Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Videoartikels ist es, eine Technik zu beschreiben, mit der adhärente Zellen laminaren Strömungsbedingungen ausgesetzt und die Reaktion auf gut quantifizierbare Scherspannungen des Fluids bewertet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst der Strömungskreislauf ohne die Strömungskammer montiert wird. Der Kreislauf umfasst den Reservoir-Impuls, den Dämpfer, den harten Schlauch, den weichen Schlauch, die Vier-Wege-Absperrhähne und die angeschlossenen Köderadapter sowie einen Luftfilter.

Der nächste Schritt besteht darin, den Kreislauf mit der gewünschten Acht, wie z. B. Zellmedium, unter sterilen Bedingungen zu füllen und dann die Pumpe zu starten, um den Impulsdämpfer zu füllen und den Schlauch von Luft zu reinigen. Anschließend wird der Schieber mit Zellsitz in die Bodenplatte der Durchflusskammer eingeführt. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die komplette Montage des Durchflusskreislaufs mit der Strömungskammer in einer Linie.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass fluoreszenzmarkierte endotheliale Vorläuferzellen unter Flüssigkeitsscherspannung durch die transparente Kammer mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops ausgerichtet sind, um das Funktionsverhalten von Zellen zu untersuchen. Oft ist es notwendig, die In-vivo-Physiologie zu imitieren, indem die Zellen einer Flüssigkeitsscherbelastung ausgesetzt werden. Wir haben eine parallele Plattenströmungskammer und einen kontinuierlichen Durchflusskreislauf entwickelt, die es uns ermöglichen, die Zellen unter Strömungsbedingungen zu untersuchen und sie durch die transparente Kammer zu beobachten.

Diese Technik kann als wertvolles Forschungsinstrument für die Bereiche Medizin und Technik dienen. Unsere Durchflusskammer ermöglicht die intermittierende oder Echtzeit-Visualisierung von Zellen unter Fluss mit einem aufrechten oder inversen Mikroskop. Darüber hinaus ermöglicht das Design von Dr. Ach Nick den Forschern, Zellen auf transparenten oder röntgendichten Oberflächen mit Standard-Mikroskopobjektiven abzubilden.

Darüber hinaus kann es ein wichtiges Werkzeug in der pharmakologischen Forschung sein, um die Wirkung von Medikamenten auf Zellen unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Die Visualisierung des Setups ist von entscheidender Bedeutung, da einige der Schritte allein durch das Lesen eines Protokolls schwer zu meistern sind. Ich gebe Schritt für Schritt eine Anleitung zum Einrichten der Durchflusskammer und des Durchflusskreislaufs, die häufig im Labor von Dr. Ock Next verwendet werden, um den Durchflusskreislauf zusammenzubauen.

Beginnen Sie damit, ein 36-Zoll-Segment eines harten Schlauchs an einem Ende eines Impulsdämpfers am anderen Ende zu befestigen. Befestigen Sie ein 18-Zoll-Segment aus weichem Schlauch. Platzieren Sie einen Achtelzoll-Köderadapter am Ende des 18-Zoll-Weichschlauchabschnitts.

Verbinden Sie den männlichen Köder mit einem Achtelzoll-weiblichen Köderadapter. Befestigen Sie den weiblichen Köder an einem neuen 18-Zoll-Segment aus weichem Schlauch. Bohren Sie drei Löcher in einen 250-Milliliter-Glasbecherdeckel.

Um den Schlauch zu montieren, führen Sie ein 1,5-Zoll-Segment aus weichem Schlauch in ein Loch ein. Als Entlüftungsöffnung. Führen Sie die freien Enden des harten und weichen Schlauchs durch die beiden anderen Löcher in der Kappe in die 250-Milliliter-Glasflasche ein, die als Reservoir dient.

Stellen Sie sicher, dass der harte Schlauch den Boden des Behälters erreicht. Die Aufrechterhaltung der Sterilität während des gesamten Aufbaus des Kreislaufs ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Daher müssen alle Teile sterilisiert werden und Sie müssen durchgehend sterile Handschuhe tragen.

Zusätzlich zu den zusammengebauten Teilen müssen diese Teile sterilisiert werden. Eine komplette Strömungskammer, drei mal zwei Zoll große Segmente weicher Schläuche, ein männlicher und ein weiblicher, ein Achtelzoll-Köderadapter, vier ein halbe Zoll Flachkopfschrauben, 6 5 16 Zoll, acht 30 Sekunden. Zollschienen pro Zoll, Flachkopfschrauben, eine Pinzette, ein Glasobjektträger und zwei mit Dampf sterilisierte Handtücher.

Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 60 Minuten. Platzieren Sie die Strömungskammer des Durchflusskreislaufs mit vier x vier Richtungen, Absperrhähnen nacheinander, Absperrhahn und alle sterilisierten Teile auf diesem sterilen Feld. Verbinden Sie mit sterilen Handschuhen die beiden Vier-Wege-Absperrhähne.

Setzen Sie Kappen auf die offenen Probenanschlüsse. Nehmen Sie die männlichen und weiblichen Köderadapter ab, mit denen die beiden weichen Schlauchsegmente des Durchflusskreislaufs befestigt sind, und setzen Sie die angeschlossenen Absperrhähne ein. Befestigen Sie den in den Behälter eingeführten weichen Schlauch in einer 30-Milliliter-Spritze und entfernen Sie den Kolben der Spritze.

Füllen Sie die Flasche mit 125 Millilitern EPC-Medium. Verbinden Sie den weichen Schlauch wieder mit dem Absperrhahn. Setzen Sie einen sterilen Spritzenvorsatzfilter in die Entlüftungsöffnung ein.

Übertragen Sie nun den Strömungskreislauf in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid. Klemmen Sie den harten Schlauch in den Master-Flex-Rollenpumpenkopf, der für diese Art von Kohle-Palmer-Schläuchen geeignet ist. Stellen Sie sicher, dass sich der Schlauch nicht mit den Montageschienen der Rollenpumpe überlappt.

Markieren Sie den Schlauch an der Stelle, an der er aus dem Pumpenkopf austritt, auf beiden Seiten mit einem Markierungsstift. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass alle Absperrhähne zu den Probenanschlüssen hin geschlossen und entlang des Durchflusskreislaufs geöffnet sind, starten Sie die Pumpe. Überprüfen Sie die Durchflussrichtung.

Der PERFUSE Achtzylinder sollte aus dem Glasbehälter durch den harten Schlauch in den Impulsdämpfer gelangen. Verwenden Sie für die Montage der Durchflusskammer sterile Handschuhe, um ein zwei Zoll weiches Schlauchsegment mit einem Achtel Zoll weiblichen Köderadapter zu verbinden. Verbinden Sie ein weiteres zwei Zoll weiches Schlauchsegment mit einem Achtelzoll-Köderadapter.

Befestigen Sie den zwei Zoll weichen Schlauch mit weiblichem Köderadapter an der Zuflussöffnung und die zwei Zoll weichen Schläuche mit männlichem Köderadapter an der Auslassöffnung. Befestigen Sie Vier-Wege-Stopphähne an diesen beiden Köderadaptern. Verbinden Sie das verbleibende zwei Zoll weiche Schlauchstück mit dem seitlichen Anschluss, der von der Blasenfalle kommt, und befestigen Sie einen Einweg-Stopphahn mit einer sterilen Pinzette.

Nehmen Sie den Objektträger aus dem Zellkulturgefäß und setzen Sie ihn in die Aussparung an der Bodenplatte der Durchflusskammer ein. Stellen Sie sicher, dass der Objektträger mit der auf der Zelle sitzenden Seite nach oben mit einer Spritze oder Pipette platziert wird. Legen Sie 10 Milliliter warmes EPC-Medium auf den Objektträger. Lassen Sie das Medium den Objektträger in der Durchflusskammer abdecken, aber verschütten Sie das Medium nicht über den O-Ring auf der Bodenplatte.

Setzen Sie die obere Platte der Durchflusskammer auf die untere Platte und richten Sie die Schraubenlöcher aus. Halten Sie die beiden Platten parallel, um keine Luftblasen in die Schraubplatten der Kammer einzubringen. Zusammen. Mit einem automatischen batteriebetriebenen Schraubendreher entlüften Sie die Einströmblasenfalle, indem Sie den Einweg-Absperrhahn öffnen, der an der Zuflussseite der Blasenfalle befestigt ist.

Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, um den Zuflussschlauch vorsichtig mit EPC-Medium zu spülen, und schließen Sie dann diesen Absperrhahn und verschließen Sie ihn. Entlüften Sie nun den Kammerkanal, indem Sie den Vier-Wege-Absperrhahn der Ausströmöffnung öffnen und das EPC-Medium sanft durch die Strömungskammer spülen. Auch hier verschließen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze alle Vier-Wege-Absperrhahnanschlüsse und verschließen sie.

Übertragen Sie die Strömungskammer mit dem montierten Strömungskreislauf in den befeuchteten Inkubator. Pause der Pumpe des Durchflusskreislaufs, schließen Sie den Durchflusskreislauf. Stoppen Sie die Hähne in Strömungsrichtung, um ein Auslaufen zu verhindern.

Strömungskammer an den Strömungskreislauf anschließen Nachdem die Strömungskammer an den Strömungskreislauf angeschlossen wurde, öffnen Sie die Absperrhähne in Strömungsrichtung. Nehmen Sie die Durchflusspumpe wieder auf und stellen Sie sicher, dass die PERFUSE acht in die richtige Richtung fließt. Passen Sie die Durchflussmenge an die gewünschte Schiebespannung an.

Während des Strömungsexperiments kann die Strömungskammer aus dem Kreislauf entnommen werden, um die Zellen mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Trennen Sie dazu die Strömungskammer am Absperrhahn vom Strömungskreislauf, um die Absperrhahnanschlüsse zu verschließen. Zur Entnahme der Perfusion werden acht Proben für die Analyse verwendet.

Halten Sie zuerst die Pumpe an und schließen Sie den Absperrhahn, der sich am nächsten zum Impulsdämpfer befindet. Entfernen Sie die Schutzkappe und stellen Sie sie auf den Kopf, um sicherzustellen, dass sie nicht verunreinigt wird. Führen Sie eine kleine Spritze in den Probenanschluss ein.

Schließen Sie den Absperrhahn in Richtung der Durchflusskammer und halten Sie den Probenanschluss und den Stromkreis in Richtung des Impulsdämpfers offen. Entnehmen Sie die gewünschte Probenmenge aus dem Kreislauf, schließen Sie den Absperrhahn in Richtung des Probenanschlusses, bevor Sie die Spritze entfernen. Lagern Sie die acht Proben in einem beschrifteten Fläschchen und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein.

Verschließen Sie den Probenanschluss wieder und stellen Sie sicher, dass alle Absperrhähne geöffnet sind, bevor Sie mit dem Durchfluss beginnen. Mit dieser Methode können aus menschlichem Blut gewonnene endotheliale Vorläuferzellen innerhalb von 15 Minuten auf Titan-Objektträger ausgesät werden und unter physiologischen Scherkräften haften. Wie in dieser Abbildung gezeigt, breiten sich EPCs unter dem Einfluss der Strömung von etwa 210 Quadratmikrometern unmittelbar nach der Aussaat auf etwa 657 Quadratmikrometer nach drei Stunden und etwa 1.152 Quadratmikrometer nach 48 Stunden bei einer Fluidscherspannung von 15 Diens pro Quadratzentimeter aus.

Dieses lichtmikroskopische Bild veranschaulicht die zufällige Ausrichtung menschlicher EPCs. Nach einer statischen Sitzperiode von sechs Stunden nach drei Stunden Fluss bei 100 Dins pro Quadratzentimeter haben sich die Zellen ausgebreitet, bleiben aber in einer zufälligen Ausrichtung. Nach 48 Stunden Fluidscherspannung bei 100 Diens pro Quadratzentimeter sind die EPCs ausgerichtet und in Strömungsrichtung ausgerichtet.

Hier wurden EPCs mit CTO markiert und Zellkerne mit Herx gefärbt, um nach dem Fluss zu sterben. Zum Vergleich zeigt dieses Bild Schweine-EPCs auf Titan-Objektträgern in Ausrichtung zur Strömungsrichtung. Nach 48 Stunden Fluss und 15 Diens pro Quadratzentimeter Scherspannungsexposition wurden die Zellränder mit Anti-PCAM-Färbung und die Zellkerne mit Cytoxin-Nukleinsäurefärbung gefärbt.

Diese Methode ermöglicht auch die Entnahme von Proben der PERFUSE acht zu vorgegebenen Zeitpunkten für die Analyse und/oder Quantifizierung von sezernierten Zellmetaboliten. Hier sehen Sie ein Beispiel für die Produktion von Nitrit während eines 48-stündigen Strömungsexperiments mit Schweine-EPCs. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Sterilität durchgehend aufrechtzuerhalten.

Darüber hinaus ist es wichtig, die notwendigen Schritte zu unternehmen, um die Anzahl der Luftblasen in der Strömungskammer vor Beginn des kontinuierlichen Flusses zu reduzieren, da sie die Zellen abreißen können. Wir empfehlen außerdem, jede einzelne Verbindung in der Durchflusskammer und im Kreislauf vor der Profusion zu überprüfen, um ein Austreten von PERFUSE eight während eines Experiments zu verhindern. Diese Kammer ist mit eingebauten O-Ringen ausgestattet, die eine vollständige Gegenüberstellung von Ober- und Unterplatte ermöglichen und eine auslaufsichere Abdichtung bieten, ohne dass Vakuumpumpen erforderlich sind.

Diese Funktion gewährleistet auch eine konstante Kammerhöhe zwischen den Experimenten und macht Gummidichtungen oder Einstellungen überflüssig. In unserer Durchflusskammer werden standardisierte Objektträger verwendet. Daher steht eine große Anzahl von Zellen für weitere Experimente zur Verfügung.

So können beispielsweise RNA und DNA aus Zellen nach dem Fluss für die Proteinsynthese oder Genexpression ausgewertet werden. Unser Schaltungsdesign ermöglicht die Entnahme von acht Perfundproben für die Analyse und Quantifizierung von Zellmetaboliten wie Nitrit, einem primären oxidativen Metaboliten von Stickstoffmonoxid, der von Zellen unter Flüssigkeitsscherstress sezerniert wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie wir unsere Durchflusskammer und unseren sterilen Durchflusskreislauf zusammenbauen, um Adhärenzzellen einer Flüssigkeitsscherbelastung auszusetzen.