Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Das Protokoll zeigt, wie humane induzierte pluripotente Stammzellen effizient aus vier Millilitern peripherem Blut erzeugt werden können. Isolieren und vermehren Sie am Tag Null die mononukleären Zellen aus der peripheren Blutprobe. Transduzieren Sie die Primärzellen mit dem Reprogrammierungsstamm-Co-Vektor.

Fahren Sie am neunten Tag fort, die transduzierten Zellen etwa drei Wochen lang auf inaktivierte Maus-, Embryonal-, Fibroblasten- und Kulturzellen aufzutragen. Wählen Sie die HESC-ähnlichen Kolonien für die Erweiterung und Charakterisierung aus. Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung für die Expression von Pluripotenzmarkern wie SS EEA vier, Versuch eins 60 und Versuch 180 1.

Demonstration der effizienten Erzeugung von induzierten humanen pluripotenten Stammzellen. Die Verwendung des antiviralen Stammzellvektors zur Erzeugung von humanen induzierten pro potenten Stammzellen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen bestehenden Methoden. Am attraktivsten ist vielleicht die allgemeine Einfachheit des Ansatzes, da er einen einfachen Zugang zu Spendergewebe erfordert, und damit meine ich leicht erhältliche Ausländer von peripherem Blut.

Die wichtigsten Attribute dieser Methode sind die Effizienz der Rep-Programmierung und die Qualität der erhaltenen IPS-Zellklone. Das Verfahren wird von Andrea January Summer, einer Postdoktorandin in meinem Labor, und Sarah Rozelle, einer Doktorandin im Labor von George Murphy, demonstriert. Und das alles am Tag Null.

Ziehen Sie vier Milliliter peripheres Blut in ein Vacutainer-Zellpräparationsröhrchen mit Natriumcitrat. Drehen Sie das Röhrchen innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme acht- bis zehnmal um. Die Probe wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.800 g zentrifugiert, um die mononukleären Zellen zu sammeln.

Saugen Sie das Plasma ab und pipettieren Sie die Zellschicht zwischen der Gelbarriere und dem Plasma aus dem Buffy-Coat. Übertragen Sie den Buffy-Mantel in ein steriles konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und bringen Sie das Gesamtvolumen mit sterilem PBS auf 10 Milliliter. Die Röhrchen mehrmals umdrehen und bei 300 g 15 Minuten zentrifugieren.

Reus suspendieren das Zellpellet in 10 Milliliter sterilem PBS, führen eine Zellzählung durch und überführen dann ein bis zwei mal 10 bis zu den sechsten Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Expansionsmedium. Anschließend säen Sie die isolierten mononukleären Zellen in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte aus und kultivieren sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Ernten Sie die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation und frieren Sie an den Tagen drei und sechs Brühen von etwa zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Durchstechflasche in FBS mit 10 % DMSO ein. Füllen Sie die Zellen in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Vertiefung einmal mit einem Milliliter QBSF 60 Stammzellmedium. Um die adhärenten Zellen zu sammeln.

Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Millilitern em. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte und bringen Sie die Kultur am neunten Tag wieder in den Inkubator zurück. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Vertiefung einmal mit einem Milliliter QB SF 60 Stammzellmedium, um die Adhäsionszellen zu sammeln, zentrifugieren Sie die Kultur bei 300 G für 10 Minuten.

Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter frischem EM, das fünf Mikrogramm pro Milliliter Polyhirn- und STEM-Lentivirus enthält, für einen MOI von eins bis 10. Übertragen Sie dann die Suspension in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte und zentrifugieren Sie sie 90 Minuten lang bei 2.250 U/min bei 25 Grad Celsius. Fügen Sie zusätzlich einen Milliliter frisches EM hinzu, das fünf Mikrogramm pro Milliliter Polyhirn enthält, also insgesamt zwei Milliliter em und legen Sie die Platte am Tag 10 in den Zellkultur-Inkubator.

Nach der Ernte der Zellen, wie zuvor gezeigt, wird das Zellpellet in zwei Millilitern EM-Kultur durch die Wiederbelebung suspendiert. Die transduzierten Zellen in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte am Tag 11 beschichten die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 0,1 % Gelatine und plattieren dann inaktivierte embryonale Fibroblasten der Maus bei zwei mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung in Meth-Medium. Bereiten Sie drei Vertiefungen pro Infektion vor.

Ernten Sie am nächsten Tag die transduzierten mononukleären Zellen wie zuvor gezeigt. Nach der Zentrifugation wird das Zellpellet in drei Millilitern Meth-Medium, das BFGF enthält, resuspendiert. Ascorbinsäure und Wachstumsfaktoren.

Saugen Sie nun das Medium von der MES-Platte ab, einen Milliliter der MCs pro Well-OFM. Geben Sie dann 1,5 Milliliter vollständiges Meth-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Platte bei 500 U/min bei 25 Grad Celsius für 30 Minuten. Dann ab dem 14. Tag zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultivieren.

Füllen Sie das Medium jeden zweiten Tag mit 2,5 Millilitern Meth-Medium auf, das 10 Nanogramm pro Milliliter BFGF und 50 Mikrogramm pro Milliliter Ascorbinsäure enthält, aber keine Wachstumsfaktoren. Um den 20. Tag, wenn kleine Kolonien erscheinen, füttern Sie die Zellen täglich mit zwei Millilitern humanem embryonalem Stammzellmedium zwischen dem 30. und 40. Tag. Entnehmen Sie jede Kolonie und geben Sie sie in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Platte, der eine inaktivierte Mathematik vorausgeht, die täglich einen Milliliter HESC-Medium plus Gesteinsinhibitor-Futterzellen enthält.

Danach, mit einem Milliliter HESC-Medium ohne den Rock-Inhibitor, sind die aus humanen Monozyten gewonnenen pluripotenten Stammzellen nun bereit für die Immunfluoreszenzfärbung von Pluripotenzmarkern und auch für die Exzision der integrierten Reprogrammierungskassette. Während dieses Protokolls durchlaufen die Zellen mehrere morphologische Veränderungen von P-BMCs bis hin zur Bildung von humanen I-PSCs. Am Tag Null werden die isolierten mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut nach neun Tagen in Expansionsmedium kultiviert.

Es werden Trauben wie Zellansammlungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Zellen gesund sind und sich vor der Transduktion vermehren. Etwa am 21. Tag, nachdem die Zellen auf MAs plattiert wurden, bilden sich Kolonien. Am Tag 30 zeigen die IPSC-Kolonien eine typische humane embryonale stammzellähnliche Morphologie.

Diese Immunfluoreszenzanalyse von IPCs, die aus pbmc erzeugt wurden, zeigt die Expression der Pluripotenzmarker SSEA four, trial one 60 und trial 180 1. Die I PSCs sind auch positiv für alkalische Phosphatase. Diese Bilder zeigen die Schritte zur Erzeugung transgener freier IPCs durch Transfektion mit einem Plasmid-Coex, das die CRE-Rekombinase exprimiert, und einem Pur-Mycin-Resistenzgen, wie es im Sommer 2010 beschrieben wurde, im Vergleich zu IPCs vor dem beobachteten Zelltod.

Nach zwei Tagen purer Mycinselektion entstehen etwa 10 Tage nach der Transfektion neue Kolonien aus resistenten Zellen. Südliche Blutanalysen an ausgewählten Kolonien bestätigen, dass die Exzision der Transgenspuren 1, 3, 5 und sieben das Vorhandensein des Transgens in IPSC-Klonen vor der Exzision zeigt. Diese Bams fehlen auf den Spuren 2, 4, 6 und acht nach der Exzision des Transgens. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, konsistent und robust qualitativ hochwertige, normale oder krankheitsspezifische menschliche IPS-Zellen aus kleinen Mengen von peripherem Blut einer beliebigen Person zu erzeugen.

Dieser Ansatz vereinfacht den Prozess der Rep-Programmierung, um ihn für die Stammzellgemeinschaft allgemein zugänglich zu machen. Gleichzeitig bietet es eine Grundlage für die Generierung einer homogeneren Population von Stammzelllinien.