Name: Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-02T17:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Elektroolfaktogramm-Aufnahme an der Riechschleimhaut der Maus zur Untersuchung olfaktorischer Neuronen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen elektrischer Reaktionen auf Duftstoffe.

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Wir danken Dr. Yijun Song, und die Mitglieder des Hattar Kuruvilla Zhao tri-Labor des Fachbereichs Biologie, Johns Hopkins University für Rat und Hilfe. Unterstützt durch NIH gewährt DC007395 und DC009946.

Teil 1. Die EOG Aufnahme-Setup Die Aufnahme Apparat besteht aus einer Aufnahme, Referenzelektrode, Luft-Zuführungsrohr, Objekttisch und Binokular, alle auf einer Luft-Tabelle in einem Faradayschen Käfig verankert. Mikromanipulatoren sind für die Platzierung der Elektroden und die Luft Zuführungsrohr verwendet. Ein kontinuierlicher Luftstrom wird durch destilliertes Wasser geleitet, um Feuchtigkeit, bevor sie durch die Luft Zuführungsrohr und über die Probe hinzufügen. Ein 60 mm Kulturschale mit Sylgard zu einer Tiefe von 6-8 mm gefüllt ist als Montagefläche für die Probe verwendet. Ein Brunnen und ein Kanal aus dem Sylgard in der Montage Gericht um ein Mittel bereitzustellen, um elektrischen Verbinden der Referenzelektrode auf die Probe über modifizierte Ringer-Lösung ausgehöhlt. Die Aufnahme-Elektrode und der Referenzelektrode sind an einen Verstärker angeschlossen. Signale aus dem Verstärker sind mit einem Digitizer gesendet und dann an einen Computer. Software wie Axograph oder pClamp kann die Stimulation Protokoll steuern, um das Signal aufnehmen, und für die anschließende Analyse der Antworten sein. Ein Oszilloskop nach dem Verstärker angeschlossen werden können für die Echtzeit-Überwachung des elektrischen Potentials beim Aufsetzen der Aufnahme-Elektrode und während EOG Aufnahmen bequem. Lieferung von Geruchsrezeptoren Reize wird durch eine Picospritzer, die auf dem gleichen Computer zur Signalerfassung eingesetzt angeschlossen gesteuert wird. Der Luftdruck an der Picospritzer ist auf 10 psi eingestellt. Ein einziger Lufttank und Regler lassen sich Luft, um sowohl die Luft-Tabelle und die Picospritzer zu versorgen. Eine zweite Luft Tank und Regler wird verwendet, um Luft für die befeuchtete Luft Strom liefern, als dies erfordert einen geringeren Druck und eine große Menge des Luftstroms. Kurz vor der Bereitstellung eines Geruchs Reiz ist die Picospritzer Ausgang mit einem Duftstoff-Flasche angeschlossen. Der Duftstoff-Flasche wird dann an der Luft Zuführungsrohr verbunden. Teil 2: Herstellung von Elektroden Die Aufnahme Elektrode ist ein chlorierten Silberdraht in einer gezogenen Glas mit modifizierten Ringer-Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4, sterilfiltriert) gefüllte Kapillare. Die Bezugselektrode ist eine chlorierten Silberdraht. <ol><li> Installieren Silberdraht in den Elektrodenhalter. Für die Aufnahme Elektrode sollte 1-2 Zentimeter Draht aus dem Ende der Elektrode Halter herausragen. Mehr Draht kann für die Referenzelektrode gelassen werden. </li><li> Um die AgCl Schicht auf den Silberdraht hinzuzufügen, positionieren Sie den Draht in 0,1 M NaCl und verbinden Sie den Elektrodenhalter mit dem Pluspol einer 1,5-9 V DC Stromquelle. Der negative Pol der Stromquelle sollte elektrisch mit dem 0,1 M NaCl-Lösung verbunden werden. Lassen Sie die chloriding Reaktion für 10 Minuten gehen. Zum Ausgleich keine statische Aufladung zwischen der Aufnahme und der Referenz-Elektrode, kurz berühren die Elektroden zusammen, bevor Sie sie auf dem Aufzeichnungsgerät. </li><li> Ziehen Sie eine Glaskapillare mit einer Mikropipette Abzieher. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte etwa 5-10 Mikrometer im Durchmesser sein. </li><li> Verwenden Sie einen Diamanten Bleistift ein Tor und brechen das stumpfe Ende der Kapillare so ~ 2 cm länger als der Silberdraht ist. Fire-Politur das abgeschnittene Ende mit dem Butan Fackel. </li><li> Melt 0,5% Agarose in modifizierter Ringer-Lösung. Ziehen Sie eine kleine Menge des geschmolzenen Agarose-Lösung in die Spitze der Elektrode mit einer Transferpipette. </li><li> Füllen Sie die Kapillare gezogen über 1 / 2 des Weges mit modifizierten Ringer-Lösung (mit einer Spritze, die erhitzt worden und zog einen langen, dünnen Ende haben, ist für diesen Zweck nützlich). Gently flick die Kapillare, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Lagern Sie die gefüllten Elektrode in den Vorratsbehälter mit einer kleinen Menge von modifizierten Ringer-Lösung in den Boden, bis sie bereit sind, verwendet werden sollen. Sobald eine Gewebeprobe wird vorbereitet und bereit für die Aufnahme, installieren Sie eine gefüllte Kapillare über die Aufnahme Drahtelektrode. </li></ol> Teil 3: Vorbereitung Duftstoff-Lösungen Die Geruchsstoffe Amylacetat und Heptaldehyd wecken große Antworten und sind somit eine gute Wahl, wie EOG Stimulanzien. <ol><li> In Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine Reihe von Verdünnungen von Geruchsrezeptoren in Dimethylsulfoxid (DMSO). Als Ausgangspunkt für eine Dosis-Wirkungs-Kurve, bereiten 10-fach Verdünnungen von 5 m bis 5 x 10 -6 M. Machen Sie frische Verdünnungen jeden Tag. </li><li> Weitere verdünnen Geruchsstoffe 50-fach in Wasser durch Mischen von 100 ul verdünnt Lager in DMSO mit 4,9 mLs Wasser in 2 Unzen-Flaschen mit Silikon-Stopfen. Lassen Sie die Lösungen in die Flaschen ins Gleichgewicht für mindestens 30 Minuten. Beachten Sie, dass der Dampf Konzentration von Geruchsstoffen in jeder Flasche unbekannt ist, wird aber in Abhängigkeit von der Konzentration der Duftstoffe in der flüssigen Phase variieren. </li><li> Legen Sie zwei 18-Gauge-Nadel durch das Silizium Anschlag auf provide Eingang und-Ausgang. Die Häfen sollten angeschlossen werden, wenn die Flasche nicht in Gebrauch ist. </li></ol> Teil 4: Aufzeichnung des EOG und Analyse von Daten <ol><li> Sacrifice eine Maus durch CO 2-Euthanasie oder betäubende Überdosierung durch Enthauptung folgten. Entfernen Sie die Haut über den Schädel und sagittal halbieren dem Kopf entlang der Mittellinie. </li><li> Hängen Sie eine Hälfte des Kopfes, medial nach oben auf die Halterung Gericht. Entfernen Sie vorsichtig das Septum der Nasenmuscheln aussetzen. </li><li> Die Schale mit montiertem Gewebe auf die Aufnahme der Bühne. Richten Sie die Bühne, so dass die Aufnahme Lage auf dem Nasenmuscheln unter dem Mikroskop zentriert ist. </li><li> Schalten Sie den Lufttank zu befeuchtete Luft auf die Nasenmuschel Oberfläche liefern. Positionieren Sie die Luftzufuhr Rohr, so dass es etwa 10 mm vom Aufnahmeort. Der Durchfluss wird ~ 600 mL / min. </li><li> Stellen Sie den Verstärker an DC-Modus (AC Verstärkung wird Artefakte in der EOG-Signal zu induzieren) mit Low-Pass-Filter bei 1 kHz, und Verstärkung bei 100X. </li><li> Montieren Sie die Aufnahme-und Referenzelektrode auf der Mikromanipulatoren. </li><li> Senken Sie die Referenz-Elektrode in den Brunnen auf der Montagefläche legen und mit modifizierten Ringer-Lösung, so dass es elektrisch mit dem Gewebe verbunden. </li><li> Vorsichtig das Aufnahme-Elektrode auf die Oberfläche der Nasenmuschel IIb oder III. Die Elektrode sollte kaum berühren die Oberfläche des olfaktorischen Epithels! Wenn die Elektrode in Kontakt mit dem Epithel kommt (dh Abschluss einer elektrischen Schaltung) wird eine gerade Basislinie wird im Oszilloskop angezeigt werden. </li><li> Bringen Sie einen Geruchsstoff Flasche auf die Seite Port auf dem Luft-Zuführungsrohr. </li><li> Auf dem Computer, starten Sie eine Stimulation Protokoll. Die Abtastrate für die Datenerfassung sollte 2 kHz oder höher sein. Die Software löst ein Geruch Puls und Aufzeichnung starten. </li><li> Ein typisches Stimulationsprotokoll kann ein 100-ms Dauer einzelner Impuls, gepaart 100-msec Pulse durch einen 1-Sekunden-Intervall getrennt, oder eine 10-sec Dauerimpuls werden. </li><li> Warten Sie einige Zeit zwischen den Protokollen, so das Gewebe minimal angepasst ist. Eine Minute reicht für flüssige Konzentrationen von Amylacetat und Heptaldehyd bis zu 10 -3 M, bei höheren Konzentrationen können 5 Minuten. Nach der Abgabe hoher Geruchs-Konzentrationen (z. B. am Ende einer Dosis-Wirkungs-Kurve) Restgeruch kann in der Röhre bleiben. Waschen Sie den Luftschlauch mit 95% Ethanol und trocken, bevor Sie fortfahren mit zusätzlichen Gewebeproben. </li><li> Axograph Software bietet Werkzeuge für die Messung wichtigen Parameter der EOG-Signal. Solche Parameter sind die Antwort Amplitude, Latenz, die Zeit bis Spitze, und Zeitkonstanten der Kündigung. Es kann wünschenswert sein, um digital Filter Spuren bei 25 Hz vor der weiteren Analyse. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Parameter für die EOG-Analyse. Verschiedene Parameter der EOG sind besonders nützlich für den Vergleich der Antworten zwischen Mäusen, einschließlich der Reaktion Amplitude, die Latenz (die Zeit zwischen dem Reiz verabreicht wird und die Reaktion beginnt), steigen (die Zeit zwischen dem Start der Reaktion und der Spitze), Zeit bis zur maximalen (die Zeit vom Beginn der Stimulation an die Spitze der Reaktion) und Zeitkonstante der Kündigung (τ, bestimmt durch den Einbau der Decay-Phase der Reaktion auf eine einzelne Exponentialgleichung ). Zum Vergleich der kinetischen Parameter wie Latenz, Anstiegszeit und Zeitkonstante der Kündigung, ist es ratsam, die Spitzenamplitude der Antworten vor der Analyse zu normalisieren. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Vertreter EOG-Signale unter verschiedenen Stimulationsprotokolle. (A) Beispiele für EOGs von einer Maus in Reaktion auf die Stimulation mit steigenden Konzentrationen von Amylacetat. Die schwarze Linie am oberen Rand des Panels zeigt den Zeitpunkt und die Dauer von Geruchsrezeptoren Stimulation. Die Konzentrationen in der Legende sind die Konzentrationen der flüssigen Lösung. (B) Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung im Durchschnitt von fünf Mäusen. Fehlerbalken sind 95% Konfidenzintervall. Ein Rückgang in der Amplitude ist oft bei sehr hohen Konzentrationen Geruch beobachtet. (C) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf ein gekoppeltes-Puls-Stimulation. Ein einzelner kurzer Impuls von Geruchsrezeptoren entlockt Anpassung dauert mehrere Sekunden. (D) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf eine 10-sec anhaltenden Duftstoff Stimulation. Die EOG zeigt Desensibilisierung während der kontinuierlichen Geruchsstoff Präsentation.

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</ol>

Die Mäuse wurden behandelt und mit Methoden, die von der Animal Care und Verwenden Ausschüsse der Johns Hopkins University genehmigt eingeschläfert.

Mit dem Setup in diesem Protokoll beschrieben, wird der Duftstoff Reize an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels Einklang zwischen Gewebe Vorbereitungen, so dass für den Vergleich zwischen Wildtyp und Mutante Mäuse, obwohl die genaue Odoriermittelkonzentration und Dynamik unbekannt sind. Mehrere Faktoren, insbesondere der Aufnahmeort und die Fließgeschwindigkeit des befeuchtete Luft, zu Schwankungen in der EOG. Es sollte darauf geachtet, von ähnlichen Positionen auf der gleichen Nasenmuschel Datensatz Variation zu minimieren. Dies kann leicht durch die konsequente Aufnahme von der gleichen Seite des Kopfes und halten den Fußabdruck des Mikroskops, Geruch Zuführungsrohr und Mikromanipulatoren auf dem Luft-Tabelle unverändert zwischen Gewebeproben erreicht werden. Darüber hinaus sollten Gewebeproben sofort in die befeuchtete Luftstrom untergebracht werden nach der Sektion Austrocknung des Gewebes zu verhindern. EOG-Aufnahmen an Mäusen kann auch mit einer Flüssigkeit Perfusionsapparatur auf präparierten Maus durchgeführt werden Nasenmuscheln 7, 14, 15, oder indem man den Kopf intakt und das Einsetzen der Elektrode in ein kleines Loch über dem Nasenmuscheln 16, 17 gebohrt. Jede Veränderung der EOG Aufnahme hat seine eigenen Stärken: Luft-Phasen-Aufnahmen auf Gewebe Zubereitungen, die als in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren erfordern ein Minimum an Setup und sind am einfachsten zu führen; Aufnahmen mit einer Flüssigkeit Perfusionsapparatur erleichtern den Einsatz von pharmakologischen Reagenzien, obwohl die hydrophoben Charakter vieler Geruchsstoffe erschwert Geruch Lieferung; schließlich Aufnahmen, in denen der Kopf bleibt intakt ist, kann in &quot;künstliche schnüffeln &#39;Experimente verwendet werden, obwohl die Platzierung der Elektroden ist schwieriger, als wenn die Nasenmuscheln sind voll ausgesetzt.

<table><tbody><tr><td>Lufteinspeiseleitung</td><td>Gerät</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td>Der Zylinder einer 1-mL-Spritze mit T-Stück kann als Ersatz verwendet werden</td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>Gerät</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Gerät</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>Computer und Datenerfassungssoftware</td><td>Gerät</td><td>Axograph 4.9.2 auf Apple Macintosh</td><td></td><td>Aktualisierte Versionen von Axograph für Mac OS X und Windows sind verfügbar unter http://axographx.com/.</td></tr><tr><td>Butanbrenner</td><td>Gerät</td><td></td><td></td><td>Ein Cr&amp;#232;me br&amp;#251;l&amp;#232;e-Brenner eignet sich gut</td></tr><tr><td>Digitalisierer</td><td>Gerät</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Gerät</td><td>Scienscope</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>Gerät</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Haltevorrichtungen (12 mm)</td><td>Gerät</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>Gerät</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenzieher</td><td>Gerät</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Gerät</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Gerät</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Schlauch</td><td>Gerät</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparatbühne</td><td>Gerät</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td>Jedes kleine feste Objekt kann verwendet werden, um die Montageschale anzuheben. Die Schale mit Modelliermasse fixieren.</td></tr><tr><td>Nadeln, 18 Gauge</td><td>Material</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen, 2 oz.</td><td>Material</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren</td><td>Material</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Silikonstopfen, Größe 16D</td><td>Material</td><td>Chemware</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht</td><td>Material</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Material</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Von World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Amylacetat</td><td>Reagenz</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Heptaldehyd</td><td>Reagenz</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Reagenz</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Durchflussmesser</td><td>Gerät</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

analysieren antworten der maus riechzellen mit der air-phase electroolfactogram recording

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Tiere abhängen Geruchssinn für viele kritische Verhaltensweisen, wie die Suche nach Nahrung, Vermeidung von Raubtieren, und die Identifizierung Artgenossen zur Paarung und anderen sozialen Interaktionen. Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen, und zuverlässige Methode, um Test Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Seit der 1956 Beschreibung des EOG durch Ottoson in Frösche 1 hat die EOG Aufnahme in vielen Wirbeltieren, einschließlich Salamander, Kaninchen, Ratten, Mäusen und Menschen (Bewertet von Scott und Scott-Johnson, 2002, ref. 2) angewendet worden. Die jüngsten Fortschritte in der genetischen Modifikation in Mäusen haben Interesse an der Aufnahme der EOG für physiologische Charakterisierung der olfaktorischen Funktion in Knock-out neu entfacht und knock-in Mäusen. EOG-Aufnahmen wurden erfolgreich eingesetzt, um die zentrale Rolle der olfaktorischen Signaltransduktion Komponenten 3-8 zeigen, und in jüngerer Zeit auf den Beitrag bestimmter Regulationsmechanismen zu OSN Antworten 9-12 charakterisieren. Odorant Erkennung tritt an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf der Zilien OSNs, wo eine Signaltransduktionskaskade führt zu der Ionenkanäle öffnen und erzeugt einen Strom, der in die Zilien fließt und depolarisiert die Membran 13. Die EOG ist das negative Potential extrazellulär an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf Geruchsstoff Stimulation aufgezeichnet, die sich aus einer Summierung der möglichen Veränderungen von einzelnen reagieren OSNs in der Aufnahme Feld 2 verursacht. Vergleich der Amplitude und Kinetik der EOG somit wertvolle Informationen darüber, wie genetische Modifikation und andere experimentelle Manipulationen Einfluss auf die molekulare Signalwege zugrunde liegenden OSN Reaktion auf Geruch. Hier beschreiben wir eine Luft-Phase EOG Aufnahme auf eine Vorbereitung der Maus olfaktorischen Nasenmuscheln. Kurz, nachdem dabei die Maus, sind die olfaktorischen Nasenmuscheln durch Halbierung der Kopf entlang der Mittellinie und das Entfernen des Septum ausgesetzt. Die Nasenmuscheln Präparat wird dann in den Aufnahme-Setup gelegt, und eine Aufnahme-Elektrode an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf einer der medialen Nasenmuschel platziert. Eine Referenzelektrode ist elektrisch mit dem Gewebe durch eine Pufferlösung verbunden. Ein kontinuierlicher Strom von befeuchtete Luft über die Oberfläche des Epithels, um ihn feucht zu halten geblasen. Der Dampf von Geruchsrezeptoren Lösungen ist in den Strom der befeuchtete Luft auf das Epithel stimulieren aufgeblasen. Antworten werden aufgezeichnet und digitalisiert für die weitere Analyse.

Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen und zuverlässige Methode zur Beurteilung Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Dieses Protokoll beschreibt eine Aufnahme-Setup, Maus Gewebe Vorbereitung, Datenerfassung und grundlegende Analyse der Daten.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Tiere sind für viele kritische Verhaltensweisen auf den Geruchssinn angewiesen, wie etwa das Auffinden von Nahrungsquellen, das Meiden von Fressfeinden und das Identifizieren von Artgenossen zur Paarung und ...

Eine Präparation des Riechepithels wird auf eine Schale montiert und in einen Strom feuchter Luft gebracht. Unter einem Stereomikroskop wird eine Referenzelektrode über eine Pufferlösung elektrisch mit dem Gewebe verbunden. Eine Ableitelektrode wird auf die Oberfläche des Riechepithels platziert.Das Riechepithel wird durch computergesteuerte Duftstoffstöße stimuliert, die in einen Strom feuchter Luft eingebracht werden und so die Duftstoffe zum Riechepithel transportieren. EOG-Signale werden über einen Verstärker und Digitalisierer an den Aufnahmecomputer übertragen. Hallo, ich bin Catherine Ciar vom Hygienelabor XO am Fachbereich Biologie der Johns Hopkins University.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Ableitung des Elektroolfaktogramms von Mäusen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Reaktionen olfaktorischer Sinnesneuronen auf Gerüche zu untersuchen. Beginnen wir also.Die Aufzeichnungsvorrichtung besteht aus einer Ableiteelektrode, einer Referenzelektrode, einer Luftzuführungsröhre, einer Probenträgerplatte und einem Auflichtmikroskop, die alle auf einem Lufttisch innerhalb einer Faradayschen Käfiganordnung befestigt sind. Mikromanipulatoren dienen der Positionierung der Elektroden in der Luftzuführungsröhre. Ein kontinuierlicher Luftstrom wird zur Befeuchtung durch destilliertes Wasser geleitet, bevor er durch die Luftzuführungsröhre und über die Probe strömt.Eine 60 Millimeter große Kulturschale, gefüllt mit Sard, angepasst auf sechs bis acht Millimeter, dient als Montageoberfläche für die Probe. In die Sard in der Montageschale werden eine Vertiefung und ein Kanal ausgehöhlt. Dies dient dazu, über eine modifizierte Ringer-Lösung eine elektrische Verbindung zwischen der Referenzelektrode und der Probe herzustellen.Die Ableit- und Referenzelektroden werden mit einem Verstärker verbunden. Signale vom Verstärker werden an einen Digitalisierer und anschließend an einen Computer gesendet. Die Software XI graph dient zur Steuerung des Stimulationsprotokolls, zur Aufzeichnung des Signals und zur Analyse der Antworten.Ein Oszilloskop ist nach dem Verstärker angeschlossen, um die elektrische Potentialänderung in Echtzeit während des Einbringens der Ableitelektrode und während der EOG-Ableitungen zu überwachen. Die Applikation der Duftstoffreize wird über einen Pico-Spritzer gesteuert, der mit demselben Computer verbunden ist, der auch für die Signalerfassung genutzt wird, unmittelbar vor der Applikation eines Duftstoffreizes.Die Ausgabe des Pico-Spritzers ist mit einer Duftstoffflasche verbunden, die flüssigen Duftstoff enthält. Die Flasche ist anschließend mit dem Luftzufuhrschlauch verbunden. Nun sehen wir uns an, wie man Elektroden für Ableitungsexperimente vorbereitet.Die Ableitelektrode ist ein versilberter Chlorid-Draht in einer gezogenen Glas-Kapillare, die mit modifizierter Ringer-Lösung gefüllt ist. Die Referenzelektrode ist ein versilberter Chlorid-Draht. Beginnen Sie die Vorbereitung beider Elektroden, indem Sie einen Silberdraht in den Elektrodenhalter einsetzen.Für die Ableitelektrode sollten ein bis zwei Zentimeter Draht aus dem Ende des Elektrodenhalters herausragen. Für die Bezugselektrode kann mehr Draht belassen werden. Um die Silberchlorid-Beschichtung aufzubringen, positionieren Sie den Draht in 0,1-molarer Natriumchloridlösung und verbinden Sie den Elektrodenhalter mit dem positiven Pol einer Gleichstromquelle mit 1,5 bis 9 Volt.Der Minuspol der Stromquelle sollte elektrisch mit der 0,1-molaren Natriumchloridlösung verbunden werden. Lassen Sie die Chloridreaktion 10 Minuten lang ablaufen, um jegliche statische Ladung zwischen der Ableitelektrode und der Referenzelektrode auszugleichen. Berühren Sie die Elektroden kurzzeitig gegeneinander, bevor Sie sie am Ableitgerät anbringen.Ziehen Sie anschließend eine Glas-Kapillare mit einem Mikropipettenzuggerät. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte einen Durchmesser von etwa fünf bis 10 Mikrometern aufweisen. Verwenden Sie einen Diamantschreiber, um die stumpfe Endseite der Kapillare einzuritzen und abzubrechen, sodass sie etwa zwei Zentimeter länger als der Silberdraht ist.Verwenden Sie eine Butanflamme, um das geschnittene Ende zu glühen, und schmelzen Sie nun 0,5 % Agaros in modifizierter Ringer-Lösung. Ziehen Sie mit einer Übertragungspipette eine kleine Menge der geschmolzenen Agaros-Lösung in die Spitze der Elektrode, wobei Sie eine Spritze verwenden, die erhitzt und so gezogen wurde, dass sie ein langes, dünnes Ende aufweist. Füllen Sie die gezogene Kapillare etwa zur Hälfte.Mit der modifizierten Ringer-Lösung vorsichtig an der Kapillare klopfen, um eventuelle Luftblasen zu lösen. Die gefüllte Elektrode in dem Aufbewahrungsgefäß mit einer kleinen Menge modifizierter Ringer-Lösung am Boden aufbewahren, bis sie verwendet wird. Sobald eine Gewebeprobe vorbereitet und zur Ableitung bereit ist, eine gefüllte Kapillare über den Ableitungselektrodendraht setzen, wobei die Elektroden bereitstehen müssen.Wir betrachten nun ein Aufnahmeexperiment, um das Gewebe für die Ableitung vorzubereiten. Entfernen Sie die Haut über dem Schädel einer getöteten Maus und halbieren Sie den Kopf entlang der Mittellinie. Befestigen Sie eine Kopfhälfte mit der medialen Seite nach oben in der Montageschale. Entfernen Sie vorsichtig das Septum, um die Conchae zu exponieren.Platzieren Sie die Schale mit dem befestigten Gewebe auf dem Aufnahmetisch. Richten Sie den Tisch so aus, dass die Ableitungsstelle an den Conchae unter dem Mikroskop zentriert ist. Schalten Sie nun den Lufttank ein, um befeuchtete Luft mit etwa 600 Milliliter pro Minute an die Conchasoberfläche abzugeben.Platzieren Sie das Luftzufuhrrohr so, dass es sich etwa 10 Millimeter vom Aufzeichnungsort entfernt befindet. Stellen Sie den Verstärker auf DC-Modus ein, da eine AC-Verstärkung Artefakte im EOG-Signal verursachen würde. Nehmen Sie die Signale mit einem Tiefpassfilter von einem Kilohertz und einer Verstärkung von 100 x auf.Befestigen Sie nun die Ableit- und Referenzelektrode an den Mikromanipulatoren. Senken Sie die Referenzelektrode in die Vertiefung der Montageschale und bedecken Sie sie mit modifizierter Ringer-Lösung, sodass eine elektrische Verbindung zum Gewebe besteht. Senken Sie die Ableitelektrode vorsichtig auf die Oberfläche der Concha bullosa B oder Concha media drei ab.Die Elektrode sollte die Oberfläche des Riechepithels gerade berühren. Wenn die Elektrode mit dem Epithel in Kontakt kommt, erscheint eine gerade Linie als Basislinie auf dem Oszilloskop. Befestigen Sie nun eine Duftstoffflasche an dem Seitenanschluss des Luftzufuhrrohrs am Computer.Starten Sie ein Stimulationsprotokoll. Die Abtastrate für die Datenerfassung sollte zwei Kilohertz oder höher betragen. Die Software wird einen Duftpuls auslösen und mit der Aufzeichnung beginnen.Ein typisches Stimulationsprotokoll kann eine Dauer von 100 Millisekunden umfassen, bestehend aus einem einzelnen gepaarten Puls mit 100 Millisekunden langen Impulsen, die durch ein Intervall von einer Sekunde getrennt sind, oder einem zehnsekündigen dauerhaften Puls. Um die Adaptation zu minimieren, sollte zwischen den Protokollen nach Applikation hoher Duftstoffkonzentrationen eine Pause von einer bis fünf Minuten eingelegt werden. Eventuell verbleibender Duftstoff in der Röhre kann durch Spülen der Luftleitung mit 95 % Ethanol entfernt werden; danach die Leitung trocknen, bevor mit weiteren Gewebeproben fortgefahren wird.Die Axo-Graft-Software bietet Werkzeuge zur Messung wichtiger Parameter des EOG-Signals. Solche Parameter umfassen die Antwortamplitude, Latenz, Zeit bis zum Peak sowie Zeitkonstanten der Abschaltung. Mehrere Parameter des EOG sind besonders nützlich für den Vergleich normalisierter Antworten zwischen Mäusen, darunter die Antwortamplitude, die Latenzanstiegszeit, die Zeit bis zum Peak und die Zeitkonstante der Abschaltung.Hier gezeigt sind OGs einer Maus als Reaktion auf die Stimulation mit zunehmenden Konzentrationen von flüssigem Amylacetat. Die schwarze Linie oben zeigt den Zeitpunkt und die Dauer der Duftstoffstimulation an. Hier sehen wir eine Dosis-Wirkungs-Beziehung, gemittelt über fünf Mäuse; die Fehlerbalken entsprechen 95-%-Konfidenzintervallen.Ein Rückgang der Spitzenamplitude wird häufig bei sehr hohen Duftstoffkonzentrationen beobachtet. Ein Beispiel eines EOG als Antwort auf eine gepaarte Pulssimulation zeigt, dass ein einzelner kurzer Duftstoffpuls eine Anpassung auslöst, die mehrere Sekunden andauert. Dargestellt ist hier ein EOG als Antwort auf 10 Sekunden anhaltende Duftstoffstimulation.Die EOG zeigt eine Desensibilisierung während kontinuierlicher Duftstoffpräsentation. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man das Elektrodenfaktorgramm von Mäusen aufzeichnet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Elektrode lediglich auf der Oberfläche des Epithels zu platzieren und sie nicht unter die Oberfläche einzuführen.Notieren Sie immer von derselben Seite des Kopfes und vermeiden Sie Änderungen am Aufbau, um Variationen zu minimieren. Halten Sie das Gewebe feucht, aber vermeiden Sie die Ansammlung von Flüssigkeitstropfen. Wenn Sie das Gewebe unmittelbar nach der Dissektion unter befeuchtete Luft legen, bleibt es in optimalem Zustand für die Ableitung. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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