JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 1:37 Min. • August 7th, 2025
Beginnen Sie mit einer primären Mittelhirnkultur aus Rattenembryonen, die dopaminerge Neuronen enthält, die mutiertes Alpha-Synuclein überexprimieren.
Ersetzen Sie das Medium in den Behandlungsvertiefungen durch frische Medien, die die Prüfsubstanz enthalten, und das Medium in den Kontrollwells durch glatte Medien. Dann inkubieren.
In der Kontrolle bildet Alpha-Synuclein toxische Aggregate in dopaminergen Neuronen, die eine Neuritenretraktion und den Tod der Neuronen verursachen.
Bei der Behandlung interagiert die Testverbindung mit Alpha-Synuclein, verhindert dessen Aggregation, bewahrt die Neuritenstruktur und bietet Neuroprotektion.
Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen und blockieren Sie dann unspezifische Bindungsstellen.
Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, um alle Neuronen zu markieren, mit zusätzlicher Markierung für dopaminerge Neuronen.
Waschen Sie die Zellen und fügen Sie Fluorophor-markierte Sekundärantikörper hinzu, die spezifisch für die Primärantikörper sind.
Zählen Sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop die differentiell markierten dopaminergen Neuronen und wechseln Sie dann zu einem konfokalen Mikroskop, um die Neuritenlänge zu messen.
Eine höhere Anzahl von dopaminergen Neuronen mit intakten Neuriten in der Behandlung im Vergleich zu den Kontrollen bestätigt das neuroprotektive Potenzial des Testpräparats.