Ein Laminar-Flow-basierter Assay zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen

Beginnen Sie damit, einen Objektträger mit einer adhärenten, zytokinstimulierten endothelialen Monoschicht in eine Durchflusskammer zu platzieren.

Diese Endothelzellen exprimieren Oberflächenadhäsionsmoleküle wie Selektine und endothelgebundene Migrationssignale wie Chemokine.

Führen Sie fluoreszenzmarkierte Leukozyten in die Durchflusskammer ein.

Wenn Leukozyten über die endotheliale Monoschicht fließen, binden sie sich an aktivierte Endothelzellen.

Selektine auf Endothelzellen binden an ihre entsprechenden Liganden auf den Leukozyten.

Die Selectin-Liganden-Wechselwirkungen sind schwach und vorübergehend, so dass Leukozyten unter der Kraft eines strömenden Mediums entlang der endothelialen Monoschicht rollen können.

Das Rollen ermöglicht es Leukozyten, mit Chemokinen zu interagieren, Integrine zu aktivieren und einen festen Leukozytenarrest zu fördern.

Anschließend breiten sich die Leukozyten über die endotheliale Monoschicht aus, was auf ihr Potenzial für die Transmigration hinweist, ein entscheidender Schritt in der Immunantwort.

Dieser Assay hilft dabei, den Mechanismus der Adhäsion, Deadhäsion und Transmigration von Leukozyten zu untersuchen, während sie über Endothelzellen perfundiert werden.

Verwenden Sie einen Mikromolaren einer zellpermeierten grün fluoreszierenden Nukleinsäurefärbung, um die Leukozyten fluoreszierend zu markieren. Nach der Markierung inkubieren Sie die Leukozyten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann die Zellen 5 Minuten lang bei 300-mal g, um die Zellen zu pelletieren.

In phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendieren, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen 5 Minuten lang bei 300 mal g. Basierend auf der Flussrate werden 5 Milliliter der Zellen in Assay-Puffer suspendiert. Erhitzen Sie dann ein Wasserbad auf 37 Grad Celsius.

Legen Sie dann eine 50-Milliliter-Perfusionsspritze beiseite und setzen Sie sie auf den Spritzenhalter. Stellen Sie dann die Pumpe auf den Entnahmemodus, wobei das Pumpenvolumen bei 0 Milliliter und der Durchmesser bei 26,70 Millimeter liegt. Befestigen Sie als Nächstes eine Luer-Lock-Kupplung an der Spritze und verbinden Sie den Schlauch mit dem Winkel-Luer-Anschluss mit der Luer-Lock-Kupplung. Befestigen Sie dann das freie Ende des Schlauchs an der Durchflusskammer. Um die Leukozyten an den immobilisierten Blutplättchen zu kleben, verbinden Sie den Objektträger mit der Spritze.

Um die Leukozyten zu perfundieren und dann an einem Bett aus Gefäß- oder Thrombozytenmonoschicht zu haften, befestigen Sie einen zweiten Schlauch an einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, das den Assay-Puffer enthält, und füllen Sie dann den Schlauch mit einer 1-Milliliter-Pipette. Sobald der Schlauch gefüllt ist, drücken Sie ihn zusammen und verbinden Sie ihn mit der Durchflusskammer. Vor der Perfusion der Leukozyten geben Sie 3 Millimolar Calciumchlorid und 2 Millimolar Magnesiumchlorid in die Zellsuspension. Inkubieren Sie die Zellen dann 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Um mögliche in der Kammer und in den Schläuchen festsitzende Luft zu entfernen, wird vor der Perfusion der Zellen mit Assay-Puffer perfundiert. Drücken Sie anschließend die Röhrchen zusammen, um das Ende zu schließen, und schalten Sie den Schlauch vom Assay-Puffer auf die Zellsuspension um, um eingeschlossene Luftblasen im Inneren zu verhindern.

Damit die ersten Zellen ankommen, perfundieren Sie die Zellen mit der entsprechenden Durchflussrate und Scherspannung. Perfusionieren Sie die Zellen weiter und halten Sie die Flussrate und die Scherspannung zwei Minuten lang aufrecht. Nehmen Sie dann sechs Bilder der rollenden und abschreckenden Zellen zwischen 2 und 6 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 10-facher Vergrößerung auf, das an eine Digitalkamera angeschlossen ist.