Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

Das übergeordnete Ziel der folgenden Methode ist es, das Verhalten einzelner Zellen aus verschiedenen Hefestämmen unter denselben dynamischen Bedingungen abzubilden. Dies wird durch die Herstellung eines zweischichtigen mikrofluidischen Geräts erreicht, oder die untere Schicht enthält jeden der verschiedenen Stämme separat, und die obere Schicht liefert in einem zweiten Schritt die dynamischen Strömungsbedingungen. Verschiedene Hefestämme werden in die Vertiefungen gegeben und das Gerät wird geschlossen, wodurch ein einziger Kanal mit mehreren getrennten Stämmen entsteht.

Als nächstes bilden wir die Zellreaktionen auf dynamische Medienänderungen ab. Durch die Kontrolle der Flussraten in den beiden Eingängen des Y-Kanals zeigen die Ergebnisse unterschiedliche Stämme, die den gleichen dynamischen Bedingungen ausgesetzt sind, und keine Kreuzkontamination zwischen den Wells. Dieses mikrofluidische Gerät hat mehrere entscheidende Vorteile gegenüber anderen bestehenden Systemen. Es ermöglicht die Abbildung mehrerer unterschiedlicher Stämme unter denselben dynamischen Bedingungen.

Wichtig ist auch, dass es in jedem Labor problemlos hergestellt werden kann, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Die Methode dieser Methode entstand aus der Diskussion darüber, wie man die Reaktionen verschiedener Isolate aus dem wilden Osten auf Hungerpässe verfolgen kann. Starten, zeichnen oder drucken Sie das gewünschte Mikrokanal-Layout maßstabsgetreu aus.

Decken Sie als Nächstes einen Glasdia mit Tesafilm ab. Um die gewünschte Höhe des Kanals zu erreichen, platzieren Sie das Layout-Design auf einer ebenen Fläche und richten Sie das Dia über dem Designmuster aus. Schneiden Sie nun das Klebeband auf dem Objektträger vorsichtig entsprechend dem Layout ab. Entfernen Sie das Klebeband von allen Bereichen des Objektträgers.

Akzeptieren Sie diese im Layout des Mikrokanals. Legen Sie die Rutsche für drei Minuten in einen 65 Grad Celsius heißen Backofen. Anschließend sanft mit Ethanol reinigen.

Mischen Sie die Basis- und die Aushärtungskomponente von PDMS wie vom Hersteller empfohlen. Gießen Sie etwa 30 Milliliter PDMS-Mischung in eine Petrischale bis zu einer Höhe von etwa 0,5 Zentimetern. Entgasen Sie das PDMS bei Bedarf im Vakuum.

Tauchen Sie den Objektträger mit dem gemusterten Klebeband nach oben in das PDMS ein. Das Platzieren des Musters nach dem PDMS verhindert die Bildung von Luftblasen zwischen Objektträger und Schale. Der Boden härtet 48 Stunden lang bei 65 Grad Celsius aus und stellt sicher, dass die Schale horizontal steht, indem eine Wasserwaage in einer neuen 90-Millimeter-Petrischalen verwendet wird. Gießen Sie drei Milliliter PDMS-Mischung ein.

Dieser Schritt kann auf einem Spin-Coder ausgeführt werden, falls verfügbar. DGAs und Heilung wie zuvor gezeigt. Schneiden Sie nun die Fließschicht des mikrofluidischen Gerätes mit einem Biopsie-Puncher vorsichtig auf die gewünschte Größe aus.

Erstellen Sie Löcher für die Ein- und Auslässe in der Fließschicht. Schneiden Sie ebenfalls eine ähnlich große Vertiefungsschicht aus der zweiten Petrischale aus und legen Sie sie auf ein dickes Glas. Schieben Sie den Mauszeiger über das Design-Layout.

Stanzen Sie dann die Vertiefungen in Übereinstimmung mit den Mikrokanälen auf dem Layout mit Ethanol aus, reinigen Sie beide PDMS-Schichten und einen Glasdeckglas und trocknen Sie es an der Luft. Behandeln Sie anschließend das Deckglas und die PDMS der Vertiefungsschicht entweder mit einem Standard-Plasmaätzer für die nicht reversible Verklebung oder mit einem tragbaren Koronabehandler für die reversible Verklebung. Legen Sie die Vertiefungsschicht vorsichtig auf den Deckglas, um eine Haftung zu gewährleisten.

Reiben Sie sanft alle Luftblasen aus. Bereiten Sie das gewünschte Medium in geeigneten Spritzen vor und schließen Sie es an einen Tigon-Schlauch an, der durch eine Spritzenpumpe gefädelt wird. Für die Zellbildgebung.

Stärken nutzen. Gehen Sie in die gewünschte Phase, wirbeln Sie die Kultur gründlich vor und geben Sie 300 Mikroliter in Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie vorsichtig einen Mikroliter con canna A in jede Vertiefung der PDMS-Well-Schicht.

Waschen Sie überschüssige Conna A zweimal aus jeder Vertiefung aus, indem Sie vorsichtig Wasser pipettieren, während die Conna in A trocknet. Waschen Sie die Stämme zweimal mit 300 Mikrolitern SC-Medium ohne Glukose. Das Waschen von Restglukose aus den Zellwänden hilft bei der ordnungsgemäßen Einhaltung des Konvals.

In einem After Vortexing pipettieren die Zellen etwa 0,5 Mikroliter der Zellsuspension gründlich in einzelne Wells. Restzellen mit Schmiermedium sanft auswaschen. Die nächsten beiden Schritte müssen schnell durchgeführt werden, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.

Behandeln Sie als optionalen Schritt Plasma den Chip und die Wells und achten Sie darauf, die Wells nicht direkt zu treffen. Platzieren Sie dann den Chip vorsichtig unter einem Stereoskop auf den Vertiefungen und achten Sie dabei genau auf die Ausrichtung zwischen den beiden. Drücken Sie vorsichtig, um die beiden PDMS-Schichten zu verkleben.

Füllen Sie das Gerät langsam vollständig mit etwa 50 Mikrolitern Schmiermedium und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen im Kanal zurückbleiben. Schließen Sie nun das Gerät an, indem Sie die Schläuche in die entsprechenden Einlässe einführen und den Medienfluss starten. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen in den Schläuchen bilden, da diese im Gerät stecken bleiben und die Strömung stören können.

Legen Sie das Gerät unter ein Mikroskop und suchen Sie in jedem der geeigneten Bildpunkte. Nun, halten Sie die Zellen eine Stunde lang oder bei Bedarf länger unter fettem, mittlerem Fluss. Um die Wiederherstellung zu ermöglichen.

Starten Sie das Experiment mit der Einstellung für konstanten Durchfluss. Pumpe A auf 0,8 Milliliter pro Stunde und Pumpe B auf 0,2 Milliliter pro Stunde. Für Medium fließt mehr als 80% der Breite der Rinne.

Wir können die Bedingungen im Gerät dynamisch ändern, indem wir die relativen Durchflussraten ändern. Die neuen Bedingungen stabilisieren sich innerhalb von Sekunden entlang des gesamten Kanals, um die Trennung zwischen verschiedenen Stämmen zu demonstrieren. Zwei unterscheidbare Hefestämme werden in abwechselnden Vertiefungen abgebildet.

Beachten Sie, dass es in diesem Experiment keine Zellleckagen zwischen den Vertiefungen gibt. Beide Stämme haben den Transkriptionsfaktor MSN two, der mit YFP markiert ist, um die gleichzeitige Wirkung dynamisch ändernder Bedingungen zu testen. Die Durchflussraten in den beiden Eingangskanälen wurden geändert, um einen Schritt ohne Glukosemedium zu schaffen.

Dies führte zu einer Lokalisierung von MSN zwei im Zellkern. Wichtig ist, dass die Zeitspur von nukleärer MSN zwei YFP-Niveaus in einzelnen Zellen analysiert werden kann. So kann das mikrofluidische PDMS-Gerät für die Anwendung gleichzeitiger dynamischer Bedingungen auf mehrere Vertiefungen verwendet werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Zellen während des Zusammenbaus des Geräts nicht austrocknen. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie problemlos durchgeführt werden, ohne dass eine weiche Lithographie erforderlich ist.