Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

WRN-Plasmide werden mit dem Restriktionsendonuklease Cell One und Mlu One geschnitten und die Fragmente werden aus einem Gel gereinigt. Diese Expressionsvektoren, die mit Cell One bis Mlu One geschnittene WN-Fragmente enthalten, werden anschließend in die Cell-One-bis-Mlu-One-Stellen des Hefevektors ligiert. Das Multicopy-Plasmid enthält außerdem einen Trp1-selektierbaren Marker.

W-Rrn-Konstrukte werden gemäß Standardprotokollen in Hefe transformiert, und die Transformanten werden auf synthetischem vollständigem Glucose-Medium ohne Tryptophan ausgewählt. Anschließend werden einzelne Transformanten auf synthetisches vollständiges Glucose-Medium ohne Tryptophan ausgestrichen, und die Platten werden von der Stammpalette inkubiert. Um die Wiederherstellung des langsamen Wachstumsphänotyps in WRN-transformierten SGS zu analysieren, werden jeweils die drei besten Transformanten von Doppelmutantenstämmen auf Platten mit Glucose oder Galactose ausgestrichen.

Um den Einfluss der WRN-Expression auf die Empfindlichkeit gegenüber HU und MMS zu analysieren, wird ein Spotting-Versuch durchgeführt, um die Verteilung des Zellzyklus in WRN-exprimierenden Hefezellen zu bestimmen. Es erfolgt eine DAPI-Färbung. Die Expression von WRN im heterologen Wirt wird mittels Western Blot Analyse untersucht.

Hallo, ich bin Robert Broch von der Abteilung für DNA-Hela-Fälle im Labor für molekulare Gerontologie am National Institute on Aging, einem der Institute der National Institutes of Health. Hallo, ich bin Monica Agarwal, ebenfalls von der Abteilung für DNA-Heli-Fälle im Labor für molekulare Genetologie am National Institute on Aging. Das Verständnis der Rollen menschlicher DNA-Reparaturproteine und genetischer Signalwege stellt eine erschwingliche Herausforderung für viele Forscher dar.

Genetische Studien an Säugetiersystemen waren aufgrund des Fehlens leicht verfügbarer Werkzeuge begrenzt, einschließlich mutanter genetischer Zelllinien, regulatorischer Expressionssysteme und geeigneter selektierbarer Marker. Heute werden wir Ihnen Verfahren vorstellen, bei denen Hefe als Modellsystem verwendet wird, um die molekularen und zellulären Funktionen einer DNA-Entwindungsenzym, bekannt als Helikase, bei der Verhinderung vorzeitigen Alterns zu untersuchen. In unserem Labor verwenden wir diese Verfahren, um die genetische Charakterisierung des Produkts des menschlichen Burner-Gens vorzunehmen, das bei der DNA-Reparatur und Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität im Zusammenhang mit einer Erkrankung des vorzeitigen Alterns defekt ist.

Das Werner-Syndrom ist einer der fünf menschlichen ReQ-Familie-Helikasen-Fälle in Ostasien. Es gibt nur einen benannten SGS, der verwendet wird, um die Rolle des menschlichen Werner-Proteins bei der Replikationsstressantwort zu untersuchen. Wir haben die Auswirkung der Werner-Expression im Ostasien-Mutantenhintergrund auf verschiedene biologische Endpunkte untersucht.

Beginnen wir also. Da wir Hefe als heterologen Wirt verwenden werden, besteht unser erster Schritt darin, das humane Werner-Gen oder seine Variante in einen Hefe-Vektor zu klonen. Die Werner-Plasmide wurden mit den Restriktionsendonukleasen Sal I und Mlu I geschnitten, und die gereinigten Fragmente anschließend in die Sal-I- und Mlu-I-Stellen des Hefe-Expressionsvektors ligiert, der unter der Kontrolle eines galaktoseinduziblen Promotors steht.

Das Multicopy-Plasmid enthält außerdem einen TRP1-auswählbaren Marker. Diese Werner-Expressionsplasmide werden anschließend in die geeigneten Tryptophan-auxotrophen Hefe-Stämme transformiert, die in dieser Studie verwendet werden. Die Transformanten werden durch Ausplattieren der Suspension auf synthetischem komplettem Glucose-Medium ausgewählt.

Ohne Tryptophan die Platten bei 30 Grad Celsius drei bis vier Tage lang inkubieren, bis die Kolonien sichtbar werden. Sobald die Kolonien gewachsen sind, einzelne Transformanten auf synthetischem kompletten Glucose-Medium ausstreichen und die Platten bei 30 Grad Celsius zwei bis drei Tage lang inkubieren. Die mutierten Hefe-Stämme, die das humane WEER-Gen und seine Varianten exprimieren, werden anschließend mittels der in den folgenden Abschnitten dargestellten Techniken auf zelluläre Phänotypen untersucht.

Die top3-Mutante zeigt einen schweren Wachstumsdefekt. Eine Mutation im SGS1-Gen unterdrückt jedoch das langsame Wachstumsphänotyp der top3-Mutante. Um den Einfluss der Werner-Expression auf das Wachstum von Wildtyp SGS1- oder SGS1 top3-Stämmen zu untersuchen, streicht man die entsprechenden Stämme mit dem Vektor oder dem Werner-Expressionsplasmid auf synthetische vollständige Medienplatten, die Tryptophan fehlen, aber entweder 2 % Glukose oder 2 % Galalactose enthalten, als positive Kontrolle. Der Effekt der SGS1-Expression wurde bestimmt, indem die Platten zwei Tage lang bei 30 Grad inkubiert wurden.

Wildtyp- und SGS1-Mutantenstämme, die mit Vektor oder Werner transformiert wurden, zeigen keinen Unterschied in ihrem Wachstumsverhalten. Werner-transformierte SGS1 top3-Doppelmutantenstämme wachsen jedoch signifikant langsamer als SGS1 top3-Doppelmutantenstämme, die mit dem Vektor transformiert wurden, um die funktionellen Anforderungen von Werner zur Wiederherstellung des langsamen Wachstumsphänotyps zu überprüfen. Auf synthetisch kompletten Platten ohne Tryptophan, die entweder 2 % Glukose oder 2 % Galaktose enthielten, wurden nach zwei Tagen Stichproben der Stämme mit SGS1 top3-Hintergrund, die mit katalytischen Domänenmutanten von Werner transformiert wurden, ausgestrichen.

Die Inkubation des Werner-Exonuklease-Mutanten, angegeben als E 84 A, stellt das langsame Wachstumsphänotyp wie bei Werner wieder her, was zeigt, dass die Exonuklease-Aktivität nicht erforderlich ist, um die Wiederherstellung des langsamen Wachstumsphänotyps unter den ersten drei Kandidaten zu ermöglichen. Der Werner-Helikase-Mutant wächst gut, was belegt, dass die Helikase-Aktivität von Werner für die Wiederherstellung des langsamen Wachstumsphänotyps unter den ersten drei Kandidaten erforderlich ist. Um die Fähigkeit von Werner zu bestimmen, die Wachstumsrate von sgs zu beeinflussen.

Eine der drei besten Stämme bei niedrigeren Ebenen der Proteinexpression streicht sgs eine der drei besten Stämme, die mit dem Vektor Werner oder sgs transformiert wurden, auf synthetische komplette Platten, die Tryptophan fehlen, aber zunehmende Konzentrationen von Galactose enthalten. Inkubieren Sie alle Platten bei 30 Grad Celsius für zwei Tage. Warner und der Warner-Exonuklease-Mutant stellen die Steigung der drei besten Stämme mit Phänotyp auf allen Galactose-Konzentrationsebenen wieder her.

Dagegen zeigen Warner-Helikase-Mutanten dies nicht. Es wurde gezeigt, dass der SGS1-top3-Doppelmutant gegenüber dem DNA-alkylierenden Agenten Methylmethansulfonat oder MMS bzw. dem Replikationsinhibitor Hydroxyharnstoff oder HU weniger empfindlich ist als der top3-Einzelmutant. Um den Einfluss der Warner-Expression auf die MMS- und HU-Empfindlichkeit von SGS1- bzw. SGS1-top3-Stämmen zu bestimmen, kultivieren Sie Hefestämme, die mit Vektor oder Werner transformiert wurden, als Kontrolle in synthetisch komplettem Raffinosemedium ohne Tryptophan bei 30 Grad Celsius.

Verwenden Sie einen wildtypischen Elternstamm, der mit dem Vektor transformiert wurde, um alle Kulturen in synthetischem kompletten Raffinosemedium ohne Tryptophan erneut zu beimpfen, und kultivieren Sie sie bei 30 Grad Celsius bis zur frühen logarithmischen Phase. Wenn sich die Kulturen in der frühen logarithmischen Phase befinden, stellen Sie zehnfache serielle Verdünnungen bis zu einer 10.000-fachen Verdünnung dieser Stämme mit synthetischem komplettem Medium ohne Tryptophan her, geben Sie jeweils vier Mikroliter jeder Verdünnung auf synthetische komplette GAL-Medienplatten ohne Tryptophan, die 10 Millimolar HU oder 0,0025 % MMS enthalten, und inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für vier Tage. Ein SGS1∆ top3∆ doppelter Mutant, der mit dem Wildtyp-sgs transformiert wurde.

Ein Stamm zeigt eine Verzögerung in der späten SG-Zweiphasen-Phase des Zellzyklus, was zu einer hantelförmigen Morphologie führt. Im Gegensatz dazu schließen Wildtyp-Hefezellen die Zellteilung ab und hinterlassen weniger hantelförmige Zellen, um die Verteilung im Zellzyklus des Werner-transformierten sgs-one-top-three-Stamms zu untersuchen. Kultivieren Sie zunächst logarithmisch wachsende Kulturen der folgenden Stämme über Nacht in synthetischem komplettem RAF-Medium ohne Tryptophan bei 30 Grad Celsius.

SGS eins der drei Top-Stämme, die mit dem Vektor Werner oder SGS eins transformiert wurden, sowie der mit dem Vektor transformierte Wildtyp-Stamm werden erneut bei einem OD von 0,05 beimpft. Nach der erneuten Beimpfung werden die Kulturen bis zu einem OD von 0,5 gezüchtet und durch Zentrifugation geerntet. Die Werner-Expression wird anschließend durch Zugabe von Galalactose in einer Konzentration von 2 % induziert. Die Kulturen werden anschließend sechs Stunden lang bei 30 °C weiterkultiviert.

Nach sechs Stunden die Kulturen ernten und die Zellen durch Zentrifugation sammeln. Nach der Zentrifugation die Kulturen in Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die Zellen einmal mit PBS waschen. Anschließend die Zellen nach zweimaligem Waschen mit PBS in 70 % Ethanol für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren und die fixierten Zellen in einem X PBS resuspendieren.

Bringen Sie die Zellsuspension auf einem Objektträger auf und geben Sie Vector Shield hinzu. Verwenden Sie Eindeckmedium mit DAPI in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter. Untersuchen Sie die Objektträger unter einem XI Saxo vert Mikroskop auf Zellen mit hantelförmigen Kernen, die charakteristisch für Hefezellen in der SG2-Phase des Zellzyklus sind.

Um die Expression des Werner-Proteins oder seiner Variante in transformierten Hefestämmen SGS1 oder SGS1 top3 zu bestimmen, kultivieren Sie die Stämme zunächst sechs Stunden in einem Galactose-haltigen Medium, um die Expression des Werner-Proteins zu induzieren. Nach der Sammlung der Zellen durch Zentrifugation waschen Sie diese mit PBS und resuspendieren sie erneut.

Ein alkalischer Lysepuffer. Die Zellen fünf Minuten lang kochen, dann durch Zentrifugation klären und mit einmolarer Salzsäure neutralisieren. Diese Lysate können nun zur Elektrophorese in 8–16 %igen Polyacrylamid-SDS-Gelen verwendet werden, um die Expression des Warner-Proteins unter dem Einfluss unterschiedlicher Galactosekonzentrationen zu bestimmen.

Zunächst die Kulturen mit unterschiedlichen Galactosekonzentrationen sechs Stunden lang induzieren. Anschließend die Zellen durch Zentrifugation gewinnen und in Puffer mit Proteaseinhibitoren resuspendieren. Glaskügelchen mit einer Größe von 425 bis 600 Mikron zur Mischung hinzufügen und die Zellen durch heftiges Vortexen für eine Minute lyse, gefolgt von einer Minute auf Eis.

Wiederholen Sie dies insgesamt acht Mal. Zentrifugieren Sie danach das resultierende Homogenat fünf Minuten bei 15.000 G und sammeln Sie die Überstandfraktion. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration in den Lysatfraktionen nach der Bradford-Methode werden gleiche Proteinkonzentrationen auf 8–16 %igen Polyacrylamid-SDS-Gelen aufgetrennt, und die Expression von Werner wird anschließend mittels Western Blot in sgs analysiert.

Ein TOP3-Gen restauriert das Phänotyp des langsamen Wachstums von top3, wie auf diesen Fotografien gezeigt. Wenn SGS1 top3-Stämme mit dem Vektor WERNER oder SGS1 transformiert und auf einer SC-Tryptophan-Platte mit entweder 2 % Glukose oder 2 % Galaktose ausgestrichen werden. Die durch Galaktose induzierte Expression von WERNER verursacht ein langsameres Wachstum des SGS1 top3-Stamms.

Im Gegensatz dazu ist das Wachstum des Wildtyp-Stammes oder des SGS-eins-Stammes, der mit Werner transformiert wurde, nicht beeinträchtigt, was darauf hinweist, dass das langsame Wachstum, das durch Werner vermittelt wird, spezifisch für den sgs-eins-Hintergrund ist. Als SGS-eins-Stämme des Top-drei-Hintergrunds mit Varianten von Werner auf SC-Tryptophan-Platten, die entweder 2 % Glukose oder 2 % Galaktose enthielten, ausgestrichen wurden, wurde nur dies beobachtet.

Die Exonuklease-tote Form von Werner war dennoch in der Lage, das Phänotyp der langsamen Wachstums zu restaurieren. Dies zeigt, dass die ATPase-Helikase-Aktivität von Werner, jedoch nicht die Exonuklease-Aktivität, erforderlich ist, um das Phänotyp der langsamen Wachstums von top three zu restaurieren. In einem SGS one top three Hintergrund restaurierte Werner das Phänotyp der langsamen Wachstums von SGS one top three über den gesamten GAL-Konzentrationsbereich hinweg.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wiederherstellung des langsamen Wachstumsphänotyps im sgs one top three-Mutantenhintergrund bei niedrigen Expressionsniveaus des Werner-Proteins auftritt. Wenn exponentiell wachsende Kulturen von sgs, one top three-Stämmen, die mit Werner oder dessen Varianten transformiert wurden, in zehnfacher serieller Verdünnung auf SC-Tryptophan-Platten mit Glukose oder Galaktose und entweder MMS oder HU ausplattiert wurden, beobachteten wir, dass die Expression von Werner die Empfindlichkeit des SGS one top three-Stamms gegenüber MMS und zwei gegenüber HU erhöhte. Darüber hinaus erfordert dieser Effekt auf die MMS- und HU-Empfindlichkeit im SGS one top three-Hintergrund die Helicase-Aktivität von Werner-ATP, nicht jedoch die Exonuklease-Aktivität.

Schließlich stellt die Werner-Expression auch die charakteristische SG-Zwei-Verzögerung des Top-Three wieder her, wie durch die erhöhte Population großer, stumpf endender Zellen angezeigt wird. In den sgs-eins-Top-Three-Mutanten-Zellen, die Werner exprimieren. Im Vergleich zu sgs-eins-Top-Three-Zellen, die mit Vektorzellen transformiert wurden, wurden diese mit Dabi gefärbt.

Um die Kerne sichtbar zu machen, und die Pfeile zeigen undivierte Kerne mit Werner-Expression an. In den transformierten SGS-Zellen wurde eine der drei oberen Zellen durch Zugabe der angegebenen Galactosekonzentrationen induziert, und die Zellen wurden sechs Stunden nach der Induktion geerntet. Gleichmäßige Mengen an Gesamtzelllysaten wurden auf 8–16%-Polyacrylamid-SDS-Gelen aufgetragen und anschließend mittels Western Blot-Detektion unter Verwendung eines Anti-Warner-Antikörpers analysiert.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie man die mit definierten Hefe-Mutantenhintergründen assoziierten zellulären Phänotypen untersucht, um die zellulären und molekularen Funktionen des menschlichen Learner-Gens, vermittelt durch seine katalytischen Aktivitäten und Proteinwechselwirkungen, zu klären. Hefe kann als Modellorganismus verwendet werden, um die Funktionen des Gens in definierten Wegen zu untersuchen. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, einen geeigneten Hefe-Mutantenhintergrund auszuwählen, um die Rolle des untersuchten Gens in definierten Wegen zu bestimmen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.