Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Die hypoxische Einsatzvorrichtung besteht aus sechs Säulen, die in die Vertiefungen einer Sechs einrasten. Das Gas der Bohrlochplatte strömt durch das mikrofluidische Netzwerk am Fuß der Säule und kann über die gasdurchlässige PDMS-Membran diffundieren, wodurch das Gasnetzwerk und die Kulturmedien getrennt werden. Dieses Gerät minimiert die Diffusionsweglänge zwischen der Sauerstoffquelle, dem mikrofluidischen Netzwerk an der Basis der Säule und den Zellen und ermöglicht eine schnellere Sauerstoffkonzentration. Gleichgewicht.

Das Gerät ermöglicht auch eine weitaus größere Kontrolle über das räumliche Muster des Sauerstoffs, das den Zellen ausgesetzt ist, was durch das mikrofluidische Gasnetzwerkdesign bestimmt wird, das durch die Standard-Photolithographie unter Verwendung von Fotomasken hergestellt wird. Hallo, ich bin Sean Ard vom Dr. David Edington Labor am Department of Bioengineering an der University of Illinois in Chicago. Hallo, ich bin Ellie, auch vom Edington Lab.

Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie ein kundenspezifisches Gerät herstellen, validieren und verwenden, um In-vitro-Zellkulturen in einer sechsfachen Platte unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen auszusetzen. Wir haben dieses Verfahren in unserem Labor verwendet, um die Wirkung von Sauerstoff auf die Wundheilung, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und die Migration zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Um mit der Herstellung des sauerstoffhaltigen Einsatzes zu beginnen, bereiten Sie Polymethylsloane oder PDMS in einem Verhältnis von 10 zu eins zwischen Prepolymer und Härter vor. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wird die PDMS-Mischung zu einer zuvor bearbeiteten Dell Ran-Form hinzugefügt, die so strukturiert ist, dass sie die Form einer Standard-Kulturplatte mit sechs Vertiefungen nachahmt. Sobald es über Nacht bei 75 Grad Celsius ausgehärtet ist, bildet das resultierende replikartige geformte Säulenarray die erste von drei Komponenten, aus denen der sauerstoffhaltige Einsatz besteht, um die zweite Schlüsselkomponente des sauerstoffversorgenden Einsatzes herzustellen.

Ein SU-Achter-Master wird vorbereitet, indem zuerst SU 8 21 50 gedreht wird. Auf einem Siliziumwafer wird eine Fotomaske auf den Wafer aufgebracht und der SU eight durch die Fotomaske mit UV belichtet, um eine Masterform mit einer Mikrokanaldicke von 300 Mikrometern zu erzeugen. Gießen Sie PDMS auf den SU eight Master und härten Sie ihn zwei Stunden lang bei 75 Grad Celsius aus, um eine positive Form zu erhalten, die schließlich die Mikrokanäle an der Unterseite jeder Säule bildet.

Die dritte Komponente des Geräts wird hergestellt, indem PDMS 10 Sekunden lang bei 500 U/min auf einem Siliziumwafer gedreht wird, gefolgt von 900 U/min für 30 Sekunden, um ein 100 Mikrometer dickes Membrangehirn zu erhalten. Da PDMs gasdurchlässig sind, kann Sauerstoff direkt durch diese Membran in die Mikrokanäle abgegeben werden. Sobald alle Komponenten vorbereitet sind, wird jede Klebefläche eine Minute lang einer Sauerstoffplasmabehandlung unterzogen.

Mit einem tragbaren Plasmagerät verbinden Sie zunächst die sechs Mikrokanalkomponenten mit dem Säulenarray und stechen dann zwei Löcher in jede Säule, die als Gasein- und -auslässe dienen. Zum Schluss kleben Sie die Membran mit dem Boden des Mikrokanals, um die Verklebung zu erleichtern und Blasen auszustoßen. Die plasmabehandelten Oberflächen werden etwa eine Minute lang mit der Mischung am Ende einer Pinzette zusammengedrückt und warten eine Stunde zwischen jeder Verklebung, um sicherzustellen, dass das Gerät vollständig verklebt ist und kalibriert werden kann.

Sobald ein vollständiges Gerät hergestellt ist, muss die Sauerstoffmenge, die die Zellen bei der Verwendung des sauerstoffhaltigen Einsatzes in tatsächlichen Experimenten erhalten, kalibriert werden. Verwenden Sie zur Kalibrierung einen fluoreszierenden Sauerstoffsensor oder einen foxy Objektträger, der eine fluoreszierende Ruthenium-Farbstoffbeschichtung enthält, die durch Sauerstoff abgeschreckt wird. Foxy Objektträger sind so vorgeschnitten, dass sie in den Boden einer Sechs-Well-Platte passen.

Der Foxy-Objektträger sollte so geschnitten werden, dass er so viel wie möglich von der Vertiefungsoberfläche bedeckt. Da der Foxy-Objektträger eine Dicke von etwa einem Millimeter hat, modifizieren Sie das Gerät so, dass der gewünschte Abstand für eine angemessene Membran eingehalten wird. Diffusion von Objektträgern.

Dieser Abstand hängt vom Experiment ab, sollte aber in den meisten Fällen unter einem Millimeter liegen, wobei das tragbare Plasmagerät mit vier geschnittenen, einen Millimeter dicken Glasmikroskop verbunden ist. Schieben Sie Pfosten von etwa sechs Millimetern Länge und vier Millimetern Breite an die Unterseite des Geräts. Das Gerät ruht auf Pfosten auf dem Schiebeschnitt.

Glasdeckgläser können auch für einen Diffusionsspalt von 0,17 Millimetern verwendet werden, um den Sauerstoffverbrauch zu validieren. Bei drei Millilitern entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur in die Vertiefungen der Sechs-Vertiefungsplatte, wo der Sauerstoff gemessen wird. Platzieren Sie das Gerät in der Platte und wählen Sie mit der Metamorph-Software die Anzahl und Position der gewünschten Positionen auf dem foxy-Sensor aus.

Objektträger zur Messung der Sauerstoffkonzentration. Verbinden Sie den Tai-Pistolenschlauch zwischen dem Sauerstoffgastank und der hypoxischen Einsatzvorrichtung. Ein Präzisions-Durchflussregler, der auf eine Durchflussmenge von 50 bis 100 Millilitern pro Minute eingestellt ist, dient zur Feinsteuerung des geförderten Gases.

Stellen Sie sicher, dass der Präzisions-Durchflussregler geschlossen ist. Öffnen Sie zuerst den Tankregler, dann den Präzisionsregler. Reduzieren Sie die Durchflussmenge nach 15 Minuten auf 10 bis 20 pro Minute.

Um Blasenbildung im Wasser zu vermeiden, beobachten Sie den Durchflussratenwert in der nächsten Stunde genau und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor, da sich der Druckabfall ändert, während das System die Durchflussrate ausgleicht, um Bilder der Platte und der Foxy-Sensoren aufzunehmen. Zum Einsatz kommen ein mit Fluoreszenz ausgestattetes Olympus IX 71 Mikroskop, eine Ladungskoppelkamera, eine Kamera von Q Imaging Tiga, SRV und die Bilderfassungssoftware Metamorpho. Das Mikroskop ist mit einer Olympus 3 1 0 2 0 ausgestattet, einem foxy-kompatiblen Fluoreszenzfilter mit einer Anregungswellenlänge von 475 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 600 Nanometern.

Um die Gleichgewichtszeit und das Ausmaß der Sauerstoffversorgung des Geräts zu testen, wählen Sie drei Punkte auf dem Foxy-Objektträger, an denen die Sauerstoffkonzentration gemessen werden soll. Nehmen Sie unmittelbar vor dem Starten des Gasflusses ein Bild des Objektträgers auf. Nehmen Sie Bilder und Intervalle von 10 Sekunden über 30 Minuten auf, während das Gas durch das Gerät strömt, um die Heterogenität und Sauerstoffzufuhr zu testen.

Legen Sie mehrere Punkte in Abständen von einem Millimeter fest, die sich über die Breite des Kanals erstrecken, und messen Sie die Sauerstoffkonzentration an der Well-Oberfläche mit Metamorph. Exportieren Sie die mittlere Bildintensität für jede Position und stellen Sie die Sauerstoffsättigungskonzentration in Abhängigkeit von der Fluoreszenzintensität dar. Generieren Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie lineare Kurven an die Null- bis 10%-Linie und 10 bis 21%-Linie anpassen, die die Fluoreszenzintensität mit der Sauerstoffkonzentration in Beziehung setzen: Für jede gemessene Position können die Rohintensitätsdaten aus metamorph exportiert und mit Microsoft Excel oder anderer Statistiksoftware weiter analysiert werden.

Sobald das Gerät kalibriert wurde, können Experimente, wie z. B. Wundheilungsassays, damit beginnen, den kalibrierten Einsatz innerhalb von 24 Stunden vor dem Experiment 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius zu autoklavieren und damit in einer Laminar-Flow-Kulturhaube zu arbeiten, um eine spätere Kontamination zu verhindern. Weichen Sie den sterilisierten PDMS-Einsatz 24 Stunden lang in serumfreiem Medium ein, um Gasblasen beim Einführen in die Plattenvertiefungskultur zu hemmen, MDCK-Zellen oder andere adhärente Zellen mit einer Sechs-Well-Platte erzeugen mit einer P 200-Pipettenspitze gerade Kratzer in den Monoschichten. Die Kratzer simulieren Wunden in der anhaftenden Monoschicht.

Saugen Sie das Zellmedium an, ohne die Monoschicht zu stören, und spülen Sie mit fünf Millilitern des Mediums. Erneut aspirieren und die Vertiefungen mit drei Millilitern Serum frei füllen. Medium Führen Sie das Gerät vorsichtig in die Platte ein und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden.

Das Anwinkeln des Geräts während des Einführens hilft, Blasen auf einer Seite auszustoßen. Achten Sie darauf, keinen übermäßigen Druck auf das Gerät auszuüben, da dies das PDMS so verformen könnte, dass die darunter liegenden Zellen zerquetscht werden. Stellen Sie die Platte und das Gerät auf einen bei 37 Grad Celsius beheizten Mikroskoptisch und verbinden Sie die Schläuche vom Quellgastank mit den Einlass- und Auslassöffnungen des Geräts.

Der Kulturinkubator sollte ein Loch haben, um den Zugang zu den Schläuchen zu ermöglichen, und die Schläuche sollten angeschlossen sein. Nachdem Sie das Gerät in den Inkubator eingesetzt haben, befolgen Sie das gleiche Verfahren zum Starten des Gasflusses wie zuvor beschrieben, um die Wundheilung zu beurteilen. Nehmen Sie 15 bis 18 Stunden lang alle 20 Minuten Zeitrafferbilder der Zellen auf, indem Sie Geräte und Bildgebungssoftware wie zuvor beschrieben verwenden. Mit einem Scratch-a-Wundmessalgorithmus kann die nicht verheilte Oberfläche nach einer gewünschten Versuchsdauer analysiert werden. Stoppen Sie den Gasfluss, entfernen Sie die Platte und fahren Sie auf Wunsch mit der weiteren Zellverarbeitung fort. Die hypoxische Einführvorrichtung benötigt weniger als zwei Minuten, um sich auf 0,5 % Sauerstoff zu stabilisieren, wie hier gezeigt.

Die Größe des unteren Spalts der Membranvertiefung des Geräts war ein kritischer Faktor bei der Bestimmung der Äquilibrierungseffizienz, wobei größere Spaltgrößen mehr Zeit benötigten, um die Werte für die Sauerstoffkonzentration im stationären Zustand zu erreichen. Das Gerät ermöglicht auch eine große Kontrolle über die räumliche Sauerstoffversorgung in einer einzigen Vertiefung, was die Bildung mehrerer Bedingungen und sogar die Erzeugung eines zyklischen Sauerstoffprofils über die Oberfläche der Vertiefung ermöglicht. MDCK-Zellmonoschichten wurden mit 10 % oder 21 % Sauerstoff belichtet und die Oberfläche der Wunde wurde im Laufe der Zeit mit Hilfe des MATLAB Ts Scratch Wound Tailing-Algorithmus analysiert.

Nach 11 von insgesamt 17 Stunden blieben 6,87 % der ursprünglichen Wunde übrig, wenn sie 10 % Sauerstoff ausgesetzt waren, während 64,4 % der Wunde unter 21 % bliebenWie hier gezeigt, sind die Sauerstoffkonzentrationen für beide Sauerstoffkonzentrationen negativ mit dem offenen Bereich der Wunde korreliert. Für die Dauer des Experiments haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie das hypoxische Einsatzgerät für einen Kratzwundheilungsassay herstellen, validieren und verwenden. Das Gerät bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Oxygenierungssystemen, wie z. B. einen kleineren Platzbedarf im Labor und eine weitaus bessere Kontrolle über die räumliche und zeitliche Sauerstoffversorgung an der Zelloberfläche.

Das Gerät kann von praktisch jedem Labor verwendet werden, das die Wirkung von Sauerstoff oder anderen Gasen wie Kohlendioxid auf In-vitro-Zellkulturen untersucht. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das sterilisierte Gerät und die Nährmedien über Nacht einzuweichen, um die Blasenbildung während des Experiments zu minimieren. Lassen Sie das System außerdem gleichsetzen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.

Dies liegt daran, dass sich die Durchflussmenge ändert, wenn der Druck im System gleich ist. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.