerhalten, müssen die Zellen zum optimalen Zeitpunkt weitergegeben werden.Kolonien, die zur Verpackung bereit sind, haben nahezu ihre maximale Größe erreicht, haben sich jedoch noch nicht miteinander verschmolzen oder differenziert. Warten Sie nicht, bis die Kolonien überwachsen sind, bevor Sie sie passagieren. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie Sie gesunde HES-Zellkulturen pflegen können, wenn Sie diese Verfahren befolgen.Stellen Sie sicher, dass Sie eine gute sterile Technik anwenden, und legen Sie stets eine Sicherungskopie an. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Hier präsentieren wir Kulturprotokolle für humane pluripotente Stammzellen (hPSC), die auf dem Wachstum von dissoziierten Einzelzellen basieren. Diese neue Methode, bei der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitoren oder die Laminin-Isoform 521 (LN-521) verwendet werden, eignet sich für die Herstellung großer Mengen homogener hPSCs, die genetische Manipulation und die Wirkstoffforschung.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Dieses Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) zu vermehren, indem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta in einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder hPSC-spezifische synthetische Substrate.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung von ruhenden humanen hämatopoetischen Stammzellen in vitro, indem die Mikroumgebung des Knochenmarks mit reichlich Fettsäuren, Cholesterin, niedrigeren Konzentrationen von Zytokinen und Hypoxie imitiert wird.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Um die Einschränkungen zu vermeiden, die mit der enzymatischen oder mechanischen Passage von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) verbunden sind, die auf Feederzellen kultiviert wurden, haben wir eine schnelle, effektive, kosteneffiziente und ertragreiche Methode zur Gewinnung von hESC- oder hiPSC-Kolonien etabliert, die auf einer Feederzellschicht menschlicher Vorhautfibroblasten gehalten werden, indem wir EDTA-vermittelte...

Schnelle, kostengünstige, enzymfreie Passage von humanen pluripotenten Stammzellen auf Feederzellen durch Ethylendiamintetraessigsäure-vermittelte Disadhäsion

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Lernen Sie die Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen für die Stammzellbiologie. Dieses Protokoll zeigt Fütterung, Entfernung differenzierter Zellen und Passagierung zur Aufrechterhaltung undifferenzierter Zellen.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

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