Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinale Ganglienzellen oder RG cs sind Neuronen des zentralen Nervensystems, die visuelle Informationen von der Netzhaut über den Sehnerv an das Gehirn übertragen. Im Begleitvideo wurde eine Methode zur Exsodomisierung oder Durchschneidung der Axone der gesamten RGC-Population als Modell für den apoptotischen neuronalen Zelltod im adulten Zentralnervensystem demonstriert. Hier wird diese Methode mit Verfahren gekoppelt, die direkt auf neurotrophe Faktoren, kurze interferierende RNAs, Plasmide oder virale Vektoren abzielen, die Anti-ATO-Proteine für verletzte Ganglienzellen der Netzhaut kodieren, oder die Netzhaut, um die Netzhaut global anzugreifen.

Ein intraokularer Injektionsapparat wird zusammengebaut und verwendet, um Substanzen in die Glaskammer des Auges zu injizieren, die spezifisch auf retinale Ganglienzellen abzielen. Entweder wird Gelfoam platziert oder eine Hamilton-Spritze verwendet, um Substanzen in den Sehnerv zu injizieren. Die Ergebnisse der Stumpfbildgebung deuten darauf hin, dass das Überleben der retinalen Ganglienzellen durch die Verabreichung von anti-apoptotischen Faktoren erhöht werden kann.

Mit diesen Techniken kann diese Methode verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die an der Apoptose adulter Neuronen im Zentralnervensystem beteiligt sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose von Erkrankungen des Zentralnervensystems, da die Durchtrennung des Sehnervs ein reproduzierbares Modell für die neuronale Apoptose im erwachsenen ZNS ist. Im Allgemeinen haben diejenigen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, weil sie die Linse beschädigen, wenn sie die Glaspipette in die Glaskammer des Auges einführen. Um das Spritzensystem für intraokulare Injektionen vorzubereiten, entfernen Sie zunächst alle Nadeln oder RN-Muttern.

Erhältlich auf einer 10 Mikroliter rn gast dichten 1701 Hamilton Spritze. Setzen Sie das PFA Feral in den Peak Cup Feral der Klemmverschraubung ein. Stecken Sie dann die komplette Armatur in das Ende der Spritze und schrauben Sie die RN-Mutter locker darüber.

Führen Sie ein Ende eines 16-Zoll-Spitzrohrs durch die Öffnung in der RN-Mutter in die Klemmverschraubung ein. Stellen Sie sicher, dass der Schirmschlauch vollständig sitzt. Ziehen Sie die RN-Mutter fest, um die Feral zusammenzudrücken, wodurch der Peak-Schlauch abgedichtet wird.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an beiden Enden der Dual-RN-Glaskupplung. Befestigen Sie das freie Ende des Peak-Rohrs an einem Ende der Dual-RN-Glaskupplung, indem Sie den RN-Mutternhalter festziehen. Die Mikropipette aus Glas bildet die Nadel und den Zylinder für das Injektionssystem.

Führen Sie die Glaspipette in das freie Ende der Doppel-RN-Glaskupplung ein. Ziehen Sie die RN-Mutter fest, um die Pipette zu fixieren. Erstellen Sie unter einem Präpariermikroskop eine Spitze mit dem entsprechenden Durchmesser, indem Sie eine gezogene Mikropipette schräg halten und die Spitze entlang der Glasbeschichtung eines Objektträgers reiben, um einen Bruch zu erzeugen.

Idealerweise sollte die abschließende Spitze leicht abgeschrägt sein. Als nächstes verwenden Sie ein Priming-Kit der Hamilton Syringe Company, das mit einer Spritze, einem Peak-Tubing-Linker, einem dualen RN-Glaskoppler und der Glasmikropipette mit Mineralöl gefüllt ist. Ersetzen Sie die Nadel mit dem hydraulischen Einspritzsystem durch eine Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel.

Platzieren Sie anschließend ein Gummiseptum über der Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel, um eine Abdichtung beim Einspritzen des Mineralöls zu gewährleisten. Führen Sie die Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel der Zündspritze in den hinteren Teil des Zylinders der 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze des Injektionssystems ein. Drücken Sie das Septum fest gegen das Ende der Spritze, um eine Versiegelung zu erzeugen.

Drücken Sie den Kolben langsam nieder und das Mineralöl fließt durch die Glaselemente des Einspritzsystems. Befüllen der Glaspipette. Schieben Sie das gesamte Öl durch das Einspritzsystem, um alle Luftblasen entlang des Trakts zu entfernen.

Wenn der Einfüllspritze das Mineralöl ausgeht, ziehen Sie die Nadel langsam zurück und geben Sie dabei ständig Öl ab. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, füllen Sie die Zündspritze nach und injizieren Sie erneut. Wenn das gesamte System mit Mineralöl gefüllt ist, setzen Sie den Originalkolben des 10-Mikroliter-Kolbens ein.

Die Hamilton-Spritze drückt den Kolben vollständig nieder, um zusätzliches Mineralöl aus dem System zu entfernen. Wischen Sie die Mikropipette aus Glas und das Ende der Spritze sauber. Bei 70% Ethanol ziehen Sie den Kolben bis zur Zwei-Mikroliter-Markierung auf dem Lauf zurück.

Das Ende der Mikropipette aus Glas füllt sich mit Luft und bildet eine Pufferzone zwischen dem Mineralöl und der zu injizierenden Flüssigkeit. Füllen Sie den Pipettenzylinder, indem Sie das Ende der Mikropipette in die gewünschte Lösung legen und den Kolben der Hamilton-Spritze herausziehen. Es werden nicht mehr als vier bis fünf Mikroliter Lösung in ein erwachsenes Rattenauge injiziert, um die intraokulare Injektion durchzuführen.

Beginnen Sie mit der Umschaltung des Gasflusses auf den Gasmaskenaufsatz für den stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie dann eine mit Fluor betäubte Ratte in den stereotaktischen Apparat ein. Verringern Sie die Fluorkonzentration auf 2% und überwachen Sie die Anästhesie.

Decken Sie das Tier mit einer OP-Decke ab. Um die Körpertemperatur während der gesamten Operation zu halten, öffnen Sie die Augenlider und geben Sie einen Tropfen Akan-Anästhesielösung. Auf der Oberfläche der Hornhaut werden zwei Personen injiziert, von denen eine die Glaspipette in die Glaskammer einführt und die Pipettenposition beibehält.

Und eine weitere, um den Kolben an der Spritze zu drücken, der die gewünschte Lösung liefert. Fassen Sie unter einem Operationsmikroskop die Glasmikropipette und den dualen RN-Glaskoppler, spreizen Sie die Augenlider in V-Form gegenüber der Injektionsstelle. Mit den Fingern hebt sich das Auge aus der Augenhöhle heraus. Führen Sie die Spitze der Glasmikropipette vorsichtig durch einen Bereich ohne Blutgefäße und in einem Winkel nach unten durch die Sklera.

Wenn die Pipette in die Sklera eindringt, ist ein kleines Knallen zu spüren. Die Person, die die Spritze hält, sollte nun vier Mikroliter Lösung injizieren, indem sie den Kolben auf die Zwei-Mikroliter-Markierung auf der Spritze drückt. Die Injektion sollte etwa ein bis zwei Sekunden dauern.

Die erfolgreich injizierte Lösung spült durch die Glaskammer, hält die Mikropipette etwa fünf Sekunden lang ruhig und zieht sich dann in die gleiche Richtung zurück. Beim Einführen der Nadel flattert die Bindehaut über die kleine Öffnung zurück und hilft, die Skleralpunktion abzudichten. Sobald die Operation abgeschlossen ist, schalten Sie das Fluor aus und lassen Sie das Tier einige Minuten lang Sauerstoff atmen. Decken Sie die Oberfläche der Hornhaut mit Augensalbe ab Um ein Austrocknen der Hornhaut während der Genesung zu verhindern, nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Gerät und bringen Sie es in den Auffangkäfig zurück.

Zur Manipulation von retinalen Ganglienzellen durch retrograden Transport nach Exotomie. Führen Sie zunächst eine Sehnervendurchtrennung gemäß den Anweisungen in dem Begleitvideo-Sehnerventransektionsprotokoll durch, 2, 2, 4, 1 Tracer-Medikamente. Plasmide, siRNAs oder virale Vektoren können auf den Sehnervenstumpf aufgebracht werden.

Es gibt zwei Hauptmethoden, um dieses Verfahren durchzuführen: Gelschaum oder direkte Injektion in den Sehnerv. Wenn die Gelschaummethode verwendet wird, stellen Sie sicher, dass die retinalen Ganglienzellen vormarkiert wurden, indem Sie eine Woche vor der Taxonomie retrograde Tracer in den Colliculus superior injizieren. Unmittelbar nach dem Durchtrennen des Sehnervs wird ein kleines, in der experimentellen Lösung getränktes Stück Gelschaum über den durchtrennten Sehnervenstumpf gelegt, der Orbitainhalt wird dann an die vorherige Stelle zurückgebracht.

Wenn das Auge wieder in eine neutrale Position gebracht wird, schieben Sie das Stück Gelschaum mit einer Pinzette in die Augenhöhle und stellen Sie sicher, dass es über dem Ende des Sehnervs bleibt. Die Injektionstechnik ist effektiver für die Abgabe von Substanzen, die Zugang zum Zytoplasma des Axons erhalten müssen, um durch den op-plasmatischen Fluss stark retrotransportiert zu werden. Eine gastenge 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze wird verwendet, um die gewünschte Lösung in den durchtrennten Sehnerv zu injizieren. Eine Nadel mit kurzer Fase ist wünschenswert.

Laden Sie die Spritze mit 10 Mikrolitern der zu injizierenden Lösung. Typischerweise greifen Irna-Plasmide oder virale Vektoren zur Injektion den Rand des Sehnervs mit einer Dumont-Pinzette mit feiner Spitze. Führen Sie das Ende der Nadel parallel zum Nerv in den Sehnerv ein.

Bis die Fase nicht mehr sichtbar ist, wird die eingeführte Nadel von allen Seiten vom Nerv umschlossen. Sobald die Nadel eingeführt ist, drücken Sie vorsichtig mit der Pinzette mit der feinen Spitze auf die Seiten des Nervs und injizieren Sie ein Viertel der Lösung, während Sie die Spritze drehen. Eine Vierteldrehung im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn.

Wiederholen Sie diese Schritte, bis eine vollständige Umdrehung der Nadel abgeschlossen ist und der gesamte Inhalt der Spritze injiziert wurde. Entfernen Sie die Spitze der Spritze vom Nerv. Lassen Sie die injizierte Flüssigkeit, die Rückfluss aus dem Nerv aufweist, in der Orbita, da dies einen zusätzlichen Pool für die Aufnahme durch die Enden der Axone bildet.

Bringen Sie den Orbitalinhalt wieder in seine ursprüngliche Position, schließen Sie die Wunde und lassen Sie das Tier sich erholen. Die Tiere sollten nach der Operation unabhängig voneinander untergebracht werden. Postoperative Analgetika sollten gemäß den Richtlinien Ihrer Tierpflege verabreicht werden.

Behörden und Tiere sollten nach der Operation sorgfältig überwacht werden. Wie in diesem Video gezeigt, kann RGC direkt angegriffen werden, indem Peptide, Medikamente, Vektoren, Plasmide oder siRNAs an den durchtrennten Sehnervenstumpf abgegeben werden. In diesem repräsentativen Beispiel wurde eine retrograde Fluor-Gold-Markierung durchgeführt und SI drei markierte Peptide wurden sofort in den Sehnerv injiziert.

Anschließend wurde eine Live-Bildgebung der Netzhaut durchgeführt, um zu verhindern, dass die Peptide während der Fixation aus dem Gewebe ausgewaschen werden, wie hier zu sehen ist, SI drei markierte Peptide, die in den Sehnerv injiziert wurden, retro wurden retro und stark zurück zum RGC-Somato in der Netzhaut transportiert. In diesem Beispiel wurden SI 3-markierte siRNAs in den Sehnervenstumpf injiziert. Unmittelbar nach der erneuten Ttaxotomie und Live-Bildgebung der Netzhaut waren SI 3-markierte siRNAs, die in den Sehnerv injiziert wurden, retrograd und wurden von RG CS transportiert, wie ihre Kolokalisation zeigt.

Mit retrograder Fluorgold-Markierung Einmal gemeistert, kann diese Technik in Sekundenschnelle durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Linse nicht beschädigt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Viruspartikeln äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer die institutionellen Richtlinien für die Arbeit mit biologischen Gefahren befolgt werden sollten.