Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Hallo, mein Name ist Brad Hamilton. Ich bin in der Forschungs- und Entwicklungsabteilung hier bei STEM Gen. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, wie man induzierte pluripotente Stammzellen aus embryonalen Fibroblasten der Maus erzeugen kann.

Dieses Verfahren kann sowohl zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen als auch zur Untersuchung des Reprogrammierungsprozesses verwendet werden. Also lasst uns loslegen. Beginnen Sie damit, embryonale Fibroblasten oder Meth-Zellen der Maus auf eine 15 Zentimeter große, mit Gelatine überzogene Schale zu säen, mit einer Dichte von viermal 10 der fünften Zellen pro Schale.

Gib nun 30 Milliliter Meth-Wachstumsmedium hinzu und inkubiere die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis sie zu etwa 80 % zusammenfließen. Wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie, aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 30 Milliliter Wachstum hinzu. Medium ergänzt mit konzentriertem Lentivirus.

Schütteln Sie die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei die Virustransduktion abgeschlossen ist. Kommen wir zur Doxycyclin-induzierten Reprogrammierung.

Um 20 bis 24 Stunden nach der Transduktion mit der Reprogrammierung zu beginnen, werden die Zellen transduziert und fünf Minuten lang bei 200 G zentrifugiert. Saugen Sie anschließend das Medium vorsichtig aus dem Zellpellet ab und resuspendieren Sie die Zellen im Wachstumsmedium. Nach dem suspendierten Samen wird der transduzierte Mes in einer für die von Ihnen verwendeten Zellkulturschalengröße geeigneten Konzentration transduziert.

Hier verwenden wir 2,5 mal 10 bis fünfte Zellen pro 10-Zentimeter-Schale für Reprogrammierungseffizienz-Experimente und IPS-Kolonieisolierung und zweimal 10 bis vierte Zellen pro Well in vier Well-Platten für immunchemische Experimente. Um die Transduktionseffizienz zu überwachen, inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. In diesem Stadium können die Zellen bei Bedarf für die zukünftige Analyse in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.

Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium und ersetzen es durch frisches Wachstumsmedium, das mit Doxycyclin bis zu einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter ergänzt wurde. Wir fügen eine Negativkontrolle hinzu, die ein Medium ohne Doxycyclin enthält. Zum Schluss inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Wir haben den Prozess der Neuprogrammierung eingeleitet. Im allgemeinen. Pluripotente Stammzellkolonien sind nach 16 bis 22 Tagen groß genug für eine Isolierung.

Bevor wir dieses Verfahren demonstrieren, müssen wir zunächst die Transduktionseffizienz mit Hilfe der Chemie überprüfen, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen. Immunchemische Tests werden an den Zellen durchgeführt, die 48 Stunden nach der Doxycyclin-Induktion in vier Well-Platten neu plattiert werden. Alle in diesem Protokoll aufgeführten Volumina sollten entsprechend der Größe der Zellkulturplatte angepasst werden: Beginnen Sie mit dem vorsichtigen Waschen der Zellen.

Sobald PBS keine Magnesium- oder Kalziumionen enthält, fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 500 Mikrolitern 4%-Paraformaldehyd in PBS. Waschen Sie die Zellen bei Raumtemperatur nochmals zweimal vorsichtig mit PBS. Als nächstes permieren Sie die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter eiskaltes 0,2%Tween 20 in PBS hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nachdem die Zellen noch zwei Mal gewaschen wurden. Geben Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Geben Sie nun 200 Mikroliter des gewünschten Primärantikörpers hinzu.

Hier verwenden wir die Pluripotenzmarker T 4K LF four, SOX two und cmic. Inkubieren Sie die Zellen am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS gewaschen haben, inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern Sekundärantikörper, um die Platten vor Licht zu schützen.

Hier verwenden wir die entsprechenden Sekundärantikörper, die mit Fluor-Fours konjugiert sind, zur Visualisierung, wobei wir nach der Inkubation ein inverses Fluoreszenzmikroskop verwenden. Waschen Sie die Zellen noch zwei weitere Male, fügen Sie dann DPI hinzu und inkubieren Sie erneut 10 Minuten lang, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Zum Schluss nach einer letzten Wäsche antifa aqua mount hinzufügen, bevor die Zellen mit dem inversen Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden, um die Transduktionseffizienz zu bestimmen.

Beginnen Sie mit der Isolierung und Vermehrung von pluripotenten Stammzellen. Überwachen Sie die Kulturen nach Beginn des Reprogrammierungsprozesses jeden Tag und wechseln Sie alle 48 Stunden das geeignete Medium. Wir verwenden Doxycyclin-supplementiertes Medium, um die Zellen für die ersten 12 Tage zu kultivieren, und entfernen dann das Doxycyclin aus dem Medium zu diesem Medium.

Die induzierten pluripotenten Stammzell- oder IPS-Kolonien, die manuell für die Expansion entnommen werden, sind Doxycyclin. Unabhängige Zellen sollten täglich auf morphologische Veränderungen überwacht werden, die auf den Reprogrammierungsprozess hinweisen. Jedes Experiment wird anders sein, aber die Kolonien sind im Allgemeinen groß genug für die Isolierung zwischen 16 und 22 Tagen nach der DS-Induktion, dem Tag bevor Sie mit dem Prozess der Isolierung und Trypsin-Reprogrammierung der Kolonien beginnen.

Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie eine gammabestrahlte Feeder-Schicht aus Mets mit einer Dichte von fünfmal 10 auf die vierte Zelle pro Well aussäen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag entnehmen Sie jede IPS-Kolonie manuell und tryps anisieren, um die Zellaggregate zu dissoziieren, die IPS-Zellen in embryonalem Stammzellmedium der Maus in den einzelnen Vertiefungen der vorhergehenden 24-Well-Platte abzustoßen, die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu inkubieren.

Wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden. Überwachen Sie die IPS-Kolonien täglich auf Wachstum und GFP-Fluoreszenz. Wir inkubierten unsere Kulturen sechs Tage lang, bevor wir sie für die Pluripotenzanalyse auf Vier-Well-Platten verpackten.

Bestimmen Sie, welche Vertiefungen der 24-Radplatte GFP-Platten gleichmäßig exprimieren. Vertiefungen mit guter GFP-Expression können tripps, inisiert und von eins bis acht in vier Vertiefungsplatten durchgelassen werden, denen gammabestrahlte Feeder-Schichten von Mes vorausgegangen sind. Diese Platten können dann für die ICC-Analyse auf Pluripotenz verwendet werden, um mit der Pluripotenzanalyse zu beginnen. Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS, das keine Magnesium- oder Kalziumionen enthält.

Fügen Sie 0,5 Milliliter eiskalte 0,2% pro Well zwischen 20 PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang. Nach drei weiteren Wäschen in PBS blockieren, unspezifische Bindung mit 200 Mikrolitern Blockpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Geben Sie nun 200 Mikroliter des gewünschten Primärantikörpers hinzu.

Hier haben wir SSEA, ein Nanog und OCT vier verwendet, um die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Nachdem Sie die Zellen zweimal vorsichtig gewaschen haben, inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern Sekundärantikörpern und halten Sie sie lichtgeschützt. Hier verwenden wir die entsprechenden Sekundärantikörper, die mit Fluorkraft konjugiert sind, zur Visualisierung, verwenden ein inverses Fluoreszenzmikroskop nach zwei weiteren Wäschen, fügen DPI hinzu und inkubieren die Zellen für 10 Minuten.

Fügen Sie nun nach einer letzten Wäsche antifa aqua mount hinzu, bevor Sie die Zellen mit dem inversen Fluoreszenzmikroskop abbilden. IPS-Kolonien können auch mit kommerziell erhältlichen Kits auf alkalische Phosphataseaktivität analysiert werden. Das induzierbare Maus-TF-Lentivirus-Set kann verwendet werden, um mes nach Transduktion der MES-Expression von Transkriptionsfaktoren zu IPS-Zellen umzuprogrammieren.

T vier, SOX zwei, KLF vier und seic können in mit Doxycyclin behandelten Zellen nachgewiesen werden, aber in unbehandelten Zellen kann nur eine geringe oder keine Expression nachgewiesen werden. Morphologische Veränderungen werden im Laufe der Zeit fortschreiten, um größere, ES-Zell-ähnliche Kolonien mit definierten Koloniekanten und dreidimensionalem Wachstum zu erzeugen. Wenn docs entfernt wird, kommt es bei einigen ES-Zell-ähnlichen Kolonien zu einer deutlichen Umkehrung der zellulären Morphologie.

Viele der Völker behielten jedoch ihre IPS-Morphologie bei. Diese IPS-Kolonien werden angezeigt, wenn sie gepickt und durchgelassen werden. Typische Pluripotenzmarker-Expression von alkalischer Phosphatase, nano T four und SSEA one.

Die Art der Methzellen, die in diesem Experiment verwendet wurden, exprimierte GFP aus dem endogenen Nag-Locus. Bei der Umprogrammierung in den Pluripotenzzustand kann die GFP-Expression daher als vorläufiger Indikator für eine erfolgreiche Reprogrammierung verwendet werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Reprogrammierung von embryonalen Fibroblasten der Maus induzieren können, um pluripotente Stammzellen zu induzieren, indem Sie ein antivirales System mit vier Transkriptionsfaktoren Doxycyclin-induzieren.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass beim Entwerfen von Reprogrammierungsexperimenten mehrere Variablen berücksichtigt werden sollten, um die Effizienz der Reprogrammierung zu optimieren. Erstens ist es möglich, das Verhältnis von aktivem Virus zu Zielzelle während des primären Infektionsschritts zu modifizieren, um die Transduktionseffizienz zu erhöhen oder zu verringern, wodurch die Anzahl der integrierten Viren in der Zielzellpopulation beeinflusst wird. Zweitens kann die Anpassung der Zeitspanne, in der die Zellen den Dokumenten ausgesetzt sind, die Anzahl der generierten IPS-Kolonien beeinflussen.

Drittens kann die proliferative Kapazität der Zielzellen die Reprogrammierung beeinflussen, da Zellen, die aktiv wachsen und sich teilen, für eine Reprogrammierung empfänglicher sind. Schließlich wird bei der Änderung des Protokolls für unterschiedliche Zellzahlen oder Gewebekulturschalen unterschiedlicher Größe empfohlen, dass die Zielzellzahlen proportional zur Oberfläche der Kulturschale angepasst werden. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.