Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinalganglienzellen oder RGcs sind Neuronen des zentralen Nervensystems, die visuelle Informationen von der Netzhaut über den Sehnerv an das Gehirn weiterleiten. In dem begleitenden Video wurde eine Methode zur ex-sodomitischen oder durchtrennenden Verletzung der Axone der gesamten RGc-Population als Modell für apoptotischen neuronalen Zelltod im adulten zentralen Nervensystem dargestellt. Hier wird diese Methode mit Verfahren kombiniert, die direkt neurotrope Faktoren, kurze interferierende RNAs, Plasmide oder virale Vektoren, die anti-ATO-Proteine kodieren, verletzten Retinalganglienzellen oder der Netzhaut zuführen, um die Netzhaut global zu beeinflussen.

Ein Injektionsgerät für intraokulare Injektionen wird zusammengestellt und verwendet, um Substanzen in die Glaskörperhöhle des Auges zu injizieren, um gezielt retinale Ganglienzellen anzusprechen. Entweder wird Gelfoam platziert oder eine Hamilton-Spritze verwendet, um Substanzen in den Sehnerv zu injizieren. Ergebnisse der Stumpfabbildung deuten darauf hin, dass die Überlebensrate retinaler Ganglienzellen durch die Zufuhr antiapoptotischer Faktoren erhöht werden kann.

Mithilfe dieser Techniken kann diese Methode verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die an der Apoptose von adulten Neuronen im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, da der Sehnervschnitt ein reproduzierbares Modell für die neuronale Apoptose im adulten ZNS darstellt. Im Allgemeinen haben Anfänger Schwierigkeiten mit dieser Technik, da sie die Linse beschädigen, wenn sie die Glaspipette in die Glaskörperhöhle des Auges einführen. Um das Spritzen-System für intraokulare Injektionen vorzubereiten, entfernen Sie zunächst jede Nadel oder RN-Mutter.

10 Mikroliter in einer gastdichten Hamilton-Spritze, Typ 1701, bereitstellen. Die PFA-Ferrule in die konische Ferrule des Kompressionsverschraubungsstücks einsetzen. Anschließend das komplette Verschraubungsteil in das Ende der Spritze einsetzen und die RN-Mutter locker darüber anschrauben.

Stecken Sie ein Ende eines 1/16-Zoll-Peak-Schlauchs durch die Öffnung in der RN-Mutter in die Kompressionsverschraubung. Stellen Sie sicher, dass der Peak-Schlauch vollständig eingesetzt ist. Ziehen Sie die RN-Mutter fest, um die Dichtung zu komprimieren, wodurch der Peak-Schlauch abgedichtet wird.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an beiden Enden des dualen RN-Glaskopplers. Befestigen Sie das freie Ende des Spitzenrohrs an einem Ende des dualen RN-Glaskopplers, indem Sie die RN-Mutter festziehen. Die Glasmikropipette bildet die Nadel und den Kolben für das Injektionssystem.

Setzen Sie die Glaspipette in das freie Ende des doppelten RN-Glasverbinders ein. Ziehen Sie die RN-Mutter fest, um die Pipette zu fixieren. Erstellen Sie unter einem Stereomikroskop eine Spitze mit dem geeigneten Durchmesser, indem Sie eine gezogene Mikropipette schräg halten und die Spitze an der mattierten Glasfläche eines Objektträgers entlangreiben, um einen Bruch zu erzeugen.

Die Endspitze sollte idealerweise leicht abgeschrägt sein. Als Nächstes ein Priming-Kit der Hamilton Syringe Company verwenden, das mit Spritze, Spitzen-Röhrchen-Verbindungsstück, doppeltem RN-Glaskupplungsstück und der Glasmikropipette mit Mineralöl gefüllt ist, um es zu benutzen. Ersetzen Sie mit dem hydraulischen Injektionssystem die Nadel durch eine Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel.

Bringen Sie anschließend eine Gummiseptum über die Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel an, um beim Einspritzen des Mineralöls eine Abdichtung zu gewährleisten. Stecken Sie die Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel der Spülspritze in das hintere Ende des Zylinders der 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze des Injektionssystems. Drücken Sie das Septum fest gegen das Ende der Spritze, um eine Abdichtung zu erzeugen.

Drücken Sie den Kolben langsam herunter, sodass das Mineralöl durch die Glasbestandteile des Injektionssystems fließt. Füllen Sie die Glaspipette. Drücken Sie das gesamte Öl durch das Injektionssystem, um eventuelle Luftblasen entlang der Bahn zu entfernen.

Wenn die Füllspritze an Mineralöl zur Neige geht, die Nadel langsam zurückziehen, während kontinuierlich Öl abgegeben wird. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, die Spülspritze erneut mit Öl befüllen und erneut injizieren. Wenn das gesamte System mit Mineralöl gefüllt ist, den ursprünglichen Kolben der 10-Mikroliter-Spritze einsetzen.

Hamilton-Spritze: Drücken Sie den Kolben vollständig herunter, um zusätzliches Mineralöl aus dem System zu entfernen. Reinigen Sie die Glas-Mikropipette und das Ende der Spritze. Ziehen Sie mit 70 % Ethanol den Kolben bis zur Zweimikrolitermarke am Zylinder zurück.

Das Ende der Glas-Mikropipette füllt sich mit Luft und bildet so eine Pufferzone zwischen dem Mineralöl und der zu injizierenden Flüssigkeit. Füllen Sie den Pipettenkörper, indem Sie das Ende der Mikropipette in die gewünschte Lösung tauchen und den Kolben der Hamilton-Spritze zurückziehen. Für eine intravitreale Injektion wird in das Auge einer erwachsenen Ratte nicht mehr als vier bis fünf Mikroliter der Lösung injiziert.

Schalten Sie zunächst den Gasfluss auf den Gasmaske-Aufsatz für den stereotaktischen Rahmen um. Anschließend platzieren Sie eine mit Isofluran anästhesierte Ratte in der stereotaktischen Vorrichtung. Reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 2 % und überwachen Sie die Anästhesie.

Bedecken Sie das Tier mit einer chirurgischen Decke. Um die Körpertemperatur während der Operation aufrechtzuerhalten, öffnen Sie die Augenlider und geben Sie einen Tropfen anästhetische Lösung auf die Augenoberfläche. Für die Injektion auf der Hornhautoberfläche werden zwei Personen benötigt: Eine Person führt die Glaspipette in die Glaskörperhöhle ein und hält die Pipettenposition stabil.

Und eine weitere, um den Kolben der Spritze niederzudrücken, wodurch die gewünschte Lösung appliziert wird. Unter einem Operationsmikroskop halten Sie die Glas-Mikropipette und den dualen RN-Glas-Koppler fest, spreizen die Augenlider zu einer V-Form entgegengesetzt der Injektionsstelle. Mit den Fingern hebt sich das Auge aus der Augenhöhle heraus. Führen Sie die Spitze der Glas-Mikropipette vorsichtig in einem gefäßfreien Bereich durch die Sklera in abwärts gerichtetem Winkel ein.

Wenn die Pipette in die Sklera eindringt, ist ein kleiner Druckabfall spürbar. Die Person, die die Spritze hält, sollte nun vier Mikroliter Lösung injizieren, indem sie den Kolben bis zur Zwei-Mikroliter-Markierung auf der Spritze herunterdrückt. Die Injektion sollte ungefähr ein bis zwei Sekunden dauern.

Die erfolgreich injizierte Lösung spült durch die Glaskörperkammer, halten Sie die Mikropipette etwa fünf Sekunden lang stabil und ziehen Sie sie dann in dieselbe Richtung zurück, in der die Nadel eingeführt wurde. Die Bindehaut legt sich anschließend wieder über die kleine Öffnung und trägt so zur Versiegelung der skleralen Punktion bei. Sobald die Operation abgeschlossen ist, schalten Sie das Isofluran aus und lassen Sie das Tier mehrere Minuten lang Sauerstoff atmen. Bedecken Sie die Oberfläche der Hornhaut mit einem Augensalbe für die Augenheilkunde, um eine Austrocknung der Hornhaut während der Erholungsphase zu verhindern, nehmen Sie das Tier danach aus dem stereotaktischen Gerät und bringen Sie es in den Erholungskäfig zurück.

Um retinale Ganglienzellen durch retrograden Transport nach einer Exotomie zu manipulieren. Führen Sie zunächst einen Sehnervdurchtrennungsversuch gemäß den Anweisungen im begleitenden Video-Protokoll „Sehnervdurchtrennung“ durch, 2, 2 4, 1 Tracer, Medikamente. Plasmide, siRNAs oder virale Vektoren können auf den Sehnervstumpf aufgebracht werden.

Es gibt zwei Hauptmethoden, um dieses Verfahren durchzuführen: mithilfe von Gelatineschwamm oder durch direkte Injektion in den Sehnerv. Wenn die Gelatineschwamm-Methode verwendet wird, muss sichergestellt werden, dass die retinalen Ganglienzellen zuvor durch Injektion von retrograden Tracern in den Colliculus superior eine Woche vor der Taxonomie markiert wurden. Unmittelbar nachdem der Sehnerv durchtrennt wurde, wird ein kleines Stück Gelatineschwamm, das in der experimentellen Lösung getränkt ist, auf den durchtrennten Sehnervstumpf gelegt; anschließend werden die Orbitainhalte an ihre ursprüngliche Position zurückverlagert.

Wenn das Auge in eine neutrale Position zurückgebracht wird, verwenden Sie eine Pinzette, um das Gelatineschwämmchen in die Orbita zu schieben, wobei sichergestellt werden muss, dass es über dem Ende des Sehnervs verbleibt. Die Injektionstechnik ist effektiver für die Applikation von Substanzen, die Zugang zum Zytoplasma des Axons erlangen müssen, um durch axonale Rückwärtsbeförderung mittels zytoplasmatischen Flusses transportiert zu werden. Eine dicht schließende 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze wird verwendet, um die gewünschte Lösung in den durchtrennten Sehnerv zu injizieren. Eine Nadel mit kurzem Abschrägungswinkel ist von Vorteil.

Füllen Sie die Spritze mit 10 Mikrolitern der zu injizierenden Lösung. Typischerweise irna-Plasmide oder virale Vektoren, um den Rand des Sehnervs mit feinen Dumont-Forceps zu fassen. Führen Sie die Nadelspitze parallel zum Nerv in den Sehnerv ein.

Bis die Abschrägung nicht mehr sichtbar ist, wird die eingeführte Nadel von allen Seiten vom Nerv umschlossen. Sobald die Nadel eingeführt ist, drücken Sie vorsichtig die Seiten des Nervs mit der feinen Pinzette zusammen und injizieren ein Viertel der Lösung, während Sie die Spritze drehen. Eine Vierteldrehung im oder gegen den Uhrzeigersinn.

Wiederholen Sie diese Schritte, bis eine vollständige Drehung der Nadel abgeschlossen ist und der gesamte Inhalt der Spritze injiziert wurde. Entfernen Sie die Spitze der Spritze vom Nerv. Lassen Sie jegliche injizierte Flüssigkeit, die aus dem Nerv zurückfließt, im Orbit, da sie einen zusätzlichen Vorrat für die Aufnahme durch die Enden der Axone bildet.

Bringen Sie den Inhalt der Orbita in die ursprüngliche Position zurück, schließen Sie die Wunde und lassen Sie das Tier sich erholen. Die Tiere sollten nach der Operation einzeln untergebracht werden. Postoperative Analgetika sollten gemäß den Richtlinien Ihrer Tierversuchseinrichtung verabreicht werden.

Behörden und Tiere sollten nach der Operation sorgfältig überwacht werden. Wie in diesem Video gezeigt, können RGCs direkt angegriffen werden, indem Peptide, Wirkstoffe, Vektoren, Plasmide oder siRNAs in den durchtrennten Sehnervenstumpf injiziert werden. In diesem repräsentativen Beispiel wurde eine retrograde Markierung mit Fluoro-Gold durchgeführt und anschließend sofort drei markierte Peptide in den Sehnerv injiziert.

Im Anschluss erfolgte die Live-Bildgebung der Netzhaut, um zu verhindern, dass die Peptide während der Fixierung aus dem Gewebe auswaschen, wie hier zu sehen ist: Drei mit SI markierte Peptide, die in den Sehnerv injiziert wurden, wurden retrograd effektiv zurück zu den RGC-Somata in der Netzhaut transportiert. In diesem Beispiel wurden drei mit SI markierte siRNAs in den Sehnervstumpf injiziert. Unmittelbar nach der Sehnervdurchtrennung wurde erneut eine Live-Bildgebung der Netzhaut durchgeführt, und es zeigte sich, dass die mit SI markierten siRNAs, die in den Sehnerv injiziert worden waren, retrograd von den RGCs transportiert wurden, wie durch ihre Kolokalisation angezeigt wird.

Mit der Fluorgold-Retrogrademarkierung kann diese Technik, einmal beherrscht, bei korrekter Durchführung in Sekunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Linse nicht zu beschädigen. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit viralen Partikeln äußerst gefährlich sein kann, und die institutionellen Richtlinien für den Umgang mit biohazardstoffen sollten stets befolgt werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.