Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Hallo, ich bin Leah Kent von STEM Gen. Heute zeigen wir Ihnen, wie man humane embryonale Stammzellen auftaut und einfriert. Beginnen wir also.

Um humane embryonale Stammzellen aufzutauen, wird ein Kryoröhrchen aus flüssigem Stickstoff entnommen und schnell aufgetaut. In einem Wasserbad von 37 Grad Celsius wird die Zellsuspension vom Kryoröhrchen in ein kegelförmiges Reagenzglas überführt, mit menschlichem ES-Zellkulturmedium verdünnt und zentrifugiert. Um ein kleines Zellpellet zu bilden, wird das Überstand entfernt und das Zellpellet im Reagenzglas mit frischem menschlichem ES-Zellkulturmedium resuspendiert, bevor es in eine Vertiefung einer sechswelligen Zellkulturschale ausgesät wird, die zuvor mit einer bestrahlten Maus-Füttererschicht beschichtet wurde.

Ein Tag vor dem Auftauen menschlicher ES-Zellen eine Feeder-Schicht aus bestrahlten murinen embryonalen Fibroblasten oder Mes in Meth-Kultur in einer Vertiefung einer mit Gelatine beschichteten sechswelligen Zellkulturschale ansäen. Die Schale über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Um einen effizienten und erfolgreichen Auftauvorgang sicherzustellen, stellen Sie sicher, dass sämtliche erforderlichen Geräte und Reagenzien bereitstehen, bevor Sie die menschlichen ESL aus dem flüssigen Stickstoff entnehmen. Entnehmen Sie mithilfe einer Metallzange ein kryogenes Gefäß mit menschlichen E ESL aus dem flüssigen Stickstoff-Lagertank.

Rollen Sie das Gefäß zwischen den behandschuhten Händen drei bis fünf Sekunden lang. Um den Frost zu entfernen, notieren Sie die Informationen auf dem Etikett des Gefäßes mit Metallpinzette. Tauchen Sie das Gefäß in ein Wasserbad von 37 Grad Celsius.

Schwenken Sie das Gefäß vorsichtig und überprüfen Sie häufig, aber kurz, den Auftauvorgang, indem Sie das Gefäß gegen das Licht halten, um die Größe des Eiskristalls zu beobachten. Tauchen Sie den Verschluss des Gefäßes nicht in das Wasserbad ein, da dies die Zellen kontaminieren könnte.

Wenn nur noch ein kleiner Eiskristall vorhanden ist, tauchen Sie das Gefäß in Ethanol, um es in einem sterilen Sicherheitswerkbank zu sterilisieren, und überführen Sie den Inhalt des Kryoröhrchens direkt auf den Boden eines 15-Milliliter-Konischgefäßes. Fügen Sie langsam vier Milliliter humanen ES-Zellkulturmedium dem Gefäß hinzu.

Schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Zellen kontinuierlich zu mischen, während das neue Medium dem Röhrchen zugegeben wird. Zentrifugieren Sie die humanen E-Zellen fünf Minuten lang bei 200 × g, während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden. Entnehmen Sie die zuvor vorbereitete Meth-Nährzellen-Platte aus dem 37 °C-Brutschrank und beschriften Sie sie mit den entsprechenden Informationen für humane ESL-Zellen, wie Zelllinie, Passagenummer und Auftau-Datum.

Aspirieren Sie das Kulturmedium der MEFs und geben Sie einen Milliliter PBS in die Vertiefung. Bringen Sie das pelletierte humane E ESL zurück in den biologischen Sicherheitswerkbank und aspirieren Sie vorsichtig den Überstand. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu aspirieren, entfernen Sie jedoch so viel Überstand wie möglich, da diese Lösung DMSO aus dem Einfriermedium.Resus. enthält.

Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie 2,5 Milliliter humanen ESL-Kulturmedium hinzufügen. Entfernen Sie mit einer 5-Milliliter-Glaspipette durch 3–4-maliges Auf- und Abpipettieren das PBS vom MEF-Fütterungszellager. Geben Sie dann langsam und vollständig alle 2,5 Milliliter der humanen ES-Zellsuspension in die vorbereitete Vertiefung der 6-Loch-Platte.

Stellen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator und schieben Sie sie vorsichtig von vorne nach hinten sowie von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Dies verhindert, dass sich die Kolonien in der Mitte konzentrieren. Drehen Sie die Platte nicht im Kreis.

Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ansetzen, am Tag nach dem Auftauen. Entfernen Sie das Medium mit eventuell vorhandenen schwebenden Zellen und geben Sie 2,5 Milliliter frisches humanes ES-Zellkulturmedium in die Vertiefung.

Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren und die Kultur fortführen, bis die Kolonien zur Passage bereit sind. Das Einfrierprotokoll für humane ES-Zellen beginnt mit gesunden mittelgroßen Kolonien menschlicher ES-Zellen, die in einer sechs-well-Platte kultiviert wurden. Nach der Inkubation der Kultur mit dem Enzym Collagenase IV werden die Kolonien mit einer 5-Milliliter-Glaspipette abgeschabt, in einem konischen Röhrchen gesammelt und zentrifugiert, um ein lockeres Zellpellet zu bilden.

Nach dem Absaugen des Überstandes wird das Zellpellet resuspendiert. Zunächst mit humanem ES-Zellkulturmedium und anschließend mit zwei x Kryokonservierungsmedium verdünnt. Die Zellen werden gleichmäßig in Aliquots zu je einem Milliliter verteilt und in kryogenen Gefäßen eingefroren.

Während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, beschriften Sie die Kryoröhrchen im Sicherheitswerkbank mit der Zelllinienpassagezahl und dem Einfrierdatum. Die typische Dichte zum Einfrieren menschlicher ES-Zellen beträgt eine Vertiefung von Zellen aus einer sechswelligen Platte pro Kryoröhrchen. Nachdem die menschlichen ES-Zellen zentrifugiert wurden, bringen Sie das Röhrchen zurück in die biologische Sicherheitswerkbank.

Aspirieren Sie den Überstand aus dem Reagenzglas. Achten Sie darauf, das locker gepackte Zellpellet nicht zu stören. Suspendieren Sie das Zellpellet mit der geeigneten Menge an menschlichem ESL-Kulturmedium.

Geben Sie 0,5 Milliliter menschliches ESL-Kulturmedium je kryogene Gefäße. Seien Sie sehr vorsichtig beim Pipettieren, da menschliche ES-Zellen besser überleben, wenn sie in relativ großen Koloniestücken eingefroren werden. Fügen Sie langsam unter vorsichtigem Schütteln des Röhrchens die entsprechende Menge zweifach konzentriertes menschliches ES-Zell-Einfriermedium zu den Zellen hinzu.

Nachdem das Einfriermedium hinzugefügt wurde, die Lösung durch sehr sanftes Pipettieren ein- bis zweimal kurz und vorsichtig mischen und anschließend je ein Milliliter der Zellsuspension in jede Kryoröhre geben. Die Röhrchen in einen Isopropanol-Einfriertopf überführen und über Nacht in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius stellen. Die Zellen gefrieren im Isopropanol-Einfriertopf am folgenden Tag mit einer Rate von einem Grad Celsius pro Minute.

Überführen Sie die gefrorenen Vials mithilfe einer Metallzange schnell in einen flüssigen Stickstofflagerbehälter. Am ersten Tag nach der Einbringung können kleine Kolonien von menschlichen ES-Zellen durchscheinend erscheinen und unter dem Mikroskop schwer zu erkennen sein. Da neu eingefrorene menschliche ES-Zellen dazu neigen, sich relativ langsam zu vermehren.

Sie können einige Tage in der Kultur benötigen, um sich als etablierte Kolonien zu zeigen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man humane embryonale Stammzellkulturen auftaut und einfriert. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.