Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies

Erster Teil, Einführung. Hallo, mein Name ist Rafael. Ich bin Postdoc am Professor Stevens Hans Lab an der Federal University of Rio de Janeiro in Brasilien.

Hallo, mein Name ist Ismail. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin und Professorin. In diesem Video zeigen wir, wie Sie klare Abschnitte von Android-Körpern vorbereiten.

Also lasst uns loslegen. Zweiter Teil, Materialien und Ausrüstung. Für dieses Verfahren benötigen wir ein Einbettmedium für gefrorene Proben.

4% Paraform-Aldehydlösung zur Fixierung der Zellen, Saccharoselösungen zum Kryoschutz. Eine Nadel mit leicht gebogener Spitze, ein Stereomikroskop zur besseren Visualisierung des EBS und ein Shaker. Dritter Teil.

Hier werden die menschlichen Embryokörper in nicht haftenden Kulturplatten kultiviert. Mit einer Pipette gruppieren wir alle Embryokörper so nah wie möglich beieinander, um sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Die EBS werden schonend geerntet und in das Röhrchen überführt.

Es ist wichtig, alle EBS zu sammeln, da nicht viel Material vorhanden ist. Nach dem Dekantieren der EBS werden die Nährmedien sorgfältig entsorgt. Du solltest das Pellet am Boden des Rohrs sehen können. Nun können wir mit dem Fixierungsverfahren fortfahren.

EBS wird in 4%iger Paraform-Aldehydlösung in PBS oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung fixiert. Es ist wichtig, das Pellet mit PFA-Lösung zu resuspendieren. EBS werden dann für 30 Minuten in Fixierlösung fixiert.

Nach der Fixierung wird die PFA-Lösung vorsichtig entfernt. Unter Berücksichtigung der Vermeidung von Resus-Suspensionen durch EBS und durch eine 10%ige Saccharoselösung in PBS ersetzt, um den Kryoschutz des EBS einzuleiten, wird das Material 30 Minuten lang in dieser Lösung aufbewahrt. Als nächstes entfernen wir vorsichtig die 10%ige Saccharoselösung und resuspendieren das EBS in einer 20%igen Saccharoselösung.

Auch in dieser Lösung werden EBS 30 Minuten lang gehalten. Schließlich wird die 20%ige Saccharoselösung entfernt und durch eine 30%ige Saccharoselösung in PBS ersetzt, wo sie weitere 30 Minuten aufbewahrt wird. Nun können wir mit der Ausrichtung und Blockierung von ebs fortfahren.

In unserem Labor verwenden wir leere Kapselhüllen als Formen. Für die Blockierung von Ebs ist es wichtig, die Innenwände der Spitze mit Saccharoselösung zu beschichten, bevor das Ebs gesammelt wird. Jetzt können wir die EBS vorsichtig sammeln und warten, bis sie an den Boden der Spitze dekantieren.

Als nächstes werden die EBS in der Mitte des Blocks platziert. Dies sollte die endgültige Position von EBS innerhalb des Blocks sein. Mit Hilfe eines Stereomikroskops und einer feinen Spitze sammeln und entleeren wir so viel Saccharoselösung wie möglich.

Achten Sie immer darauf, dass Sie die Ebs nicht einsammeln. Mit einer Nadel mit leicht gebogener Spitze werden alle EBS in der Mitte des Blocks positioniert. Zum Schluss wird die restliche Saccharoselösung mit Filterpapierstücken aufgefangen.

Die spezifische Position von EBS innerhalb des Blocks ist sehr wichtig, um qualitativ hochwertige Scheiben zu erhalten. Hier ist ein Beispiel für eine schlechte EB-Positionierung innerhalb der Schale. Nach dem Positionieren des EBS und dem Entfernen der Saccharoselösung wird die Schale von den Rändern aus mit OCT gefüllt, wobei immer darauf geachtet wird, dass Resus das EBS nicht suspendiert.

Die restlichen Blasen werden mit einer Pipette entfernt und die Schalen 15 Minuten lang gerührt. Nach der Agitation. Der OCT-Block wird in Trockeneis eingefroren.

Zu diesem Zeitpunkt können Sie den Block entweder in Aluminiumfolie eingewickelt bei minus 80 Grad Celsius für die weitere Analyse lagern oder mit dem Kryostaten Teil vier, Schneiden, fortfahren. Für die Herstellung der Kryo-Schnitte benötigen Sie eine Einweg- oder Dauerklinge, OCT und mit Poly-L-Lysin vorbehandelte Objektträger. Der OCT-Block wird aus dem Gefrierschrank genommen und bis zu einer Temperatur von minus 20 Grad Celsius im Kryostaten aufbewahrt.

Der Block wird dann auf dem Ständer positioniert und parallel zur Kante der Klinge ausgerichtet. EB-Proben sind viel kleiner als die meisten anderen Gewebeproben, daher ist es sehr wichtig, sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche des Blocks gleichzeitig die Klinge berührt, wodurch der Materialverlust minimiert wird. Nach dem Positionieren wird der Block in 10-Mikrometer-Scheiben geschnitten, die direkt auf den Objektträgern gesammelt werden.

Die Objektträger können entweder gelagert werden, vorzugsweise bei minus 70 Grad Celsius, oder auch am selben Tag verwendet werden. Das Material kann immunhistochemisch oder immunfluoresziert gefärbt werden. Schlussfolgerung. Das hierin beschriebene Verfahren stellt ein relativ kostengünstiges und leicht zu befolgendes Protokoll zur Gewinnung dünner Kryostatenschnitte von Embryokörpern bereit, die sowohl aus menschlichen H neun als auch aus Maus US P 1 Stammzelllinien entwickelt wurden.

Die dabei entstehenden Kryoschnitte können in einer Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden, um die Proteinexpression oder EB-Morphologie zu analysieren.