Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Ein Präparat aus olfaktorischem Epithel wird auf eine Schale montiert und in einen Strom befeuchteter Luft gegeben. Unter einem Präpariermikroskop wird eine Referenzelektrode durch eine Pufferlösung elektrisch mit dem Gewebe verbunden. Eine Aufzeichnungselektrode wird auf der Oberfläche des Riechepithels platziert.

Das olfaktorische Epithel wird durch computergesteuerte Geruchsblasen stimuliert, die in einen befeuchteten Luftstrom verabreicht werden, der die Geruchsstoffe zum Riechepithel transportiert. EOG-Signale werden über einen Verstärker und einen Digitizer an den Aufnahmecomputer übertragen. Hallo, ich bin Catherine Ciar vom Laboratory of Hygiene XO am Department of Biology der Johns Hopkins University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufzeichnung des Elektroolf-facto-Gramms von Mäusen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Reaktionen von olfaktorischen sensorischen Neuronen auf Gerüche zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Die Aufnahmevorrichtung besteht aus einer Aufnahmeelektrode, einer Referenzelektrode, einem Luftabgaberohr, einem Probentisch und einem Präpariermikroskop, die alle auf einem Lufttisch in einem Faradayschen Käfig verankert sind. Microm-Manipulatoren werden für die Platzierung der Elektroden im Luftförderrohr verwendet. Ein kontinuierlicher Luftstrom wird durch destilliertes Wasser geblasen, um Feuchtigkeit hinzuzufügen, bevor er durch das Luftzufuhrrohr und über die Probe strömt.

Als Aufnahmefläche für die Probe dient eine 60-Millimeter-Kulturschale, gefüllt mit Sarde zur Anpassung von sechs bis acht Millimetern. Aus dem Schutzgitter in der Montageschale sind ein Schacht und ein Kanal ausgehöhlt. Bereitstellung eines Mittels, um die Referenzelektrode über eine modifizierte Ringerlösung elektrisch mit der Probe zu verbinden.

Die Aufzeichnungs- und Referenzelektroden sind an einen Verstärker angeschlossen. Die Signale vom Verstärker werden an einen Digitalisierer und dann an einen Computer gesendet. Die XI-Grafiksoftware wird verwendet, um das Stimulationsprotokoll zu steuern, das Signal aufzuzeichnen und die Reaktionen zu analysieren.

Hinter dem Verstärker ist ein Oszilloskop angeschlossen, mit dem das elektrische Potential beim Platzieren der Aufzeichnungselektrode in Echtzeit überwacht werden kann. Und bei EOG-Aufnahmen. Die Abgabe der Odorierreize wird durch eine Pico-Schorle gesteuert, die mit demselben Computer verbunden ist, der für die Signalerfassung verwendet wird, kurz bevor ein Odoriermittelreiz abgegeben wird.

Der Ausgang der Pico-Schorle ist mit einer Odoriermittelflasche verbunden, die flüssiges Odormittel enthält. Anschließend wird die Flasche mit dem Luftförderschlauch verbunden. Sehen wir uns nun an, wie man Elektroden für die Aufzeichnung von Experimenten vorbereitet.

Bei der Aufzeichnungselektrode handelt es sich um einen Chlorid-Silberdraht in einer gezogenen Glaskapillare, die mit modifizierter Ringerlösung gefüllt ist. Die Referenzelektrode ist ein Chlorid-Silberdraht. Beginnen Sie mit der Vorbereitung beider Elektroden, indem Sie einen Silberdraht in den Elektrodenhalter einsetzen.

Für die Aufzeichnungselektrode sollten ein bis zwei Zentimeter Draht aus dem Ende des Elektrodenhalters herausragen. Für die Referenzelektrode kann mehr Draht übrig bleiben. Um die Silberchloridbeschichtung hinzuzufügen, positionieren Sie den Draht in 0,1 molaren Natriumchlorid und verbinden Sie den Elektrodenhalter mit dem Pluspol einer 1,5- bis Neun-Volt-Gleichstromquelle.

Der Minuspol der Stromquelle sollte elektrisch mit der 0,1 molaren Natriumchloridlösung verbunden werden. Lassen Sie das Chlorid 10 Minuten lang reagieren, um die statische Aufladung zwischen der Aufzeichnung und der Referenzelektrode auszugleichen. Berühren Sie die Elektroden kurz aneinander, bevor Sie sie am Aufnahmegerät anbringen.

Ziehen Sie anschließend mit einem Mikropipettenabzieher an einer Glaskapillare. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte einen Durchmesser von etwa fünf bis 10 Mikrometern haben. Verwende einen Diamantstift, um das stumpfe Ende der Kapillare zu ritzen und abzubrechen, so dass es etwa zwei Zentimeter länger ist als der Silberdraht.

Verwenden Sie einen Butanbrenner, um das abgeschnittene Ende zu brandpolieren, schmelzen Sie nun 0,5%Agros in modifizierter Ringerlösung. Ziehe mit einer Transferpipette eine kleine Menge geschmolzener Agrolösung in die Spitze der Elektrode, indem du eine Spritze verwendest, die erhitzt und gezogen wurde, um ein langes, dünnes Ende zu erhalten. Fülle die gezogene Kapillare etwa zur Hälfte.

Mit modifizierter Ringerlösung schnippen Sie vorsichtig mit der Kapillare, um alle Luftblasen zu entfernen. Bewahren Sie die gefüllte Elektrode im Vorratsglas mit einer kleinen Menge modifizierter Ringerlösung am Boden auf, bis sie verwendet werden kann. Sobald eine Gewebeprobe vorbereitet und für die Aufzeichnung bereit ist, installieren Sie eine gefüllte Kapillare über dem Aufzeichnungselektrodendraht, wobei die Elektroden bereit sind.

Schauen wir uns ein Aufzeichnungsexperiment an, um mit der Vorbereitung von Gewebe für die Aufzeichnung zu beginnen. Entfernen Sie die Haut über dem Schädel einer geopferten Maus und halbieren Sie den Kopf entlang der Mittellinie, montieren Sie eine Hälfte des Kopfes mit der medialen Seite nach oben auf der Montageschale. Entfernen Sie vorsichtig das Septum, um die Nasenmuscheln freizulegen.

Stellen Sie die Schüssel mit dem montierten Taschentuch auf die Aufnahmebühne. Richten Sie den Tisch so aus, dass der Aufnahmeort auf den Nasenmuscheln unter dem Mikroskop zentriert ist. Schalten Sie nun den Lufttank ein, um befeuchtete Luft mit etwa 600 Millilitern pro Minute an die Nasenmuscheloberfläche abzugeben.

Positionieren Sie das Luftzufuhrrohr so, dass es etwa 10 Millimeter vom Aufnahmeort entfernt ist. Stellen Sie den Verstärker auf den DC-Modus, da die AC-Verstärkung Artefakte im EOG-Signal induziert. Erfassen Sie mit einem Tiefpassfilter von einem Kilohertz und einer Verstärkung von 100 x.

Montieren Sie nun die Aufzeichnungs- und Referenzelektroden an den Mikromanipulatoren. Senken Sie die Referenzelektrode in die Vertiefung an der Eindeckschale ab und bedecken Sie sie mit modifizierter Ringerlösung, so dass sie elektrisch mit dem Gewebe verbunden ist. Senken Sie die Aufzeichnungselektrode vorsichtig auf die Oberfläche der Nasenmuschel zwei B oder drei ab.

Die Elektrode sollte die Oberfläche des Riechepithels kaum berühren. Wenn die Elektrode mit dem Epithel in Kontakt kommt, erscheint eine gerade Basislinie auf dem Oszilloskop. Befestigen Sie nun eine Odormittelflasche an der seitlichen Öffnung am Luftförderrohr des Computers.

Starten Sie ein Stimulationsprotokoll. Die Abtastrate für die Datenerfassung sollte zwei Kilohertz oder höher betragen. Die Software löst einen Geruchsimpuls aus und beginnt mit der Aufnahme.

Ein typisches Stimulationsprotokoll kann ein 100 Millisekunden dauernder, einzelner Impuls gekoppelter, 100 Millisekunden langer Impuls sein, der durch ein Intervall von einer Sekunde oder einen zehn Sekunden anhaltenden Impuls getrennt ist. Um die Anpassung zu minimieren, sollten Sie nach der Abgabe hoher Geruchskonzentrationen zwischen den Protokollen ein bis fünf Minuten einplanen. Restgeruch kann im Röhrchen verbleiben, waschen Sie das Luftrohr mit 95 % Ethanol und trocknen Sie es, bevor Sie mit weiteren Gewebeproben fortfahren.

Die Axo-Transplantatsoftware bietet Werkzeuge zur Messung wichtiger Parameter des EOG-Signals. Zu diesen Parametern gehören die Antwortamplitude, die Latenz, die Zeit bis zur Spitze und die Zeitkonstanten der Beendigung. Mehrere Parameter des EOG sind besonders nützlich für den Vergleich normalisierter Reaktionen zwischen Mäusen, einschließlich der Antwortamplitude, der Latenzanstiegszeit, der Zeit bis zum Peak und der Zeitkonstante der Terminierung.

Hier sind OGs einer Maus als Reaktion auf eine Stimulation mit steigenden Konzentrationen von flüssigem Amylacetat zu sehen. Die schwarze Linie oben zeigt den Zeitpunkt und die Dauer der Odormittelstimulation an. Hier sehen wir eine Dosis-Wirkungs-Beziehung, gemittelt von fünf Mäusen, Fehlerbalken sind 95%-Konfidenzintervalle.

Eine Abnahme der Peakamplitude wird häufig bei sehr hohen Geruchskonzentrationen beobachtet. Ein Beispiel für einen EOG als Reaktion auf eine gepaarte Pulsstimulation ist zu sehen: Ein einzelner kurzer Impuls des Odoriermittels löst eine mehrere Sekunden dauernde Anpassung aus. Hier ist ein EOG als Reaktion auf 10 Sekunden anhaltende Stimulation des Odoriermittels zu sehen.

Der EOG zeigt eine Desensibilisierung während der kontinuierlichen Odormittelpräsentation. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie das Elektrodenfaktorgramm von Mäusen aufzeichnen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Elektrode nur auf der Oberfläche des Epithels zu platzieren und nicht in die Elektrode unter der Oberfläche einzudringen.

Nehmen Sie immer von der gleichen Seite des Kopfes auf und vermeiden Sie Änderungen am Setup, um Schwankungen zu minimieren, das Gewebe feucht zu halten, aber ohne Flüssigkeitströpfchen zu sammeln, halten Sie das Gewebe unmittelbar nach der Dissektion unter die befeuchtete Luft, um das Gewebe im besten Zustand für die Aufnahme zu halten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.