Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies
8. Dezember 2010
Pluripotenten Stammzellen in Suspension wachsende Differenzierung in Embryoidkörpern (EBS). Hier zeigen wir, wie eine hohe Qualität EB Kryoschnitten nützlich für die Untersuchung zellulärer und molekularer Aspekte der Embryogenese zu erhalten, unter Wahrung ihrer Organisation als Aggregate.
Teil Eins, Einleitung. Hallo, mein Name ist Rafael. Ich bin Postdoktorand im Labor von Professor Stevens Hans an der Bundesuniversität von Rio de Janeiro in Brasilien.
Hallo, mein Name ist Ismail. Ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter und ebenfalls Professor. In diesem Video zeigen wir, wie man klare Schnitte von Android-Körpern herstellt.
Beginnen wir also. Teil zwei, Materialien und Geräte. Für dieses Verfahren benötigen wir ein Einbettungsmedium für gefrorene Proben.
4 % Paraformaldehydlösung zur Fixierung der Zellen, Saccharoselösungen zum Kryoschutz. Eine Nadel mit leicht gebogenem Ende, ein Stereomikroskop zur besseren Visualisierung des EBS und ein Schüttler. Teil drei.
Hier werden die menschlichen Embryokörper in nicht-anklebenden Kulturschalen kultiviert. Mithilfe einer Pipette werden alle Embryokörper so nah wie möglich beieinander gesammelt, um sie in ein 15-Milliliter-Konischglas zu überführen. Die EBs werden vorsichtig geerntet und in das Gefäß übertragen.
Es ist wichtig, alle EBS zu sammeln, da die Menge an Material gering ist. Nachdem die EBS abdekantiert wurden, wird das Kulturmedium vorsichtig entfernt. Sie sollten das Pellet am Boden des Röhrchens sehen können. Nun können wir mit der Fixierungsprozedur fortfahren.
EBS werden in einer 4 %igen Paraformaldehydlösung in PBS oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung fixiert. Es ist wichtig, das Pellet mit der PFA-Lösung erneut aufzuschwemmen. Anschließend werden die EBS 30 Minuten lang in der Fixierungslösung fixiert.
Nach der Fixierung wird die PFA-Lösung vorsichtig entfernt. Unter Vermeidung von Resus wird das EBS in PBS suspendiert und durch eine 10%ige Saccharoselösung in PBS ersetzt, um den Kryoschutz der EBS einzuleiten; das Material wird 30 Minuten in dieser Lösung belassen. Anschließend entfernen wir vorsichtig die 10%ige Saccharoselösung und resuspendieren die EBS in einer 20%igen Saccharoselösung.
Auch hier werden die EBS 30 Minuten lang in dieser Lösung aufbewahrt. Schließlich wird die 20%ige Saccharoselösung entfernt und durch eine 30%ige Saccharoselösung in PBS ersetzt, in der sie weitere 30 Minuten verbleiben. Nun kann mit der Orientierung und Einbettung der EBS fortgefahren werden.
In unserem Labor verwenden wir leere Kapselhülsen als Formen. Für die Blockierung der EBS ist es wichtig, die inneren Wände der Pipettenspitze vor dem Sammeln der EBS mit einer Saccharoslösung zu beschichten. Nun können wir die EBS vorsichtig sammeln und warten, bis sie sich am Boden der Spitze absetzen.
Anschließend werden die EBS in die Mitte des Blocks platziert. Dies sollte die endgültige Position der EBS innerhalb des Blocks sein. Mithilfe eines Stereomikroskops und einer feinen Spitze sammeln und entfernen wir so viel Saccharoselösung wie möglich.
Stets darauf achten, die EBS nicht einzusammeln. Mit einer Nadel, deren Spitze leicht gebogen ist, werden alle EBS in der Mitte des Blocks positioniert. Abschließend wird die restliche Saccharoselösung mit Filterpapierstücken aufgesammelt.
Die spezifische Position von EBS innerhalb des Blockes ist sehr wichtig, um Schnitte in guter Qualität zu erhalten. Hier sehen Sie ein Beispiel für eine ungünstige EB-Positionierung innerhalb der Hülle. Nach der Positionierung von EBS und dem Entfernen der Saccharoselösung wird die Hülle ausgehend von den Rändern mit OCT gefüllt, wobei stets darauf geachtet werden muss, Resus zur Aufschlämmung von EBS zu vermeiden.
Die verbleibenden Luftblasen werden mit einer Pipette entfernt, und die Hüllen werden 15 Minuten lang geschüttelt. Nach der Schüttelung wird der OCT-Block in Trockeneis eingefroren.
An diesem Punkt können Sie den in Aluminiumfolie eingewickelten Block entweder zur weiteren Analyse bei minus 80 Grad Celsius lagern oder mit Teil vier, dem Schneiden am Kryostat, fortfahren. Zum Anfertigen der Kryoschnitte benötigen Sie eine Einweg- oder Dauerschneide, OCT und mit Poly-L-Lysin behandelte Objektträger. Der OCT-Block wird aus dem Gefrierschrank entnommen und im Kryostat auf minus 20 Grad Celsius temperiert.
Der Block wird dann auf dem Ständer positioniert und parallel zur Schneide der Klinge ausgerichtet. EB-Proben sind viel kleiner als die meisten anderen Gewebeproben, weshalb es sehr wichtig ist, sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche des Blocks gleichzeitig die Klinge berührt, um Materialverluste zu minimieren. Nach der Positionierung wird der Block in 10-Mikrometer-Schnitte zerlegt, die direkt auf die Objektträger gesammelt werden.
Die Objektträger können entweder gelagert werden, vorzugsweise bei minus 70 Grad Celsius, oder am selben Tag verwendet werden. Das Material kann für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz gefärbt werden. Schlussfolgerung: Die hier beschriebene Methode bietet ein vernünftig preisgünstiges und leicht zu befolgendes Protokoll, um dünne Kryostatschnitte von Embryoidkörpern zu erhalten, die aus sowohl humanen H9- als auch aus murinen USP1-Stammzelllinien entwickelt wurden.
Die resultierenden Kryoschnitte können in einer Vielzahl von Verfahren zur Analyse der Proteinausprägung oder der EB-Morphologie verwendet werden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren zur Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte von embryonalen Körpern (EBs), die aus pluripotenten Stammzellen stammen, die in Suspension kultiviert wurden, demonstriert. Diese Kryoschnitte sind entscheidend, um die zellulären und molekularen Aspekte der Embryogenese zu untersuchen, während die Organisation der EBs erhalten bleibt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Embryogenese
- Zelluläre Differenzierung
Hintergrund
- Pluripotente Stammzellen können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren.
- Embryoidkörper sind Aggregate, die die frühe embryonale Entwicklung nachahmen.
- Die Untersuchung von Embryoidkörpern trägt zum Verständnis der Mechanismen der Embryogenese bei.
- Hochwertige Kryoschnitte sind entscheidend für eine detaillierte Analyse.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Herstellung von Kryoschnitten von embryonalen Körperchen bereitstellen.
- Die Untersuchung zellulärer und molekularer Prozesse während der Differenzierung erleichtern.
- Die strukturelle Organisation der embryonalen Körperchen während der Analyse bewahren.
Verwendete Methoden
- Herstellung von pluripotenten Stammzellen in Suspensionkultur.
- Induktion der Differenzierung zu embryonalen Körpern.
- Schneidetechniken für Kryoschnitte zur Gewinnung hochwertiger Proben.
- Analyse der zellulären und molekularen Eigenschaften von embryonalen Körpern.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung von Kryoschnitten aus embryonalen Körperchen (EBs).
- Erhaltung der Organisation der embryonalen Körperchen (EBs) in Kryoschnitten.
- Verbesserte Möglichkeit, die Embryogenese auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
- Die demonstrierte Methode kann auf verschiedene Forschungskontexte angewendet werden.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht eine detaillierte Analyse von EBs.
- Hochwertige Kryoschnitte sind wertvoll für embryonale Untersuchungen.
- Dieser Ansatz kann das Verständnis der Differenzierung von Stammzellen voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die hochwertige Kryoschnittechnik von aus pluripotenten Stammzellen gewonnenen Embryoidkörpern (EBs) ermöglicht eine präzise räumliche Analyse von Differenzierungsmarkern und der Gewebestruktur und unterstützt so die frühe Entdeckung sowie die Validierung von Zielstrukturen in der regenerativen Medizin und der Entwicklungsbiologie. Diese Fähigkeit erhöht das Vorhersagevertrauen in stammzellbasierten Modellen und leitet risikoadjustierte Entscheidungen an entscheidenden Wendepunkten der Entdeckungspipeline. Zuverlässige EB-Kryoschnitte erleichtern die integrative Datenanalyse über Fachbereiche hinweg zur Voranbringung von Forschungsportfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Expression von Pluripotenz- und linien-spezifischen Markern innerhalb dreidimensionaler EB-Strukturen.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Klärung der Differenzierungspfade und zellulären Heterogenität.
- Bietet einen räumlichen Kontext zur funktionellen Validierung von Zielstrukturen in aus Stammzellen abgeleiteten Systemen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung standardisierter Kryoschnitte von Embryoidkörpern für reproduzierbare Immunfluoreszenz- und In-situ-Hybridisierungsanalysen.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der Verteilung von Protein und RNA über die Schnitte von Embryoidkörpern hinweg.
- Unterstützt die Skalierbarkeit von Assays und die Wiederverwendung von Plattformen für die Wirkstoffscreening-Analysen in Stammzellmodellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Synchronisiert die in-vitro-Differenzierung mit in-vivo-Entwicklungsprozessen für krankheitsrelevante Modellierung.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die EB-Architektur und die Lokalisation von Markern erhalten bleibt.
- Liefert mechanistische Erkenntnisse, die translationsmedizinische Biomarkerstrategien informieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Kryoschnittmethode integriert sich in den Entdeckungsprozess von frühen Studien zur Stammzelldifferenzierung über die Assayentwicklung bis hin zur Validierung präklinischer Modelle.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Pluripotenz und Linienspezifizierung innerhalb von EBs.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte für die Markerexpression und Gewebeorganisation.
- Analytik: Ermöglicht ortsaufgelöste Messungen zur vergleichenden Analyse von Differenzierungsbedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit in-vivo-Entwicklungsrelevanz, sofern durch Expressionsmuster von Markern gestützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Arbeitsablauf für die EB-Analyse, der auf mehrere Stammzelllinien und Differenzierungsprotokolle anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Stammzelldifferenzierung und Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Embryoid-Schnittführung für reproduzierbare nachgeschaltete Analysen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem robuste räumliche und molekulare Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung stammzellbasierter Entdeckungsprogramme.
Durchführungsüberlegungen
- Setzt Fachkenntnisse in der Kryoschnittechnik und im Umgang mit empfindlichen dreidimensionalen Zellaggregaten voraus.
- Benötigt Zugang zu Kryostaten, Einbettmedien und bildgebender Infrastruktur für die nachgeschaltete Analyse.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung und dem Einschneiden von Embryoiden Körpern (EBs).
- Übertragbar auf verschiedene pluripotente Stammzelllinien und Differenzierungsmodelle, wobei auf Größe und Morphologie der EBs geachtet werden muss.
- Hängt von einer sorgfältigen Orientierung und Einbettung ab, um qualitativ hochwertige und aussagekräftige Schnitte zu gewährleisten.
