Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen
19. Juli 2024
Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.
Wir interessieren uns für die Evolution, Übertragung und molekularen Mechanismen, die der Antibiotikaresistenz zugrunde liegen. Die Arbeit, die in dieses Papier einfließt, entspringt unserem Interesse an Umweltresistenz. Derzeit versuchen wir, eine lokale Datenbank aufzubauen, um die räumliche zeitliche Variation der Antibiotikaresistenz anhand von Daten aus einem Jahr zu verfolgen.
Eine Kombination aus kulturbasierten Techniken und Genomik wird verwendet, um antimikrobielle Resistenzen zu erkennen und zu überwachen. Die DNA aus Proben wird einer PCR- oder Shotgun-Sequenzierung unterzogen, um ein Profil der mikrobiellen Vielfalt zu erstellen und Resistenzgene nachzuweisen. Darüber hinaus werden Metabarcoding und genbasierte AMR-Panels für die fortschrittliche AMR-Erkennung verwendet.
Es ist bekannt, dass fragmentierte DNA mit niedrigem Molekulargewicht ein Reservoir für AMR-Gene ist, aber es wurde wenig Wert auf die Entwicklung von Methoden gelegt, die speziell für die Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute entwickelt wurden. Unsere Arbeit konzentriert sich darauf, diese Lücke zu schließen. Unser Protokoll führt einen einfachen Vorverarbeitungsschritt ein, um den Anteil der aus dem Abwasser extrahierten DNA mit niedrigem Molekulargewicht anzureichern.
Dadurch werden umweltbedingte AMR in ihrer Gesamtheit erfasst, ohne freie DNA-Fraktionen auszuschließen. Dieses Protokoll kann mit etwas mehr Arbeit zu einer kit-freien Methode weiterentwickelt werden. Dies wiederum ebnet den Weg für die Entwicklung kostengünstiger Techniken zur Abscheidung von umweltbedingten AMR.
Wir wollen über die Mutationsresistenz hinausgehen und den Beitrag nicht-genetischer Mechanismen zur Antibiotikaresistenz untersuchen. Wir sind insbesondere daran interessiert, die relativen Beiträge von horizontalem Gentransfer und genomischen Mutationen zur Anpassung an Antibiotika in verschiedenen Umgebungen zu vergleichen.
Übersicht
Diese Studie entwickelt eine neuartige Technik zur Beurteilung der umweltbedingten antimikrobiellen Resistenz (AMR), indem extrazelluläre DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus Abwasserproben angereichert wird. Das Protokoll ermöglicht den Nachweis genomischer und horizontal übertragener AMR-Gene und bietet eine kostengünstige, auf Kits verzichtende Methode zur Verfolgung der umweltbedingten AMR.
Wesentliche Studienbestandteile
Forschungsbereich
- Antibiotikaresistenz (AMR)
- Umweltmikrobiologie
- Molekulare Genetik
Hintergrund
- Die Entwicklung und Übertragung von Antibiotikaresistenzen in Umweltbereichen
- Aktuelle Mängel bei Techniken zur Extraktion von DNA mit hohem Ertrag und niedrigem Molekulargewicht
- Die Bedeutung der Verfolgung von AMR für die öffentliche Gesundheit
Verwendete Methoden
- PCR- und Shotgun-Sequenzierung zur Profilierung der mikrobiellen Diversität
- Verwendung von Polyethylenglykol und Natriumchlorid zur DNA-Extraktion
- Erweiterte AMR-Detektion mittels Metabar-Codierung und genbasierten Panels
Hauptergebnisse
- Verbesserte Extraktion von lineärer und niedermolekularer DNA
- Erfolgreiche Anreicherung sowohl genomischer als auch freier DNA-Fraktionen, die mit AMR assoziiert sind
- Grundlegende Arbeit für zukünftige Entwicklungen in Methoden zur Detektion von umweltbedingter AMR
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet eine effiziente Methode zur Bewertung der umgebungsbedingten AMR
- Fördert weitere Forschung zu genetischen und nicht-genetischen Faktoren, die zur Antibiotikaresistenz beitragen
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die umfassende Detektion von antimikrobieller Resistenz (AMR) in Umweltproben ist entscheidend für die frühzeitige Risikobewertung und die öffentliche Gesundheitsüberwachung. Eine verbesserte Extraktion von DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus Abwasser ermöglicht ein vollständigeres Profiling von AMR-Genreservoiren, einschließlich jener, die durch horizontalen Gentransfer verbreitet werden. Diese Fähigkeit stärkt das Vorhersagevertrauen in die Umweltüberwachung von AMR und unterstützt Portfolioentscheidungen für Überwachungs- und Minderungsstrategien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Umweltreservoiren für AMR-Gene jenseits der intrazellulären DNA.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Mobilitäts- und Übertragungswegen von AMR-Genen.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bei Umweltrisikomodellen für das Auftreten von AMR.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung von DNA-Proben, die für metagenomische und PCR-basierte AMR-Panels geeignet sind.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays durch Standardisierung der Extraktion fragmentierter und extrazellulärer DNA.
- Ermöglicht den zuverlässigen Nachweis seltener AMR-Genfragmente für die nachgeschaltete Analyse.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft die umweltbezogene Überwachung von antimikrobieller Resistenz (AMR) mit der translationale Biomarker-Entdeckung für die öffentliche Gesundheit.
- Unterstützt den nahtlosen Übergang von der umweltbezogenen Detektion zur präklinischen Risikobewertung der Ausbreitung von AMR.
- Ermöglicht eine mechanistische Risikominimierung, indem sowohl genetische als auch horizontal übertragene Resistenzelemente erfasst werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Extraktionsmethode ist in die Umweltüberwachungspipeline integriert, die von der Probenentnahme über die metagenomische Analyse bis zur Profilierung von AMR-Genen reicht.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zur Prävalenz und Mobilität von AMR-Genen in Abwasserumgebungen.
- Screening: Standardisiert die DNA-Extraktion für reproduzierbare, quantitative Nachweise von AMR-Genen.
- Analytik: Liefert DNA mit hoher Ausbeute und niedrigem Molekulargewicht für robuste vergleichende Analysen über Proben und Zeitpunkte hinweg.
- Translationale Forschung: Verbindet den Nachweis von AMR in der Umwelt mit Strategien für Biomarker in der öffentlichen Gesundheit.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein skalierbares, unabhängiges Protokoll, das an verschiedene Umweltmatrices angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der AMR-Überwachung, indem fragmentierte und extrazelluläre DNA erfasst wird.
- Operationaler Wert: Bietet ein standardisiertes Extraktionsverfahren mit hohem Ertrag, das für die routinemäßige Überwachung geeignet ist.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Entscheidungen über Maßnahmen zur Minderung von AMR und über Investitionen in die Überwachung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zur Umweltüberwachung von AMR.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt Fachkenntnisse in der Extraktion von Umwelt-DNA und in nachfolgenden molekularbiologischen Analysen.
- Erfordert Zugang zu Zentrifugation, Spektrophotometrie und einer Standardinfrastruktur der Molekularbiologie.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um reproduzierbare Probenaufarbeitung und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Kann an verschiedene Arten von Abwasser- und Umweltproben angepasst werden, sofern die Protokolloptimierung erfolgt.
- Ist dadurch eingeschränkt, dass fragmentierte DNA sorgfältig behandelt werden muss, um Verluste während der Aufarbeitung zu vermeiden.
