Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Hallo, ich bin Leah Kent von STEM Gen. Heute zeigen wir Ihnen, wie man menschliche embryonale Stammzellen auftaut und einfriert. Also lasst uns loslegen.

Um menschliche embryonale Stammzellen aufzutauen, wird ein Kryo-Fläschchen von flüssigem Stickstoff entfernt und schnell aufgetaut. In einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad wird die Zellsuspension aus dem Kryofläschchen in ein konisches Röhrchen überführt, das mit humanem ES-Zellkulturmedium verdünnt und zentrifugiert wird. Um ein kleines Zellpellet zu bilden, wird dann der Überstand entfernt und das Zellpellet wird mit frischem humanem ES-Zellkulturmedium im Röhrchen resuspendiert, bevor es auf einer Vertiefung einer Sechs-Well-Zellkulturplatte plattiert wird, die zuvor mit einer bestrahlten Meth-Feeder-Schicht beschichtet war.

Einen Tag vor dem Auftauen von humanen ES-Zellen wird eine Feeder-Schicht aus bestrahlten Maus-, Embryonal-, Fibroblasten- oder mes-Zellen in Meth-Kultur plattiert. Medium in einer Vertiefung einer gelatinebeschichteten Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um ein effizientes und erfolgreiches Auftauen zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass Sie alle notwendigen Geräte und Reagenzien bereithalten. Vor der Entfernung des menschlichen ESL aus flüssigem Stickstoff. Entnehmen Sie mit einer Metallzange ein kryogenes Fläschchen mit humanem E ESL aus dem Vorratsbehälter für flüssigen Stickstoff.

Rollen Sie das Fläschchen drei bis fünf Sekunden lang zwischen den behandschuhten Händen. Um den Frost zu entfernen, notieren Sie die Informationen auf dem Etikett der Durchstechflasche mit einer Metallzange. Tauchen Sie das Fläschchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Schwenken Sie das Fläschchen vorsichtig und beobachten Sie den Fortschritt des Auftauens oft, aber schnell, indem Sie das Fläschchen gegen das Licht halten. Um die Größe des Eiskristalls zu sehen. Tauchen Sie die Kappe des Fläschchens nicht in das Wasserbad, da dies die Zellen kontaminieren könnte.

Wenn nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist, tauchen Sie das Fläschchen in Ethanol, um es in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank zu sterilisieren. Übertragen Sie den Inhalt des kryogenen Fläschchens direkt auf den Boden eines konischen 15-Milliliter-Röhrchens. Fügen Sie langsam vier Milliliter humane ES-Zellkultur hinzu. Medium zur Tube.

Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Zellen kontinuierlich zu mischen, während das neue Medium in das Röhrchen gegeben wird. Zentrifugieren Sie die menschlichen E-Zellen fünf Minuten lang bei 200 G, während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden. Nehmen Sie die zuvor vorbereitete Meth-Feeder-Platte aus dem 37-Grad-Inkubator und beschriften Sie sie mit den entsprechenden menschlichen ESL-Informationen wie Zelllinie, Passagenummer und Auftauen. Datum.

Aspirieren Sie das MEF-Kulturmedium und geben Sie einen Milliliter PBS in die Vertiefung. Bringen Sie das pelletierte humane E ESL zurück in die biologische Sicherheitswerkbank und saugen Sie den Überstand vorsichtig an. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu aspirieren, sondern entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, da diese Lösung DMSO aus dem Gefriermedium enthält. Wiederbelebung.

Suspendieren Sie das Pellet sehr vorsichtig, indem Sie 2,5 Milliliter humanes ESL-Nährmedium hinzufügen. Mit einer Fünf-Milliliter-Glaspipette und drei- bis viermaligem Pipettieren wird das PBS aus dem MEF-Feeder abgesaugt. Gut und langsam alle 2,5 Milliliter der humanen ES-Zellsuspension in die vorbereitete Vertiefung der Sechs-Well-Platte geben.

Legen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und schieben Sie die Platte vorsichtig von vorne nach hinten und von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Um eine Konzentration der Völker in der Mitte zu vermeiden. Schwenken Sie die Platte nicht in einem kreisförmigen Muster.

Lassen Sie die Zellen am Tag nach dem Auftauen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid anlagern. Entfernen Sie das Medium mit allen schwimmenden Zellen und fügen Sie 2,5 Milliliter frische humane ES-Zellkultur hinzu. Mittel bis zum Brunnen.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und fahren Sie mit der Kultur fort, bis die Kolonien bereit sind, durchgelassen zu werden. Das Protokoll zum Einfrieren humaner ES-Zellen beginnt mit gesunden, mittelgroßen humanen ES-Zellkolonien, die auf einer Sechs-Well-Platte kultiviert werden. Nach der Inkubation der Kultur mit Kollagenase vier Enzymen werden die Kolonien mit einer Fünf-Milliliter-Glaspipette abgeschabt, die in einem konischen Röhrchen gesammelt und zentrifugiert wird, um ein loses Zellpellet zu bilden.

Nach dem Aspirieren des Überstands wird das Zellpellet resuspendiert. Zuerst mit humanem ES-Zellkulturmedium und dann mit zweifacher Kryokonservierung verdünnt. Mittel. Die Zellen werden gleichmäßig in einem Milliliter, Aliquot, verteilt und in kryogenen Fläschchen eingefroren.

Während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, beschriften Sie die kryogenen Fläschchen in der Sicherheitswerkbank mit der Durchgangsnummer der Zellleitung und dem Gefrierdatum. Die typische Dichte für das Einfrieren menschlicher ES-Zellen beträgt eine Vertiefung Zellen aus einer Sechs-Well-Platte pro kryogenem Fläschchen. Wenn die humanen E ESL zentrifugiert wurden, bringen Sie das Röhrchen zurück in die biologische Sicherheitswerkbank.

Saugen Sie den Überstand aus dem Rohr an. Achten Sie darauf, das lose verpackte Zellpellet Resus nicht zu stören. Suspendieren Sie das Zellpellet mit der entsprechenden Menge humaner ESL-Kultur.

Medium 0,5 Milliliter ESL-Kultur für den Menschen. Medium pro kryogenes Fläschchen. Seien Sie beim Pipettieren sehr vorsichtig, da sich die menschlichen E-Zellen besser erholen, wenn sie in relativ großen Koloniestücken eingefroren werden, geben Sie langsam und unter leichtem Schütteln des Röhrchens die entsprechende Menge von zwei x humanen E-es-Zell-Einfriermedium in die Zellen.

Sobald das Gefriermedium hinzugefügt wird, mischen Sie die Lösung, indem Sie sie äußerst vorsichtig, ein- bis zweimal schnell, aber vorsichtig mit einem Milliliter der Zellsuspension in jede kryogene Datei pipettieren. Füllen Sie die Fläschchen in einen Isopropanol-Gefrierbehälter und stellen Sie sie über Nacht in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Die Zellen frieren am nächsten Tag bei einem Grad Celsius pro Minute im Isopropanol-Gefrierbehälter ein.

Bringen Sie die gefrorenen Fläschchen mit einer Metallzange schnell in einen Lagertank für flüssigen Stickstoff. Am ersten Tag nach dem Verschwinden menschlicher ES-Zellen können die kleinen Kolonien durchsichtig erscheinen und unter dem Mikroskop schwer zu erkennen sein. Seit der neuen Denkweise neigen die menschlichen und ESL dazu, sich eher langsam zu vermehren.

Es kann einige Tage dauern, bis sie in Kultur als etablierte Kolonien erscheinen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie menschliche embryonale Stammzellkulturen auftauen und einfrieren können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.